冠心寧注射液對(duì)大鼠缺血再灌注心肌的保護(hù)作用研究

1、    冠心寧注射液對(duì)大鼠缺血再灌注心肌的保護(hù)作用研究作者：余浩，王祥，涂遠(yuǎn)超，陳蘇，何傳飛，李松南    作者單位：湖北省新華醫(yī)院心內(nèi)科，湖北 武漢 430015；華中科技大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院心內(nèi)科 【摘要】  目的：探討冠心寧注射液對(duì)大鼠缺血再灌注心肌的影響。方法：40只SD大鼠被隨機(jī)分為四組，每組10只，分別為：假手術(shù)組、梗塞對(duì)照組、冠心寧注射液低劑量組、冠心寧注射液高劑量組。采用結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支的方法復(fù)制急性心肌缺血再灌注模型，觀察大鼠急性心肌梗塞范圍、梗塞心肌組織細(xì)胞因子白細(xì)胞介素（IL）-10、腫瘤壞死

2、因子（TNF）-的水平。結(jié)果：（1）冠心寧注射液低、高劑量組心肌梗塞范圍均顯著小于梗塞對(duì)照組（P<0.01），兩劑量組之間無(wú)顯著差異（P>0.05）；（2）冠心寧注射液低、高劑量組IL-10水平高于梗塞對(duì)照組（P<0.05），低于假手術(shù)組（P<0.01）；TNF-水平低于梗塞對(duì)照組（P<0.05），高于假手術(shù)組（P<0.01），而兩劑量組之間無(wú)顯著差異（P均>0.05）。結(jié)論：冠心寧注射液能抑制大鼠壞死心肌TNF-的表達(dá)，促進(jìn)IL-10的生成，抑制炎癥反應(yīng)，減少心肌梗塞范圍，具有較好的心肌保護(hù)作用?！娟P(guān)鍵詞】  心肌梗塞；心肌缺血；再灌注損傷

3、Protective effects of guanxinning injection on myocardial ischemiareperfusion injury in rats/YU Hao,WANG Xiang,TU Yuanchao,CHEN Su,HE Chuanfei,LI SongnanDepartment of Cardiology, Hubei Xinhua Hospital, Wuhan,Hubei, 430015,ChinaAbstract：Objective:To study the protective effect of Guanxinning injectio

4、n on myocardial ischemia/reperfusion injury in rats.Methods:A total of 40 SD rats were randomly divided into four groups, each with 10  rats(including two rats  were used in  paintings and the other eight used in experiment  observation   from each group).Four groups we

5、re as follows: sham operation group, the infarction control group,Guanxinning injection of lowdose group, Guanxinning injection of highdose group.The model of acute myocardial ischemia rat was obtained by legating the left anterior descending coronary artery.Results:The extent of myocardial infracti

6、on of Guanxinning injection high and low dosage treated group  reduced significantly compared with that of model group (P<0.01), and two dosage treated group was not different (P>0.1).The IL-10 levels in necrotic myocardial cell after giving Guanxinning injection were higher than that in

7、the I/R group (P<0.05),and were lower than that in  sham operation group(P<0.01).While the TNF- levels in  necrotic myocardial cell after giving Guanxinning injection were lower than that in I/R group (P<0.05),and were higher in the sham operation group (P<0.01).The levels of I

8、L-10 and TNF- in necrotic myocardial cell in Guanxinning injection high,low dosage  group were not singificant difference(P>0.05).Conclusion: Guanxinning injection can reduce TNF- and increase IL-10 levels in the necrotic myocardial cell，decrease the extent of myocardial infraction， and has

