凋亡的雙向調(diào)節(jié)機(jī)制

1、    凋亡的雙向調(diào)節(jié)機(jī)制        細(xì)胞凋亡的基本過程大致包括刺激期、信號傳遞期、效應(yīng)期（人類效應(yīng)物半胱氨酸蛋白酶類總稱caspases）及死后期。在從線蟲到人類不同有機(jī)體細(xì)胞凋亡的前幾期研究中逐步認(rèn)識到，凋亡的發(fā)生是細(xì)胞受促進(jìn)性和抑制性雙向因素共同調(diào)節(jié)的結(jié)果，已發(fā)現(xiàn)凋亡的雙向調(diào)節(jié)機(jī)理分述如下。 一、含死亡區(qū)分子的作用在凋亡的刺激期，細(xì)胞接受的刺激因素包括各種細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子（TNF）、FasL、干擾素（IFN）-、白細(xì)胞介素（IL）-6，某些生長因子如神經(jīng)生長因

2、子（NGF）、內(nèi)皮生長因子（EGF）、血小板源生長因子（PDGF）等，這些因子大多是通過含死亡區(qū)分子啟動、調(diào)節(jié)凋亡反應(yīng)的。含死亡區(qū)分子大致有兩類：死亡受體及連接(adaptor)分子1。前者是存在于細(xì)胞膜上、能與相應(yīng)細(xì)胞因子等配體結(jié)合的受體，如Fas、TNF-R1、DR3(Apo-3)、DR4(Apo-2)、神經(jīng)生長因子受體等，這些受體的胞質(zhì)段含有一大約由70個(gè)氨基酸組成的死亡區(qū)（death domain，DD）；后者是指存在于胞質(zhì)中、能連接細(xì)胞膜死亡受體及有關(guān)caspase、調(diào)節(jié)凋亡信號傳遞的中介蛋白。已發(fā)現(xiàn)的連接分子有：Fas 相關(guān)死亡區(qū)蛋白（FADD）、TNF-R1相關(guān)死亡區(qū)蛋白（TRA

3、DD）、受體反應(yīng)蛋白（RIP）2、RAIDD(RIP-associated Ich-1/CED-3-homologous protein with death domain)3、TNF受體相關(guān)因子（TRAF）4等，這些蛋白質(zhì)分子的羧基端也均含有DD，其氨基端可含有與某些caspase的主要區(qū)段相似的氨基酸順序，又稱死亡效應(yīng)區(qū)(death effector domain,DED)。連接分子依靠其分子內(nèi)與其他蛋白質(zhì)分子共有的DD或DED，與這些蛋白質(zhì)分子相互結(jié)合，形成異源雙體(heterodimer)，這種雙體分子是凋亡信號傳遞的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。近來又發(fā)現(xiàn)一種能與這種雙體分子相關(guān)（連）的蛋白質(zhì)分子FLI

4、CE(FADD-homologous ICE/CDE-3-like protease，又稱caspase-8),其氨基端含有兩個(gè)與FADD中DED相似的串聯(lián)區(qū)段，而羧基端含有與caspase相似的260個(gè)氨基酸區(qū)段。通過這些含死亡區(qū)分子及FLICE，既可傳遞凋亡信號，又可阻止凋亡信號，雙向控制凋亡的發(fā)生1，2。如Fas與其配體結(jié)合后，F(xiàn)as的DD與FADD的DD相互作用形成異源雙體，同時(shí)又因FADD的氨基端DED與FLICE 的DED相似而相互結(jié)合形成另一異源雙體，繼而依靠FLICE羧基端260個(gè)氨基酸區(qū)段激活caspase,引起凋亡。又如TNF與 TNFR(P55)結(jié)合后，TNFR的DD 先

5、與TRADD的DD形成異源雙體，然后再依靠TRADD的DD與另一連接分子FADD 的DD 形成又一異源雙體，最后由FADD的氨基端DED與FLICE的DED再形成一異源雙體，使FLICE的caspase區(qū)段激活 caspase，引起凋亡2，5；但TNFR的DD與TRADD的DD形成異源雙體后除了以上述方式促進(jìn)凋亡信號外，還可通過TRADD的氨基端部分直接與TRAF2相互作用激活NF-B轉(zhuǎn)錄因子，抑制凋亡信號；說明同樣TNF刺激，在TNFR與TRADD結(jié)合后，下游不同連接分子的參與，使信號傳遞出現(xiàn)分叉支路即TNFTRADDFADD凋亡及TNFTRADDTRAF2激活轉(zhuǎn)錄因子，解釋了TNF刺激可出

