酶組織化學(xué)概論

1、酶組織化學(xué)概論酶組織化學(xué)概論 酶是一種具有催化活性的特殊蛋白酶是一種具有催化活性的特殊蛋白質(zhì)。人體的各種機(jī)能活動(dòng)都與酶的活性質(zhì)。人體的各種機(jī)能活動(dòng)都與酶的活性有密切關(guān)系。有密切關(guān)系。 國(guó)際生物化學(xué)酶學(xué)委員會(huì)已登記的國(guó)際生物化學(xué)酶學(xué)委員會(huì)已登記的酶有酶有22002200多種。但當(dāng)前組織化學(xué)技術(shù)所多種。但當(dāng)前組織化學(xué)技術(shù)所能顯示的酶僅能顯示的酶僅200200多種。多種。 酶組織化學(xué)是用組織化學(xué)的方法證酶組織化學(xué)是用組織化學(xué)的方法證明酶的存在，它的基礎(chǔ)是組織化學(xué)，目明酶的存在，它的基礎(chǔ)是組織化學(xué)，目的在于闡明組織細(xì)胞內(nèi)的化學(xué)反應(yīng)、功的在于闡明組織細(xì)胞內(nèi)的化學(xué)反應(yīng)、功能及其生物學(xué)意義。能及其生物學(xué)意義

2、。一、酶的分類一、酶的分類 1.1.氧化還原酶氧化還原酶 是催化氧化還原反應(yīng)是催化氧化還原反應(yīng)的酶。包括脫氫酶、氧化酶、過氧化物酶的酶。包括脫氫酶、氧化酶、過氧化物酶和加單氧酶。如蘋果酸脫氫酶、黃嘌呤氧和加單氧酶。如蘋果酸脫氫酶、黃嘌呤氧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶與羥化酶或混化酶、谷胱甘肽過氧化物酶與羥化酶或混合功能氧化酶。合功能氧化酶。 2. 2.轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)移酶 即催化功能基團(tuán)轉(zhuǎn)移的即催化功能基團(tuán)轉(zhuǎn)移的酶。此大類可根據(jù)底物中被轉(zhuǎn)移的基團(tuán)酶。此大類可根據(jù)底物中被轉(zhuǎn)移的基團(tuán)性質(zhì)分為性質(zhì)分為8 8個(gè)亞類。其中第個(gè)亞類。其中第6 6亞類為轉(zhuǎn)移亞類為轉(zhuǎn)移含氮基基團(tuán)的酶，如天門冬酸轉(zhuǎn)移酶。含氮基基團(tuán)的酶，如

3、天門冬酸轉(zhuǎn)移酶。 3.3.水解酶水解酶 即催化水解反應(yīng)的酶，即催化水解反應(yīng)的酶，稱為水解酶。水解酶又可根據(jù)其與水解稱為水解酶。水解酶又可根據(jù)其與水解反應(yīng)有關(guān)的鍵的類型進(jìn)一步分為亞酶類，反應(yīng)有關(guān)的鍵的類型進(jìn)一步分為亞酶類，如酯酶、糖酶和肽酶。如酯酶、糖酶和肽酶。 4. 4.裂解酶裂解酶 又稱裂合酶。促進(jìn)一種化又稱裂合酶。促進(jìn)一種化合物分成兩種化合物，或由兩種化合物合合物分成兩種化合物，或由兩種化合物合成一種化合物的酶類。它可使底物移去基成一種化合物的酶類。它可使底物移去基團(tuán)，如團(tuán)，如 H H2 20 0、C0C02 2，并出現(xiàn)雙鍵。此類酶的，并出現(xiàn)雙鍵。此類酶的亞類比較多，一般表示分裂的基團(tuán)，如

4、其亞類比較多，一般表示分裂的基團(tuán)，如其中第中第1 1亞類為裂解亞類為裂解C-CC-C基團(tuán)的酶，如草酰乙基團(tuán)的酶，如草酰乙酸脫羧酶；第酸脫羧酶；第2 2亞類是裂解亞類是裂解C-OC-O基團(tuán)的酶，基團(tuán)的酶，如脫羧酶等。如脫羧酶等。 5. 5.異構(gòu)酶異構(gòu)酶 催化同分異構(gòu)體的相互轉(zhuǎn)催化同分異構(gòu)體的相互轉(zhuǎn)化。磷酸葡萄糖異構(gòu)酶，磷酸丙糖異構(gòu)酶化。磷酸葡萄糖異構(gòu)酶，磷酸丙糖異構(gòu)酶等。等。 6.6.合成酶（又稱連接酶）合成酶（又稱連接酶） 系指能將系指能將兩種物質(zhì)合成為一種物質(zhì)，并必須與兩種物質(zhì)合成為一種物質(zhì)，并必須與ATPATP分解相偶聯(lián)的酶。分解相偶聯(lián)的酶。二、光鏡酶組織化學(xué)證明法二、光鏡酶組織化學(xué)證明法

5、 1 1金屬金屬- -金屬鹽法金屬鹽法 金屬鹽法一般是指金、銀、銅、鐵、金屬鹽法一般是指金、銀、銅、鐵、鋁、鈷等金屬。金屬、金屬鹽及其化合物鋁、鈷等金屬。金屬、金屬鹽及其化合物都具有顏色，容易發(fā)生呈色反應(yīng)。而且酶都具有顏色，容易發(fā)生呈色反應(yīng)。而且酶的分解產(chǎn)物和金屬多半可以結(jié)合。因此，的分解產(chǎn)物和金屬多半可以結(jié)合。因此，捕捉酶反應(yīng)的分解產(chǎn)物，使其與金屬結(jié)合，捕捉酶反應(yīng)的分解產(chǎn)物，使其與金屬結(jié)合，利用其呈色反應(yīng)，再顯現(xiàn)出酶反應(yīng)的部位，利用其呈色反應(yīng)，再顯現(xiàn)出酶反應(yīng)的部位，就可以證明某種酶的存在。就可以證明某種酶的存在。 酶作用于底物后生成的分解產(chǎn)物與底酶作用于底物后生成的分解產(chǎn)物與底物孵育液中的金