9、protective effects on myocardial ischemia/reperfusion injury in rats.Key words：Myocardial infarction;Myocardial ischemia;Reperfusion injury    近年來(lái)，隨著經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈血管成形術(shù)、冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)等的廣泛應(yīng)用于臨床，急性心肌梗塞（AMI）的治療步入了再灌注時(shí)期。心肌在較長(zhǎng)時(shí)間缺血后，恢復(fù)供血可加重?fù)p傷，這一現(xiàn)象被稱為心肌缺血/再灌注損傷（ischemia/reperfusion injury）。冠心寧注射液由丹參、川芎等中

10、藥組成1?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明,丹參具有抗血小板聚集、抗血栓形成、促纖維蛋白降解、抗心肌缺血及清除自由基和抗氧化作用；川芎具有抗血小板聚集作用,并有擴(kuò)張血管、增加冠脈流量、改善微循環(huán)作用。但對(duì)于冠心寧注射液能否減少心肌梗塞范圍，減輕心肌缺血/再灌注損傷，尚有待研究。    1  材料與方法1.1  材料 1.1.1  實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 ：SD大鼠（雌雄不分），體重（200±25）g，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。1.1.2  實(shí)驗(yàn)用藥 ：（1）冠心寧注射液：山西亞寶藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：071201；

11、（2）20%氨基甲酸乙酯（烏拉坦）：上?；瘜W(xué)試劑廠，生產(chǎn)批號(hào)：070521； （3）硫黃素：Amresco 公司，生產(chǎn)批號(hào)：070122； （4）伊文思藍(lán)：如吉生物公司，生產(chǎn)批號(hào)：070223；（5）紅四氮唑（TTC）： SIGMA公司，生產(chǎn)批號(hào)：066k06981.1.3  實(shí)驗(yàn)用主要試劑： （1）白介素（IL）-10試劑盒：武漢博士得生物技術(shù)公司；（2）腫瘤壞死因子（TNF）-試劑盒：武漢博士得生物技術(shù)公司 。1.1.4  實(shí)驗(yàn)主要儀器：（1）16道生理記錄儀(MP-150,美國(guó)BIOPAC)； （2）;動(dòng)物人工呼吸機(jī)(LDH-140,浙江醫(yī)科大學(xué)儀器實(shí)驗(yàn)廠) 。1.2

12、  方法1.2.1  動(dòng)物模型制備：大鼠予20%烏拉坦麻醉，仰臥位固定。分離氣管并插管后，立即正壓人工呼吸（呼吸頻率50次min，流量20mlkg）,從左側(cè)第3、4肋間打開胸腔，暴露心臟，剪破心包膜，在肺動(dòng)脈圓錐左緣平左心耳根下緣2mm冠狀動(dòng)脈處進(jìn)針，用50無(wú)損傷縫合線穿過(guò)心肌層，以備結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支引起缺血用。結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，缺血30min后解除結(jié)扎，再灌注120min。心電監(jiān)護(hù)：ST段抬高、T波高聳標(biāo)志心肌缺血的存在；以抬高的ST段下降，T波逐漸恢復(fù)為再灌注成功。1.2.2  方法步驟：（1）SD大鼠被隨機(jī)分為4組，每組10只。分別為：假手術(shù)組，冠脈

13、穿線而不結(jié)扎；梗塞對(duì)照組，冠脈結(jié)扎但不給藥；藥物干預(yù)組，分為低、高劑量組，分別給予1mlkg,3mlkg冠心寧注射液，于造模前分別以生理鹽水2ml,6ml稀釋后從大鼠頸靜脈緩緩滴入；（2）缺血/再灌注結(jié)束后向動(dòng)物心房?jī)?nèi)注入硫黃素0.20.3 ml，5min后每組取2只冠脈左前降支原位重新結(jié)扎，由心房?jī)?nèi)注入0.5g/L伊文思藍(lán)0.5ml，待心臟充分染成藍(lán)色后，迅速摘取心臟，用冰生理鹽水沖洗后剪去心房、血管及脂肪組織，-20°C凍存10min。將心室切成約1mm厚的薄片，分別在普通日光燈下、紫外線下觀察伊文思藍(lán)、硫黃素染色形態(tài)；（3）上述觀察后將薄片置入pH7.4、1.0g/L的TTC液