6、現(xiàn)兩種不同生物學(xué)效應(yīng)的機(jī)理6。某些凋亡抑制劑，也是通過含有死亡區(qū)分子及FLICE阻斷凋亡信號的傳遞，如主要在肌肉和淋巴組織中表達(dá)的FLIP（FLICE-inhibitory protein），有長短兩型即FLIPL及FLIPS，F(xiàn)LIPL除了象FLIPS氨基端有兩個(gè)DED外，在羧基端還有caspase樣區(qū)段，它們均可與FADD及FLICE結(jié)合，而FLIP與FADD的DED結(jié)合，干擾了FADD與FLICE的結(jié)合，抑制了Fas等所有死亡受體誘發(fā)的凋亡，已觀察到惡性黑色素瘤中FLIPL的含量較高7。二、bcl-2族蛋白-細(xì)胞色素c的調(diào)節(jié)已知bcl-2族蛋白中，有些如Bad、Bax可促進(jìn)凋亡，而另一些

7、如bcl-2、bcl-XL等則抑制凋亡，這種對凋亡的雙向調(diào)節(jié)主要是通過bcl-2族蛋白中不同分子間異源雙體或同源雙體的形成而實(shí)現(xiàn)的。如Bad可與bcl-2或bcl-XL形成的異源雙體促進(jìn)凋亡；Bax的同源雙體也可促進(jìn)凋亡；Bax還可與bcl-2或bcl-XL形成異源雙體，但形成的親和力低于Bad，故這些雙體如在Bad存在時(shí)，可被Bad替代而釋出Bax，替代后的雙體及釋出Bax形成的同源雙體均促進(jìn)凋亡，如在bcl-2或bcl-XL過量存在時(shí)，阻止Bax同源雙體的形成，抑制凋亡；bcl-2與bcl-XL形成的異源雙體也抑制凋亡8。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，bcl-2分子內(nèi)有一絲氨酸易變環(huán)（flexible lo

8、op domain）,在磷酸酶抑制劑等刺激后，bcl-2中絲氨酸磷酸化而使bcl-2滅活，反而促進(jìn)凋亡。Bad分子內(nèi)除了有絲氨酸易變環(huán)外，還含有一段依賴磷酸化而識別14-3-3蛋白（一種能與信息酶如Raf-1相互作用的蛋白）的氨基酸順序，如FL5.12造血細(xì)胞在生長因子IL-3作用后，可將Bad的絲氨酸殘基磷酸化，磷酸化的Bad可識別、結(jié)合14-3-3蛋白，定位于胞質(zhì)中，不再與線粒體膜上的bcl-XL結(jié)合成雙體，反而防止凋亡；如在IL-3生長因子撤離后，Bad去磷酸化，非磷酸化的Bad又可與bcl-XL結(jié)合，促進(jìn)凋亡。這些結(jié)果表明，生長因子可通過誘發(fā)Bad磷酸化，引起B(yǎng)ad與14-3-3蛋白結(jié)

9、合，使Bad/bcl-XL異源雙體分離，抑制凋亡信號，相反，生長因子的撤離，通過磷酸酶等作用，使Bad去磷酸化而與bcl-XL結(jié)合成雙體，促進(jìn)凋亡8。為了弄清bcl-2族雙體的作用方式，還發(fā)現(xiàn)：大多數(shù)bcl-2族蛋白的羧基端有疏水性跨膜區(qū)，依靠該區(qū)將這類蛋白質(zhì)主要定位在線粒體外膜（或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核膜），僅Bad無跨膜區(qū)，故屬非膜結(jié)合蛋白；在蛋白激酶抑制劑staurosporine誘發(fā)的人HeLa細(xì)胞凋亡中，既有胞質(zhì)中細(xì)胞色素c的明顯增加，又有線粒體中細(xì)胞色素c的相應(yīng)降低；另外，凋亡時(shí)由線粒體釋放的細(xì)胞色素c還可促進(jìn)caspase的激活，均說明線粒體及其細(xì)胞色素c在調(diào)節(jié)凋亡過程中起重要作用。進(jìn)一步觀

10、察到，bcl-2在人粒細(xì)胞性白血病HL-60細(xì)胞中的過度表達(dá)可阻止線粒體將細(xì)胞色素c釋放到胞質(zhì)中，同時(shí)抑制凋亡；在一種蛙卵胞質(zhì)的凋亡研究系統(tǒng)中，線粒體可自動釋放細(xì)胞色素c，并激活caspase導(dǎo)致凋亡核的形態(tài)變化，而將外源性重組bcl-2加入這一系統(tǒng)，也可防止線粒體釋放細(xì)胞色素c，繼而防止caspase激活及凋亡核變化；均說明bcl-2族蛋白可能通過影響線粒體釋放細(xì)胞色素c的過程來調(diào)節(jié)凋亡9。關(guān)于bcl-2族蛋白影響線粒體釋放細(xì)胞色素c的機(jī)制，可能為：（1）Bax可結(jié)合到一種能調(diào)節(jié)線粒體膜通透性的蛋白通道稱通透性變換孔復(fù)合物，并在腺嘌呤核苷酸移位劑的協(xié)作下，增加線粒體膜的通透性10；（2）根據(jù)

