大腸桿菌對(duì)恩諾沙星耐藥性研究

1、大腸桿菌對(duì)恩諾沙星耐藥性研究    英文題名 Studies on Persistence of E.coli to Enrofloxacin  關(guān)鍵詞 大腸桿菌; 耐藥性; 抗藥性; 外排泵; SOS應(yīng)答; 英文關(guān)鍵詞 Escherichia coli; persistence; resistance; SOS reaction mechanism; efflux pump; 中文摘要 細(xì)菌對(duì)抗菌藥物產(chǎn)生抗藥性是獸醫(yī)臨床的常見(jiàn)現(xiàn)象,檢測(cè)臨床分離細(xì)菌的抗藥性可及時(shí)掌握細(xì)菌的抗藥趨勢(shì),研究細(xì)菌抗藥機(jī)制可以為新藥物的開(kāi)發(fā)及合理用藥提供理論支持。 本

2、文檢測(cè)了山東地區(qū)大腸桿菌藥敏情況并改進(jìn)了藥敏試驗(yàn)方法,建立了測(cè)定MPC的坡面平板法,研究了大腸桿菌對(duì)恩諾沙星的耐藥機(jī)制。 利用96點(diǎn)陣藥敏檢測(cè)盒檢測(cè)山東地區(qū)禽源和豬源大腸桿菌的抗藥性結(jié)果顯示：大腸桿菌呈現(xiàn)嚴(yán)重的多重抗藥性,多抗耐藥率超過(guò)90%,禽源性大腸桿菌抗藥性明顯高于豬源性大腸桿菌。 建立了坡面平板法,結(jié)果顯示坡面平板上的藥物濃度呈良好的梯度分布,可以把對(duì)藥物敏感性不同的細(xì)菌區(qū)分開(kāi)。研究坡面平板上大腸桿菌的性質(zhì),發(fā)現(xiàn)高濃度藥物下生長(zhǎng)大腸桿菌發(fā)生了基因突變,而低濃度藥物下生長(zhǎng)的沒(méi)有發(fā)生基因突變。 利用基因芯片和實(shí)時(shí)熒光定量PCR研究恩諾沙星對(duì)大腸桿菌全基因表達(dá)譜的影響,結(jié)果顯示：(1)恩諾沙

3、星作用5h后,大腸桿菌519個(gè)基因出現(xiàn)表達(dá)差異,外排泵基因表達(dá)水平提高,外膜蛋白基因表達(dá)量急劇減少,恩諾沙星的靶酶parC基因表達(dá)量增加。說(shuō)明細(xì)菌生理機(jī)制發(fā)生了廣泛而復(fù)雜的變化。(2)處理菌株的恩諾沙星靶酶沒(méi)有基因突變,提示低水平的細(xì). 英文摘要 Resistance to antibiotic is inevitable for bacterium, we can know the resistance tendency of bacterium in time by testing drug sensitivity of pathogenic from clinical, it can&#

4、160; 摘要 4-5 Abstract 5 第一部分 文獻(xiàn)綜述 11-23     1 大腸桿菌耐藥性現(xiàn)狀 11-13     2 細(xì)菌耐藥性機(jī)理研究進(jìn)展 13-16         2.1 抗菌藥物作用靶位改變 13-14         2.2 產(chǎn)生滅活酶 14         2.3 改變細(xì)菌外膜通透性 14-15 &#

5、160;       2.4 影響主動(dòng)外排系統(tǒng) 15         2.5 形成細(xì)菌生物膜 15-16         2.6 細(xì)菌形態(tài)的變化 16     3 防突變濃度與突變選擇窗理論 16-18         3.1 MPC定義 16-18     

6、    3.2 MSW與MIC理論的區(qū)別 18     4 外排泵抑制劑 18-21         4.1 干擾外排泵組裝的外排泵抑制劑 19         4.2 阻斷外排泵能量來(lái)源的外排泵抑制劑 19-20         4.3 阻礙底物通過(guò)外排泵通道的外排泵抑制劑 20     

