尼莫地平對(duì)AD大鼠腦組織NO的影響

1、尼莫地平對(duì)AD大鼠腦組織NO的影響    摘要 目的 探討尼莫地平改善癡呆大鼠模型學(xué)習(xí)記憶能力的機(jī)制。方法 隨機(jī)將30只大鼠分為三組,空白對(duì)照組不作處理,模型組和尼莫地平組用A2535腦海馬注射造模,尼莫地平組給予尼莫地平干預(yù)。2周后進(jìn)行迷宮實(shí)驗(yàn),比較各組大鼠行為上的差異。3周后腦組織NO檢測(cè),進(jìn)行組間比較。結(jié)果 尼莫地平組學(xué)習(xí)記憶能力優(yōu)于模型組,三組腦組織NO含量,經(jīng)方差分析有顯著性差異(P<0.01)。結(jié)論 尼莫地平能改善癡呆大鼠模型的學(xué)習(xí)和記憶能力,這種改善可能與維持Ca2+穩(wěn)態(tài)、保護(hù)腦組織、減少NO等神經(jīng)毒損害有關(guān)。 關(guān)鍵詞 阿爾茨海默病;

2、 尼莫地平; 一氧化氮 中圖分類號(hào) R749.16 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1673-9701(2010)07-05-03 Effect of Nimodipine on AD Rat Brain Tissue NO GAO Lu1 WANG Chaowei1 HU Weimin2 1.Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China;2.Department of Neurology,the Second Clinical Medical College of Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,Ch

3、ina Abstract ObjectiveTo explore the mechanism of whether nimodipine can improve learning and memory in dementia rat model. Methods Thirty rats were randomly divided into three groups:control group with no treatment,the model group and nimodipine group. The dementia rat model was established by inje

4、ction of brain hippocampus A2535,and the nimodipine group was given nimodipine intervention. The maze test was carried out after two weeks and the comparison was made of the differences in rat behavior of the three groups. The brain tissue NO content was detected after three weeks and the comparison

5、 was made in the three groups. ResultsBoth learning and memory of the nimodipine group were better than those of the model group. The NO content in the brain tissue of the three groups was detected,and the analysis of variance showed a significant difference(P<0.01). ConclusionNimodipine can impr

6、ove learning and memory of dementia rat,which may be related to the maintenance of Ca2+ homeostasis and protection of brain tissue,such as reduction of NO neurotoxicity damage. Key wordsAlzheimer disease; Nimodipine; NO 1994年Khachaturian提出了阿爾茨海默病(Alzheimer disease,AD)的鈣穩(wěn)態(tài)學(xué)說(shuō)1,認(rèn)為細(xì)胞Ca2+ 濃度的持續(xù)升高會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損

7、傷和凋亡。細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明,Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡與AD病理特點(diǎn)有關(guān)2。高Ca2+可活化氧化氮合酶,產(chǎn)生NO。NO是一種自由基,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)參與多種病理和生理作用。實(shí)驗(yàn)證明,海馬內(nèi)NO的表達(dá)和學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)。血管性癡呆時(shí)腦脊液中NO濃度與癡呆程度呈正相關(guān)。尼莫地平(NIM)是二氫吡啶類鈣拮抗劑,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明,它能增加動(dòng)物的探究行為、改善學(xué)習(xí)記憶功能。本實(shí)驗(yàn)用NIM干預(yù)過(guò)的AD大鼠模型進(jìn)行行為學(xué)和NO含量的對(duì)照研究,以證明鈣穩(wěn)態(tài)學(xué)說(shuō)和NIM的治療作用。 1 材料與方法 1.1 材料 1.1.1 動(dòng)物 健康Wistar雄性大鼠30只,月齡5,由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,體重200250g。

8、 1.1.2 藥物 尼莫地平片由天津市中央藥業(yè)有限公司生產(chǎn),批準(zhǔn)文號(hào):國(guó)藥準(zhǔn)字H20043915。 1.1.3 試劑 A2535溶液,由Sigma公司生產(chǎn);NO試劑盒由南京建成科技有限公司生產(chǎn)。 1.1.4 主要儀器 大鼠腦立體定位儀、顱骨鉆,由淮北正華生物儀器有限公司生產(chǎn);Morris迷宮,由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所生產(chǎn)。 1.2 方法 1.2.1 分組及給藥方法 實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組與尼莫地平組,每組10只,模型組和尼莫地平組制作成AD模型,尼莫地平組給予NIM 10mg/(kg·d)灌胃,連用3周。 1.2.2 造模方法 模型組與尼莫地平組大鼠腹腔注射10%水合氯

