具有陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥表型的B淋巴細(xì)胞株的建立

1、    具有陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥表型的 B淋巴細(xì)胞株的建立        【摘要】目的 建立陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥（PNH）和正常人的B細(xì)胞株，用以研究PNH。方法 用EB病毒感染PNH患者和正常人的B淋巴細(xì)胞，感染后的B淋巴細(xì)胞用流式細(xì)胞儀分析其細(xì)胞表型，然后用免疫磁珠分選CD55-、CD59- B淋巴細(xì)胞，并用極限稀釋法對(duì)分選后的細(xì)胞進(jìn)行克隆，克隆后的細(xì)胞株用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)擴(kuò)增免疫球蛋白重鏈可變區(qū)基因重排帶，驗(yàn)證其克隆性。結(jié)果建立了2株分別來(lái)自于2例PN

2、H患者的CD55-、CD59-B細(xì)胞株；作為對(duì)照，同時(shí)建立了2株分別來(lái)自于2名正常人的B細(xì)胞株。結(jié)論可用EB病毒感染B細(xì)胞來(lái)建立PNH患者的B細(xì)胞株?！娟P(guān)鍵詞】血紅蛋白尿，陣發(fā)性；細(xì)胞系；淋巴細(xì)胞；皰疹病毒4型，人 Establishment and identification of B cell lines with PNH phenotypeLI Ke, SHAO Zonghong, Tatsuya Kawaguchi, et al.Institute of Hematology and Blood Diseases Hospital, CAMS and PUMC, Tianjin300

3、020，China【Abstract】ObjectiveTo establish B cell lines from patients with paroxysmal nocturnal haemoglobinuria(PNH) and normal controls. MethodsB lymphoid cells prepared from PNH patients and normal controls were infected with EB virus. Phenotype of the immortal cells was analyzed by flow cytometry.

4、The immunomagnetic beads were used to select CD55- and CD59- B lymphoid cells, which were cloned by limiting dilution. The clonality of the cloned cells was confirmed by testing the pattern of Ig rearrangements using polymerase chain reaction (PCR). ResultsFrom 2 PNH patients and 2 normal controls,

5、CD55- and CD59- B lymphoblastoid cell lines were established which had PNH phenotype and normal phenotype, respectively. ConclusionB lymphoid cell lines from PNH patients can be obtained by EB virus infection.【Key words】Haemoglobinuria, paroxysmal；Cell line；Lymphocytes;Herpesvirus 4,human陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿

6、癥（PNH）是一種獲得性造血干細(xì)胞克隆性疾病。臨床主要表現(xiàn)為溶血、易感染、栓塞和骨髓造血功能低下。目前溶血的發(fā)生機(jī)制已基本明了，PNH紅細(xì)胞膜上糖化肌醇磷脂（GPI）錨合成缺陷，導(dǎo)致膜上GPI錨定蛋白缺乏，其中包括衰變加速因子(DAF,CD55）和反應(yīng)性溶血膜抑制物(MIRL，CD59）等，從而引起補(bǔ)體介導(dǎo)的溶血。位于X染色體上的PIG-A基因異常則是引起上述異常的根本原因1。已知，CD55、CD59不僅在PNH患者粒細(xì)胞和紅細(xì)胞膜上缺乏，而且也在T和B淋巴細(xì)胞上缺乏，提示PNH是一干細(xì)胞疾病2。淋巴細(xì)胞有可能在PNH發(fā)病，特別是PNH克隆異常增生中起重要作用。然而，在研究其作用時(shí)，常常由于不

7、能得到足夠數(shù)量的淋巴細(xì)胞而影響研究的進(jìn)行。為此，我們建立了兩株P(guān)NH CD55-、CD59-的EB病毒轉(zhuǎn)化的B淋巴細(xì)胞，作為對(duì)照，我們同時(shí)建立了兩株正常人B淋巴細(xì)胞。材料和方法1患者及其淋巴細(xì)胞的分離分離了8例PNH患者和3名正常人的淋巴細(xì)胞用于B細(xì)胞株的建立。PNH的診斷依據(jù)臨床表現(xiàn)、Ham試驗(yàn)陽(yáng)性和CD55-、CD59-細(xì)胞檢測(cè)的結(jié)果。淋巴細(xì)胞分離采用密度梯度離心法。2EB病毒的制備產(chǎn)生EB病毒的細(xì)胞株B95-8由日本熊本大學(xué)Horikawa博士惠贈(zèng)，在含體積分?jǐn)?shù)為10%的小牛血清(FCS)和100mg/L氨芐青霉素的RPMI 1640（Gibco公司）培養(yǎng)基中培養(yǎng)57d后，1500r/m