14、中37°C孵育10min；（4）退出實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn) 有下列情況之一的大鼠將退出實(shí)驗(yàn): 當(dāng)灌注染色后,缺血質(zhì)量不足心臟重的15%;結(jié)扎冠狀動(dòng)脈失敗或未發(fā)現(xiàn)再灌注者; 過(guò)度出血并致血壓下降者; 呼吸心跳停止超過(guò)30s者。1.2.3  觀察指標(biāo)及測(cè)定方法：（1）心肌梗塞范圍測(cè)定：每組取8只大鼠缺血/再灌注結(jié)束后摘取心臟, -20速凍后,沿心臟結(jié)扎線以下橫切6片,置1%的TTC磷酸鹽緩沖液中染色15min (37水浴)。肉眼觀察,梗塞區(qū)呈灰白色,未梗塞區(qū)呈紅色。沿壞死組織邊緣分離,將梗塞心肌組織與未梗塞心肌組織分別稱重,以梗塞心肌占整個(gè)心臟重量的百分比表示梗塞范圍；（2）心肌組織 IL

15、-10、TNF-測(cè)定：應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法檢測(cè)IL-10, 放免法檢測(cè)血漿TNF-,均按試劑盒要求進(jìn)行檢測(cè)。每組取8只灌注結(jié)束后，立即將大鼠心臟剪下，冰生理鹽水漂洗，切取冠脈左前降支供血的前壁全層心肌組織，稱重后制成5%的勻漿液，離心取上清液，按試劑盒說(shuō)明檢測(cè)IL-10、TNF-的水平。1.3   統(tǒng)計(jì)分析計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間比較用方差分析，組間兩兩比較用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有顯著性。    2  結(jié)  果2.1  各組梗塞范圍比較冠心寧注射液對(duì)

16、大鼠心肌梗塞范圍的影響 各給藥組全心臟的重量與模型組比較無(wú)顯著差異(P>0.05)；假手術(shù)組各動(dòng)物心肌染色后未見(jiàn)明顯梗塞區(qū)；梗塞對(duì)照組心肌梗塞區(qū)占全心臟重量的百分比為(33.08±4.87)%；冠心寧注射液低、高兩個(gè)劑量組梗塞程度明顯減輕,梗塞區(qū)重占全心臟的百分比與梗塞對(duì)照組比較均有顯著性差異(P<0·01),。而冠心寧注射液低、高兩個(gè)劑量組梗塞區(qū)占全心臟的重量比無(wú)顯著差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。表1  各組梗塞范圍比較(略)注：與梗塞對(duì)照組比較P<0.05，P<0.01。2.2  各組細(xì)胞因子IL-10、TNF-水平比較

17、細(xì)胞因子IL-10水平：梗塞對(duì)照組明顯低于假手術(shù)組（P<0.01）; 冠心寧低、高劑量組明顯高于梗塞對(duì)照組（P<0.05），但均明顯低于假手術(shù)組（P<0.01）；而兩劑量組間無(wú)顯著差異（P>0.05）。TNF-水平：梗塞對(duì)照組明顯高于假手術(shù)組（P<0.01）;冠心寧低、高劑量組明顯低于梗塞對(duì)照組（P<0.05）也均明顯高于假手術(shù)組（P<0.01）；而兩劑量組間無(wú)顯著差異（P>0.05）， 見(jiàn)表2。表2  各組細(xì)胞因子白介素（IL）-10、腫瘤壞死因子（TNF）-水平比較(略) 注：與假手術(shù)組比較P<0.01；與梗塞對(duì)照組比較P&l