11、線粒體內(nèi)膜質(zhì)子泵F0F1-ATP酶不同亞單位的突變可抑制Bax誘發(fā)的凋亡，而用抑制F0F1-ATP酶活性的寡霉素處理也可抑制Bax誘發(fā)的凋亡，說明F0F1-ATP酶對Bax誘發(fā)凋亡是必須的,由于Bax及bcl-2均構(gòu)成膜孔，F(xiàn)0F1-ATP酶位于線粒體內(nèi)膜，細(xì)胞色素c位于線粒體的膜間隙，可能Bax與F0F1-ATP酶間相互作用影響線粒體膜上離子的轉(zhuǎn)運(yùn)，造成細(xì)胞色素c從線粒體膜間隙釋放到胞質(zhì)11。凋亡研究還表明，線蟲死亡基因ced-4的產(chǎn)物CED-4也是凋亡的雙向調(diào)節(jié)物。它一方面通過其分子內(nèi)具有ATP酶活性、能結(jié)合磷酸的環(huán)狀結(jié)構(gòu)促進(jìn)CED-3（或caspase）的自身激活（auto-activa

12、tion），可引起凋亡12，另一方面也可直接與CED-9（或bcl-XL）結(jié)合，并被CED-9從胞質(zhì)定位到膜結(jié)構(gòu)上，而阻止凋亡13。已在人HeLa細(xì)胞中鑒定了一種CED-4的相似物稱凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）,其作用是與細(xì)胞色素c結(jié)合后活化caspase-3,導(dǎo)致凋亡14。三、細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)信號的調(diào)節(jié)1分裂原激活的蛋白激酶（mitogen activated protein kinase, MAPK）類信息通路：每條通路常包括MAPK、MAPKK（MAPK的激酶）及MAPKKK（MAPKK的激酶）3種蛋白激酶組成，首先由MAPKKK磷酸化激活MAPKK，活化的MAPKK磷酸化激活MAPK

13、，激活的MAPK移至核內(nèi)，再磷酸化激活一些作為轉(zhuǎn)錄因子的核蛋白，使細(xì)胞外刺激與DNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)過程間形成聯(lián)絡(luò)信號。目前已在哺乳類鑒定了細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)、應(yīng)激激活的蛋白激酶（SAPK）或稱JNK(Jun N-terminal kinase)及P38(與hog基因產(chǎn)物有關(guān))3類MAPK15。已發(fā)現(xiàn)由多種生長因子激活的ERK促進(jìn)細(xì)胞增生、阻止凋亡，而紫外線、熱休克、高滲透壓等及TNF、IL-1等細(xì)胞因子激活的SAPK及P38促進(jìn)凋亡、阻止細(xì)胞生長。如在大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤PC-12細(xì)胞的培養(yǎng)中，神經(jīng)生長因子的加入，可激活ERK，并使細(xì)胞在914 d后分化為交感神經(jīng)節(jié)樣細(xì)胞；而在神經(jīng)生長因子

14、撤離后6 h，分化細(xì)胞中SAPK及P38活性升高，并有凋亡的形態(tài)變化；然而，僅有SAPK或P38的激活未必引起凋亡，因IL-1是PC-12細(xì)胞產(chǎn)生SAPK或P38的強(qiáng)激活劑，但未能引起凋亡，提示神經(jīng)生長因子的撤離，不僅激活SAPK及P38，還可能影響ERK的活性；定量分析神經(jīng)生長因子撤離后細(xì)胞內(nèi)ERK（包括P42及P44）的含量，結(jié)果ERK量明顯降低，說明凋亡的發(fā)生，除了有SAPK及P38信息分子的激活外，還必須有ERK信息分子的抑制。同樣，在促進(jìn)PC-12細(xì)胞生長分化過程中也既有ERK的激活，又有對SAPK及P38的直接或間接抑制。因此，這類細(xì)胞無論凋亡或生存均須MAPK信息系統(tǒng)的雙向調(diào)節(jié)1

15、6。2神經(jīng)酰胺類信息分子：神經(jīng)鞘磷脂是細(xì)胞膜外側(cè)的重要組分，在適當(dāng)酶的作用下，神經(jīng)鞘磷脂?神經(jīng)酰胺?鞘氨醇?1-磷酸鞘氨醇?，F(xiàn)認(rèn)為，神經(jīng)酰胺及1-磷酸鞘氨醇分別是促進(jìn)及抑制凋亡的重要信息分子。如發(fā)現(xiàn)FasL、TNF-與其受體結(jié)合后，可激活神經(jīng)鞘磷脂酶，使神經(jīng)鞘磷脂降解為神經(jīng)酰胺，而用神經(jīng)鞘磷脂酶處理人HL-60、U937白血病細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)酰胺增高的同時(shí)，細(xì)胞發(fā)生凋亡，說明FasL、 TNF-引起的凋亡過程中有神經(jīng)酰胺的參與；又因抑制FasL、TNF-引起細(xì)胞凋亡的蛋白激酶C在這些細(xì)胞中可激活鞘氨醇激酶，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)1-磷酸鞘氨醇的積聚，而用1-磷酸鞘氨醇處理上述2種細(xì)胞，即可阻止神經(jīng)酰胺引