8、in離心，上清液即含高滴度的EB病毒。3EB病毒的轉(zhuǎn)化 參照文獻(xiàn)3，淋巴細(xì)胞與上述方法制備的EB病毒在1ml含體積分?jǐn)?shù)為7%的FCS和2mg/L環(huán)孢菌素A（CsA）的RPMI 1640培養(yǎng)基中，在體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2及37條件下孵育2h，離心后棄上清，加入1ml含體積分?jǐn)?shù)為20%的FCS和2mg/L CsA的RPMI 1640培養(yǎng)基，在體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2及37條件下孵育，每3d進(jìn)行半量換液，培養(yǎng)1個(gè)月后將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞轉(zhuǎn)入24孔培養(yǎng)板繼續(xù)培養(yǎng)，定期進(jìn)行半量換液。如3個(gè)月后，細(xì)胞生長(zhǎng)良好即可進(jìn)行表型鑒定和克隆篩選。4極限稀釋法克隆篩選取8×104細(xì)胞，用含體積分?jǐn)?shù)為20%的FCS的

9、RPMI 1640培養(yǎng)液按對(duì)數(shù)級(jí)稀釋5次，取100l最終稀釋液于96孔培養(yǎng)板，在體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2及37條件下培養(yǎng)，每3d進(jìn)行半量換液。生長(zhǎng)良好的克隆轉(zhuǎn)入24孔板繼續(xù)培養(yǎng)，并進(jìn)行表型鑒定。5流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞表型方法參照文獻(xiàn)4。所采用的單克隆抗體為：CD2（T細(xì)胞標(biāo)志，BD 公司），CD20（B細(xì)胞標(biāo)志，BD公司），CD55和CD59（日本東京大學(xué)Towita博士惠贈(zèng)）。分設(shè)對(duì)照管和試驗(yàn)管，每管加入105細(xì)胞，PBS洗滌2次，試驗(yàn)管加入上述抗體10l，在4下孵育30min后再加入兔抗鼠FITC-IgG，4下孵育20min,對(duì)照管不加上述抗體，只加兔抗鼠FITC-IgG。PBS洗滌2次后，加

10、入1ml PBS，混勻待測(cè)。采用流式細(xì)胞儀（FACScan, BD 公司）測(cè)定細(xì)胞表型。6克隆性鑒定方法參照文獻(xiàn)5，DNA提取采用常規(guī)酚-氯仿法。引物序列：順義鏈引物F3A:5-ACACGGCTCTGTATTACTGT-3,反義鏈引物L(fēng)JH:5-TGAGGAGACGGTGACC-3。聚合酶鏈反應(yīng)體積為50l，反應(yīng)體系含10mol/L引物各2l，模板DNA 1g，Taq酶2U，1.5mmol/LMgCl2；反應(yīng)條件為94 2min，58 45s，72 105s,共30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)產(chǎn)物用25g/L瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，紫外照相。陽(yáng)性對(duì)照采用B-急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系KHM2B。結(jié) 果8例

11、PNH患者的外周血CD55-、CD59-淋巴細(xì)胞所占百分率為21.5%90.5%。其中只有6例患者淋巴細(xì)胞經(jīng)EB病毒感染后可獲得不死性生長(zhǎng)。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示6例中的4例患者不死性生長(zhǎng)細(xì)胞幾乎全部為CD55+、CD59+細(xì)胞，另2例患者不死性生長(zhǎng)細(xì)胞中CD55-、CD59-淋巴細(xì)胞占32.6%和55.4%。后者經(jīng)用免疫磁珠分選，90%以上的細(xì)胞表型為CD55-、CD59-。分選后的細(xì)胞用于細(xì)胞克隆。3名正常人B淋巴細(xì)胞經(jīng)EB病毒感染后2名的細(xì)胞可獲得不死性生長(zhǎng)。EB病毒轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞經(jīng)反復(fù)凍存后復(fù)蘇均能良好生長(zhǎng)，觀察時(shí)間已超過(guò)半年。細(xì)胞生長(zhǎng)不依賴(lài)于生長(zhǎng)因子。經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)分析法分析顯示不死性生長(zhǎng)細(xì)

12、胞的表型為CD2-和CD20+，為B淋巴細(xì)胞。采用極限稀釋法對(duì)2例PNH患者和2名正常人經(jīng)EB病毒轉(zhuǎn)化后的B淋巴細(xì)胞進(jìn)行了細(xì)胞克隆。分別選取6個(gè)克隆，用聚合酶鏈反應(yīng)方法擴(kuò)增其免疫球蛋白重鏈基因VDJ重排區(qū)，進(jìn)行克隆性驗(yàn)證。結(jié)果顯示，所有被檢克隆均只有一條重排帶（1），提示為單克隆性造血。同時(shí)對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞表型分析，結(jié)果顯示，來(lái)自于PNH患者的所有克隆表面標(biāo)志為CD2-、CD20+、CD55-、CD59-；來(lái)自于正常人的所有克隆表面標(biāo)志為CD2-、CD20+、CD55+、CD59+。分別選取一個(gè)生長(zhǎng)較好的克隆持續(xù)培養(yǎng)，用作不死性細(xì)胞株。     1，2：PN