18、t;0.05。    3  討  論本研究表明，冠心寧注射液能減少心肌缺血/再灌注損傷時(shí)心肌梗塞范圍。同時(shí)，抑制TNF-的表達(dá)，促進(jìn)IL-10的生成，但低、高劑量治療組之間上述作用無(wú)顯著差異，說(shuō)明為非劑量依賴性，然而，冠心寧注射液治療的最合適劑量值得探索。TNF-是一種重要的炎性細(xì)胞因子,它與心肌缺血-再灌注的損傷相關(guān)2，能激活中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞,在正常的心肌組織含量很低3, 急性心肌缺血再灌注后，TNF-于數(shù)分鐘由巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、肥大細(xì)胞大量釋放4，5。過(guò)量的TNF-會(huì)導(dǎo)致心臟的損傷。研究表明6, 應(yīng)用TNF-抗體減少血清TNF-的含量

19、會(huì)對(duì)缺血的心肌起到保護(hù)作用。IL-10是由激活的淋巴細(xì)胞,單核/巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞產(chǎn)生的,其作用表現(xiàn)為對(duì)多種促炎細(xì)胞因子的合成和巨噬細(xì)胞活性的抑制7。多數(shù)研究報(bào)道IL-10作為抗炎因子發(fā)揮保護(hù)性作用。心肌的缺血再灌注與能導(dǎo)致心肌損傷的強(qiáng)烈炎癥反應(yīng)密切相關(guān),而該炎癥反應(yīng)可導(dǎo)致多種細(xì)胞因子的連鎖激活,其中包括TNF-的釋放增多和IL-10的表達(dá)減少。褚松筠等8在實(shí)驗(yàn)性大鼠心肌缺血再灌注損傷模型中,應(yīng)用外源性IL-10干預(yù)后,再灌注結(jié)束時(shí)大鼠心肌梗塞的面積顯著降低,心肌收縮功能改善。由此可見(jiàn),IL-10在心肌缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要的保護(hù)作用9。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，丹參具有擴(kuò)張冠脈、增加血流量、耐缺氧、增

20、強(qiáng)心肌收縮力、減慢心率、改善心臟功能、抑制凝血、促進(jìn)組織修復(fù)、降低血脂、抑菌等作用10。川芎具有擴(kuò)張血管、增加動(dòng)脈血流量、改善微循環(huán)、抑制血小板聚集等作用11。丹參與川芎在臨床應(yīng)用中具有協(xié)同作用，二者的復(fù)合制劑冠心寧注射液對(duì)急性心肌缺血的治療效果更加明顯。通過(guò)對(duì)本組實(shí)驗(yàn)的觀察，冠心寧注射液能明顯減少大鼠心肌梗塞范圍，其機(jī)制可能主要是冠心寧注射液抑制炎癥反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，冠心寧注射液兩組治療組大鼠壞死心肌組織中IL-10水平高于梗塞對(duì)照組（P<0.05），TNF-水平低于梗塞對(duì)照組（P<0.05），說(shuō)明冠心寧注射液對(duì)缺血/再灌損傷心肌炎癥反應(yīng)有抑制作用，而炎癥反應(yīng)是心肌缺血/再灌注損

21、傷，無(wú)復(fù)流現(xiàn)象等的重要病理基礎(chǔ)。【參考文獻(xiàn)】1田政球，吳 荔.冠心寧聯(lián)合西藥治療不穩(wěn)定型心絞痛臨床觀察J.心血管康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2006，15(2)：184-186.2Herskowitz A, Choi S, Ansari AA.Cytokine mRNA expression in postischemic myocardiumJ.Am J pathol, 2005, 146 (2): 419.3Aker S, Belosjorow S, Konietzkal,et al.Serum but not myocardial TNF- apha concentration is increased in pacinginduced heart failure in rabbitsJ.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 2003, 285 (2): 463-469.4Bellisari FI, Gallina S, DeCaterina R.Tumornecrosis factor and cardiovascular diseaseJ.Ital Heart J, 2006, 2 (6): 408-417.5Frangogiannis NG, Lindsey ML, Michael LH,et al.Resident cardi