16、起的凋亡，說明1-磷酸鞘氨醇是蛋白激酶C抑制FasL、TNF-誘發(fā)凋亡的介質(zhì)；進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，TNF-還降低鞘氨醇激酶的活性，蛋白激酶C還阻止TNF-誘導(dǎo)神經(jīng)酰胺。這些結(jié)果均表明，TNF-及蛋白激酶C兩類因素對細(xì)胞內(nèi)無論神經(jīng)酰胺或1-磷酸鞘氨醇量的變化有雙重調(diào)節(jié)作用，即TNF類細(xì)胞因子可激活神經(jīng)鞘磷脂酶，抑制鞘氨醇激酶，使細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)酰胺升高，促進(jìn)凋亡；而蛋白激酶C及PDGF等可激活神經(jīng)酰胺酶及鞘氨醇激酶，抑制TNF誘導(dǎo)神經(jīng)酰胺，使細(xì)胞內(nèi)1-磷酸鞘氨醇升高，抑制凋亡。因此，細(xì)胞凋亡與否是細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)酰胺及1-磷酸鞘氨醇二者共同作用的結(jié)果，很可能不同組織類型的細(xì)胞內(nèi)具有特定的神經(jīng)酰胺/1-磷酸鞘氨醇比，

17、各種細(xì)胞受不同的環(huán)境刺激而調(diào)節(jié)其神經(jīng)酰胺/1-磷酸鞘氨醇之比，以決定其存亡的命運(yùn)17。進(jìn)一步用神經(jīng)酰胺刺激U937、BAE等細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)SAPK量比對照組增加40 倍，用1-磷酸鞘氨醇刺激NIH3T3等細(xì)胞，可激活其ERK信號反應(yīng)；相反，神經(jīng)酰胺和1-磷酸鞘氨醇還分別可抑制ERK和SAPK/JNK信號，表明神經(jīng)酰胺類信息分子與MAPK信息系統(tǒng)均以雙向調(diào)節(jié)的方式從前后二步控制凋亡18。3STAT蛋白：STAT（signal transducer and activator of transcription）蛋白是一類既參與胞質(zhì)中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)又能激活核內(nèi)DNA轉(zhuǎn)錄的雙重功能分子。許多生長因子或細(xì)胞因子

18、如EGF、IFN能通過激活蛋白質(zhì)酪氨酸激酶等再激活STAT，導(dǎo)致基因表達(dá)，調(diào)節(jié)某些細(xì)胞生長增生，也可調(diào)節(jié)另一些細(xì)胞的凋亡。如用EGF或IFN-處理A431、乳腺癌MDA-MB-468等細(xì)胞，均可激活STAT，而活化的STAT既可激活caspase-1基因的表達(dá)，促進(jìn)凋亡，又可引起細(xì)胞周期蛋白（cyclin）抑制劑P21的表達(dá)，阻止生長。因此，STAT也是從正負(fù)雙向調(diào)節(jié)凋亡19。四、結(jié)語以上資料表明，在凋亡反應(yīng)的多個(gè)環(huán)節(jié)中均存在對細(xì)胞凋亡的促進(jìn)與抑制雙向調(diào)節(jié)機(jī)理，而促進(jìn)凋亡的因素必然抑制細(xì)胞生存?？梢哉J(rèn)為，細(xì)胞的凋亡與生存均是受雙向因素平衡調(diào)節(jié)的結(jié)果。因此，凋亡的雙向調(diào)節(jié)機(jī)制與細(xì)胞生存（包括增生

19、、分化、癌變）的機(jī)制密切相關(guān)，在凋亡與細(xì)胞生長、分化、癌變關(guān)系的研究中，既要重視促進(jìn)性因素的影響，也不可忽視抑制性因素作用，同時(shí)探索二者在凋亡相關(guān)疾病中的作用具有十分重要的臨床意義。（本文編輯：常秀青）作者單位：張平（310053 杭州，浙江中醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室）參考文獻(xiàn)1，Peter ME, Heufelder AE, Hengartner MO. Advances in apoptosis research. Proc Natl Acad Sci U S A,1997,94:12736-12737.2，F(xiàn)raser A, Evan G. A license to kill. Cell,19

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