7、;    4.4 機(jī)制未知的外排泵抑制劑 20-21     5 研究目的和意義 21-23 第二部分 大腸桿菌的藥敏試驗(yàn) 23-34     試驗(yàn)一 山東地區(qū)動(dòng)物源大腸桿菌藥敏檢測(cè) 24-30         1 材料與方法 24-26             1.1 試驗(yàn)材料 24-25    

8、         1.2 大腸桿菌的分離鑒定 25             1.3 藥敏試驗(yàn) 25-26         2 結(jié)果與分析 26-28             2.1 禽源大腸桿菌藥敏檢測(cè)結(jié)果 26-27  

9、;           2.2 豬源大腸桿菌藥敏結(jié)果 27-28         3 討論 28-29         4 小結(jié) 29-30     試驗(yàn)二 吸管藥敏檢測(cè)盒的研制 30-34         1 材料與方法 30-32   

10、          1.1 材料 30             1.2 制備檢測(cè)盒 30-31             1.3 檢測(cè)盒的使用 31-32             1

11、.4 檢測(cè)盒效果驗(yàn)證 32         2 結(jié)果與分析 32-33         3 討論 33         4 小結(jié) 33-34 第三部分 大腸桿菌對(duì)恩諾沙星耐藥機(jī)理研究 34-71     試驗(yàn)一 坡面平板法的建立 35-43         1 材料與方法 35-37 &#

12、160;           1.1 材料 35             1.2 制定標(biāo)準(zhǔn)曲線 35-36             1.3 配制瓊脂塊 36           &

13、#160; 1.4 配制坡面平板 36             1.5 坡面平板各位置濃度分布與時(shí)間的關(guān)系 36             1.6 測(cè)定擴(kuò)散濃度與配制濃度之間的關(guān)系 36-37             1.7 測(cè)定瓊脂塊中藥物回收率 37  &#

14、160;          1.8 坡面平板驗(yàn)證 37         2 結(jié)果與分析 37-41             2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 37             2.2 坡面平板表面藥物濃度 37-39

15、60;           2.3 不同配制濃度坡面平板表面藥物濃度 39-41             2.4 瓊脂中藥物回收率 41             2.5 坡面平板使用效果 41        

16、3 討論 41-42         4 小結(jié) 42-43     試驗(yàn)二 坡面平板上大腸桿菌性質(zhì)的研究 43-47         1 材料與方法 43-44             1.1 試驗(yàn)材料 43          &

17、#160;  1.2 配制坡面平板 43             1.3 細(xì)菌處理 43             1.4 擴(kuò)增喹諾酮耐藥決定區(qū) 43-44         2 結(jié)果與分析 44-46         3 討論 46

18、         4 小結(jié) 46-47     試驗(yàn)三 恩諾沙星對(duì)大腸桿菌基因組表達(dá)譜的影響 47-60         1 材料與方法 47-50             1.1 供試菌種 47           &

19、#160; 1.2 表達(dá)譜基因芯片 47             1.3 主要試劑與儀器 47-48             1.4 大腸桿菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定與形態(tài)觀察 48             1.5 細(xì)菌總RNA提取 48    &#

20、160;        1.6 樣品RNA標(biāo)記 48             1.7 雜交與清洗 48-49             1.8 芯片掃描與圖像采集 49             1.9

21、基因突變分析 49-50             1.10 數(shù)據(jù)分析 50         2 結(jié)果 50-56             2.1 大腸桿菌生長(zhǎng)狀態(tài) 50-51            

22、2.2 總RNA電泳鑒定 51-52             2.3 表達(dá)譜基因芯片雜交與圖像采集 52             2.4 差異基因篩選 52-56             2.5 基因序列比對(duì)結(jié)果 56     &

23、#160;   3 討論 56-59             3.1 基因譜表達(dá) 56-59             3.2 基因序列比對(duì) 59         4 小結(jié) 59-60     試驗(yàn)四 熒光定量測(cè)定大腸桿菌基因表達(dá)量 60-66  &#