9、醛麻醉,參考大鼠腦立體定位圖譜,將大鼠的頭固定在立體定位儀上,剪去局部毛發(fā),消毒后沿矢狀線切開(kāi)皮膚約1.5cm,暴露顱骨,確定海馬區(qū)注射點(diǎn)(前囟后3mm,中線旁開(kāi)2mm),用顱骨鉆在顱骨上打孔,用微量注射器沿穿刺孔垂直進(jìn)針3.5mm,緩慢注射A2535溶液5g,5min內(nèi)注射完,留針5min,拔針后牙科泥封住穿刺孔,術(shù)區(qū)滴慶大霉素,縫合皮膚并消毒。肌肉注射青霉素10萬(wàn)U/d,連續(xù)3d,防止感染。 1.2.3 Morris迷宮 造模前1周大鼠進(jìn)行Morris迷宮訓(xùn)練,取第6天游迷宮所需時(shí)間與造模后第1次游迷宮時(shí)間進(jìn)行對(duì)照,數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。造模2周后,再進(jìn)行迷宮實(shí)驗(yàn),逐一記錄每只大鼠從3個(gè)遠(yuǎn)象限入水到

10、找到平臺(tái)所需的時(shí)間,合計(jì)后取各組均值,連續(xù)記錄6d,數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。 1.2.4 檢測(cè)指標(biāo)及過(guò)程 造模3周后,斷頭取腦。用組織勻漿器充分研磨,生理鹽水稀釋,2500r/min,離心5min,取上清液,置-20冰箱中備檢。按NO測(cè)定試劑配置要求,用分光光度計(jì)檢測(cè)和計(jì)算NO含量。數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。 1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。經(jīng)檢驗(yàn),該資料滿足方差分析的條件,因此,采用方差分析進(jìn)行分析。 2 結(jié)果 2.1 造模前、后游迷宮所需時(shí)間 造模前游迷宮所需時(shí)間為(25.19±9.35)s,造模后游迷宮所需時(shí)間(159.22±1

11、6.24)s。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,造模前后游迷宮所需時(shí)間有明顯差異(t=2.967,P<0.01),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,證明造模成功。 2.2 三組游迷宮所需時(shí)間 見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,模型組學(xué)習(xí)記憶力下降,表現(xiàn)為游至安全平臺(tái)時(shí)間最長(zhǎng),與空白對(duì)照組及尼莫地平組比較差異有顯著性,而且隨著訓(xùn)練次數(shù)增加,差異更加明顯。第6天F=86.78(P<0.05),實(shí)驗(yàn)證明NIM對(duì)記憶功能有增強(qiáng)作用。 2.3 各組NO指標(biāo)分析 見(jiàn)表2。NO指標(biāo)三組經(jīng)方差分析,F=79.302,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。進(jìn)一步采用LSD-t的方法進(jìn)行兩兩比較,空白對(duì)照組與模型組比較t=3.963,尼莫地平組與

12、模型組比較t=2.831,尼莫地平組與空白對(duì)照組比較t=2.922,結(jié)果差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。 3 討論 Ca2+是重要的細(xì)胞內(nèi)信使之一,對(duì)神經(jīng)發(fā)展、突觸傳遞和可塑性及各種代謝途徑調(diào)控也至關(guān)重要3。進(jìn)入老年,神經(jīng)細(xì)胞Ca2+調(diào)節(jié)系統(tǒng)功能出現(xiàn)紊亂,細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高、Ca2+內(nèi)流增加、線粒體緩沖Ca2+的能力下降等4。Ca2+失衡的原因除與年齡有關(guān)外,與基因突變、A、谷氨酸、NO等錯(cuò)綜聯(lián)系。對(duì)早老基因(PS)研究,PS促成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+通道形成和增加通道的滲透性,還影響1,4,5三磷酸肌醇受體(IP3R)5,實(shí)驗(yàn)證明Ca2+進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)主要是通過(guò)IP3R途徑實(shí)現(xiàn)的。IP3R

13、是存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、肌漿網(wǎng)及核膜上的一種配體門控Ca2+通道蛋白,精確地調(diào)控胞漿內(nèi)Ca2+濃度的變化。風(fēng)險(xiǎn)基因研究發(fā)現(xiàn),增加CALHM1蛋白在細(xì)胞膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)質(zhì)膜表達(dá),也可增加Ca2+進(jìn)入細(xì)胞和提高細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度6。高Ca2+能調(diào)節(jié)-淀粉樣蛋白前體(APP)的加工,增加A的生成和毒性作用;另一方面,A能嵌入細(xì)胞膜,形成A通道,通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞膜離子通道,破壞細(xì)胞離子穩(wěn)態(tài),加劇Ca2+失衡,導(dǎo)致氧化應(yīng)激、線粒體損傷、突觸功能障礙,高Ca2+還可促進(jìn)Tua蛋白過(guò)度磷酸化。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中谷氨酸水平過(guò)高可導(dǎo)致NMDA(N-甲基-D-天冬氨酸)受體的過(guò)度激活,從而細(xì)胞內(nèi)敏感的細(xì)胞器,如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2+