13、H細(xì)胞系；3，4：正常對(duì)照B細(xì)胞系；5：陽(yáng)性對(duì)照（B-ALL細(xì)胞系KHM2B）；M為分子量標(biāo)準(zhǔn)1細(xì)胞系克隆PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果討 論EB病毒由172kb的dsDNA組成，可表達(dá)近100種病毒蛋白，其中6種核蛋白具有啟動(dòng)和維持B淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)的功能，它們是EBNA-1,2,3a,3b,3c和LP。EB病毒通過(guò)結(jié)合B淋巴細(xì)胞表面上的EB病毒受體而感染B淋巴細(xì)胞，導(dǎo)致B淋巴細(xì)胞的不死性生長(zhǎng)6。通常情況下，只有B淋巴細(xì)胞能受到感染，但少數(shù)情況下，T淋巴細(xì)胞也可被感染，因而對(duì)EB病毒感染后的細(xì)胞一定要進(jìn)行淋巴細(xì)胞亞群鑒定。我們對(duì)8例PNH患者淋巴細(xì)胞進(jìn)行了與EB病毒的共培養(yǎng)，結(jié)果只能從2例PNH患者中獲得不

14、死性CD55-、CD59-B淋巴細(xì)胞株，其它6例患者因EB病毒感染后CD55-、CD59-淋巴細(xì)胞所占百分率太低而難以獲得CD55-、CD59-B淋巴細(xì)胞株。獲得不死性CD55-、CD59-B淋巴細(xì)胞株的2例患者在進(jìn)行EB病毒轉(zhuǎn)化前CD55-、CD59-淋巴細(xì)胞所占百分率分別為24.5%和56.4%，提示CD55-、CD59-淋巴細(xì)胞是否能感染EB病毒并獲得不死性生長(zhǎng)與其感染前所占百分率無(wú)明顯關(guān)系。3名正常人中的2名可獲得不死性生長(zhǎng)B淋巴細(xì)胞，提示正常人B淋巴細(xì)胞較易被EB病毒感染。2名PNH患者的B淋巴細(xì)胞經(jīng)EB病毒轉(zhuǎn)化后CD55-、CD59-淋巴細(xì)胞與CD55+、CD59+淋巴細(xì)胞共存，在

15、進(jìn)行細(xì)胞克隆前，我們先用免疫磁珠法對(duì)CD55-、CD59-細(xì)胞進(jìn)行分選12次，分選后幾乎全部為CD55-、CD59-細(xì)胞。利用分選后的細(xì)胞采用極限稀釋法進(jìn)行細(xì)胞克隆，實(shí)施起來(lái)確實(shí)有一定的難度，成功率只有1%2%，因而需要培養(yǎng)較多的克隆才有機(jī)會(huì)獲得單個(gè)細(xì)胞的生長(zhǎng)；同時(shí)，使用含較高濃度FCS的培養(yǎng)基和操作仔細(xì)也是成功的關(guān)鍵。大多數(shù)的細(xì)胞克隆經(jīng)用聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增免疫球蛋白基因的方法證實(shí)為單克隆性細(xì)胞。在用EB病毒感染淋巴細(xì)胞時(shí)，我們開(kāi)始按傳統(tǒng)方法6并未使用CsA來(lái)抑制T細(xì)胞的生長(zhǎng)，但難以獲得不死性生長(zhǎng)B淋巴細(xì)胞，后來(lái)加用2mg/L CsA則較易獲得不死性生長(zhǎng)B淋巴細(xì)胞，說(shuō)明CsA在建立B淋巴細(xì)胞株時(shí)

16、起較重要的作用。我們相信用EB病毒感染PNH患者B淋巴細(xì)胞所建立的B淋巴細(xì)胞株，將是體外研究PNH的有用工具。 作者單位：李克(300020天津，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院、中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)血液學(xué)研究所、血液病醫(yī)院)邵宗鴻(300020天津，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院、中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)血液學(xué)研究所、血液病醫(yī)院)張友山(300020天津，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院、中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)血液學(xué)研究所、血液病醫(yī)院)趙明峰(300020天津，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院、中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)血液學(xué)研究所、血液病醫(yī)院)王立(300020天津，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院、中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)血液學(xué)研究所、血液病醫(yī)院)郝玉書(shū)(300020天津，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院、中國(guó)協(xié)和醫(yī)

17、科大學(xué)血液學(xué)研究所、血液病醫(yī)院)川口辰哉(日本熊本大學(xué)醫(yī)學(xué)院)中熊秀喜(日本熊本大學(xué)醫(yī)學(xué)院)參 考 文 獻(xiàn)1Rosse WF, Ware RE. The molecular basis of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Blood, 1995, 86：3277-3286.2Luzzatto L, Bessler M, Rotoli B, et al. Somatic mutations in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria: a blessing disguise Cell, 1997, 88:1-4.3Hi

18、llmen P, Bessler M, Luzzatto L, et al. Production and characterization of lymphoblastoid cell lines with the paroxysmal nocturnal hemoglobinuria phenotype. Blood, 1993, 81:193-197.4Nakakuma H, Nagakura S, Horikawa K,et al. Interleukin-2 dependent T-cell lines established from paroxysmal nocturnal hemoglobinuria patients. Blood, 1994, 84:309-315.5Kevin JT, Michael