24、160;      1 材料與方法 60-62             1.1 試驗(yàn)儀器 60-61             1.2 細(xì)菌處理 61             1.3 提取供試大腸桿菌總RNA 61

25、60;           1.4 熒光定量PCR 61-62             1.5 結(jié)果處理 62         2 結(jié)果與分析 62-64             2.1 擴(kuò)增曲線 62-63

26、            2.2 熔解曲線 63             2.3 基因數(shù)量 63-64         3 討論 64-65         4 小結(jié) 65-66     試驗(yàn)五 外排泵與耐藥性的

27、關(guān)系 66-71         1 材料與方法 66-68             1.1 供試菌株 66             1.2 試驗(yàn)器材 66-67             1.3 試劑

28、配制 67             1.4 測(cè)定菌體內(nèi)恩諾沙星達(dá)到穩(wěn)態(tài)的時(shí)間 67             1.5 外排泵檢測(cè) 67-68         2 試驗(yàn)結(jié)果 68-69           

29、0; 2.1 菌體內(nèi)藥物達(dá)到穩(wěn)態(tài)所需時(shí)間 68             2.2 細(xì)菌外排泵檢測(cè)結(jié)果 68-69         3 討論 69-70         4 小結(jié) 70-71 結(jié)論 71-72 參考文獻(xiàn) 72-82           &

30、#160; 1.2 試驗(yàn)器材 66-67             1.3 試劑配制 67             1.4 測(cè)定菌體內(nèi)恩諾沙星達(dá)到穩(wěn)態(tài)的時(shí)間 67             1.5 外排泵檢測(cè) 67-68     &#

31、160;   2 試驗(yàn)結(jié)果 68-69             2.1 菌體內(nèi)藥物達(dá)到穩(wěn)態(tài)所需時(shí)間 68             2.2 細(xì)菌外排泵檢測(cè)結(jié)果 68-69         3 討論 69-70        

32、; 4 小結(jié) 70-71 結(jié)論 71-72 參考文獻(xiàn) 72-82             1.2 試驗(yàn)器材 66-67             1.3 試劑配制 67             1.4 測(cè)定菌體內(nèi)恩諾沙星達(dá)到穩(wěn)態(tài)的時(shí)間 67   

33、60;         1.5 外排泵檢測(cè) 67-68         2 試驗(yàn)結(jié)果 68-69             2.1 菌體內(nèi)藥物達(dá)到穩(wěn)態(tài)所需時(shí)間 68             2.2 細(xì)菌外排泵檢測(cè)結(jié)果 68-69 &

34、#160;       3 討論 69-70         4 小結(jié) 70-71 結(jié)論 71-72 參考文獻(xiàn) 72-82             1.2 試驗(yàn)器材 66-67             1.3 試劑配制 67   

35、          1.4 測(cè)定菌體內(nèi)恩諾沙星達(dá)到穩(wěn)態(tài)的時(shí)間 67             1.5 外排泵檢測(cè) 67-68         2 試驗(yàn)結(jié)果 68-69             2.1 菌體內(nèi)藥物達(dá)到穩(wěn)態(tài)所需

36、時(shí)間 68             2.2 細(xì)菌外排泵檢測(cè)結(jié)果 68-69         3 討論 69-70         4 小結(jié) 70-71 結(jié)論 71-72 參考文獻(xiàn) 72-82             1.2 試驗(yàn)器材 66-

37、67             1.3 試劑配制 67             1.4 測(cè)定菌體內(nèi)恩諾沙星達(dá)到穩(wěn)態(tài)的時(shí)間 67             1.5 外排泵檢測(cè) 67-68         2

38、 試驗(yàn)結(jié)果 68-69             2.1 菌體內(nèi)藥物達(dá)到穩(wěn)態(tài)所需時(shí)間 68             2.2 細(xì)菌外排泵檢測(cè)結(jié)果 68-69         3 討論 69-70         4 小結(jié) 70-71 結(jié)論 71-72 參考文獻(xiàn) 72-82             1.2 試驗(yàn)器材 66-67     &#