14、積聚,阻止Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)流到線粒體或者緩沖細(xì)胞內(nèi)Ca2+,可減少凋亡刺激的敏感性。所以說(shuō)Ca2+失衡是腦老化和AD的關(guān)鍵。NO有擴(kuò)張血管、抑制血小板聚集與黏附、炎癥介質(zhì)等作用,還是重要的信號(hào)傳遞物質(zhì)。過(guò)高的NO被認(rèn)為可促使炎癥細(xì)胞功能紊亂和神經(jīng)系統(tǒng)疾病,在神經(jīng)退行性疾病時(shí)生成增多被看作氧化應(yīng)激的后果7。Ca2+內(nèi)流增加,活化氧化氮合酶,產(chǎn)生過(guò)多的NO。NO再分解成亞硝酸鹽(ONOO-),這是一種高活性的氧自由基物質(zhì),可引起DNA氧化損傷,還可與某些含亞鐵原卟啉基因的鐵原子結(jié)合,形成亞硝酸鐵絡(luò)合物,從而抑制線粒體呼吸作用8。  綜上所述,減少Ca2+內(nèi)流可以減少NO的過(guò)多生成及降低其

15、他病理過(guò)程的風(fēng)險(xiǎn),起到腦保護(hù)作用。一些AD患者應(yīng)用左旋電壓門控制Ca2+通道(L-VGCCS)阻滯劑,提高了學(xué)習(xí)和記憶能力,這說(shuō)明AD神經(jīng)變性與鈣通道有關(guān)9。本實(shí)驗(yàn)思路就是使用NIM減少Ca2+內(nèi)流,探討Ca2+與NO的關(guān)系。NIM易透過(guò)血腦屏障,海馬、皮質(zhì)、丘腦等結(jié)構(gòu),含有高密度的二氫吡啶結(jié)合部位,所以NIM可能對(duì)AD的治療作用更優(yōu)于其他類鈣拮抗劑。實(shí)驗(yàn)中尼莫地平組在Morris迷宮中找到平臺(tái)的時(shí)間優(yōu)于模型組,而且隨著訓(xùn)練次數(shù)的增加,這種優(yōu)勢(shì)更加明顯。NO含量測(cè)定,尼莫地平組數(shù)值介于空白對(duì)照組和模型組之間,一方面說(shuō)明NIM通過(guò)維持Ca2+穩(wěn)態(tài),減少了NO的生成,有利于AD的恢復(fù);另一方面腦N

16、O測(cè)定結(jié)果與迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果平行,說(shuō)明腦NO含量變化與AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力有關(guān)。空白對(duì)照組含量最低,說(shuō)明NO含量只有在一定水平時(shí)才能發(fā)揮生理作用;模型組含量最高,說(shuō)明過(guò)高的NO含量具有神經(jīng)毒作用,不利于AD的恢復(fù)。 參考文獻(xiàn) 1 Lukasz Bojarski,Jochen Herms,Jacek Kuznicki. Calcium dysregulation in Alzheimers diseaseJ. Neurochemistry International,2008,52:621-633. 2 Behnam Sabayana,Mohammad Reza Namazi,Arash Mowla

17、,et al. Are patients with Darier and Haily-Haily diseases susceptible to Alzheimers Disease?a Theory based on abnormal intraneuronal Ca2+ homeostasisJ. Journal of Alzheimers Disease,2009,16:521-523. 3 Antonio Pisani,Paola Bonsi,Paolo Calabresi. Calcium signaling and neuronal vulnerability to ischemi

18、a in the striatumJ. Cell Calcium,2004,36(3-4):277-284. 4 Ilya Bezprozvanny,Mark PM. Neuronal calcium mishandling and the pathogenesis of Alzheimers diseaseJ. Trends Neurosci,2008,31(9):454- 463. 5 David HS,Robert Gasperini,Adele JV,et al. The role of A-induced calcium dysregulation in the pathogenesis of Alzheimers diseaseJ. Journal of Alzheimers Disease,2009,16(2):225-233. 6 Rudolph ET,Lars Bertram. Alzheimer's disease:the latest