6、屬離子相結(jié)合，直接沉著物孵育液中的金屬離子相結(jié)合，直接沉著于酶的反應(yīng)局部，然后使其顯色。其反應(yīng)于酶的反應(yīng)局部，然后使其顯色。其反應(yīng)式如下：式如下： PbPb2+2+ (NH (NH4 4) )2 2S S R-PO R-PO4 4NaNa2 2 + H + H2 2O ROH + PbHPOO ROH + PbHPO4 4 PbS PbS 酶反應(yīng)酶反應(yīng) 顯色顯色 這種方法在底物溶液中的這種方法在底物溶液中的H H+ +濃度為中濃度為中勝或弱酸性，常常可利用易獲得的硝酸鉛勝或弱酸性，常常可利用易獲得的硝酸鉛或醋酸鉛。因此，本法常被應(yīng)用于酸性磷或醋酸鉛。因此，本法常被應(yīng)用于酸性磷酸酶和在中性附近起

7、作用的磷酸酯酶類。酸酶和在中性附近起作用的磷酸酯酶類。通常稱本法為硫化鉛法。通常稱本法為硫化鉛法。 證明堿性磷酸酶時(shí)，通過形成可見的證明堿性磷酸酶時(shí)，通過形成可見的黑色硫化鈷，稱為硫化鈷法。黑色硫化鈷，稱為硫化鈷法。 CaCa2+2+ R-POR-PO4 4NaNa2 2 + H + H2 2O ROH + CaHPOO ROH + CaHPO4 4 酶反應(yīng)酶反應(yīng) CoCo2+2+ （NHNH4 4) )2 2S S CoHPO CoHPO4 4 CoS CoS 金屬置換金屬置換 顯色顯色 用這些金屬鹽法能夠證明的酶多半是用這些金屬鹽法能夠證明的酶多半是水解酶。其中有堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、水

8、解酶。其中有堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、脲酶、酯酶、硫酸酶、碳酸酐酶、膽堿酯脲酶、酯酶、硫酸酶、碳酸酐酶、膽堿酯酶等。此外，根據(jù)磷酸酶的理論，利用組酶等。此外，根據(jù)磷酸酶的理論，利用組織化學(xué)的鑒別法能證明的酶還有磷酰胺酶、織化學(xué)的鑒別法能證明的酶還有磷酰胺酶、5-5-核苷酸酶、核苷酸酶、ATPATP酶、葡萄糖酶、葡萄糖-6-6-磷酸酶磷酸酶等。等。 2 2偶聯(lián)偶氮色素法偶聯(lián)偶氮色素法 偶聯(lián)偶氮色素法，此法又稱偶氮色素偶聯(lián)偶氮色素法，此法又稱偶氮色素法，是指用人工合成的酶底物，在酶的作法，是指用人工合成的酶底物，在酶的作用下，產(chǎn)生分解產(chǎn)物，后者與重氮鹽結(jié)合，用下，產(chǎn)生分解產(chǎn)物，后者與重氮鹽結(jié)合，引起

9、偶聯(lián)偶氮反應(yīng)，使其形成不溶性的偶引起偶聯(lián)偶氮反應(yīng)，使其形成不溶性的偶氮色素，以此證明酶的定位。氮色素，以此證明酶的定位。 在這種方法中，最常用的分解產(chǎn)物是在這種方法中，最常用的分解產(chǎn)物是茶酚系列的化合物，如茶酚系列的化合物，如2-2-萘酚、萘酚、1-1-萘酚、萘酚、萘酚萘酚ASAS、萘酚、萘酚ASAS衍生物等。但這些化合物衍生物等。但這些化合物本身也有一定的溶解性，因而其分解產(chǎn)物本身也有一定的溶解性，因而其分解產(chǎn)物有擴(kuò)散的缺點(diǎn)。有擴(kuò)散的缺點(diǎn)。 基于重氮鹽種類不同，其偶氮顏色也基于重氮鹽種類不同，其偶氮顏色也各有差異，可顯示出藍(lán)色、紫色、紅色、各有差異，可顯示出藍(lán)色、紫色、紅色、褐色、黑色、棕色

10、等各種顏色。褐色、黑色、棕色等各種顏色。 根據(jù)偶聯(lián)的時(shí)間不同，將偶氮色素法根據(jù)偶聯(lián)的時(shí)間不同，將偶氮色素法分為兩種。分為兩種。 1 1）同時(shí)偶聯(lián)法）同時(shí)偶聯(lián)法 同時(shí)偶聯(lián)法是在底同時(shí)偶聯(lián)法是在底物混合液中，通過酶的分解作用所得到的物混合液中，通過酶的分解作用所得到的沉著物，立即形成重氮化合物和偶氮色素。沉著物，立即形成重氮化合物和偶氮色素。 2）后偶聯(lián)法）后偶聯(lián)法 后偶聯(lián)法是為了防止后偶聯(lián)法是為了防止重氮鹽對(duì)酶的抑制作用，先使酶在底物內(nèi)重氮鹽對(duì)酶的抑制作用，先使酶在底物內(nèi)發(fā)生作用，使分解產(chǎn)物沉著，然后再浸漬發(fā)生作用，使分解產(chǎn)物沉著，然后再浸漬于重氮鹽溶液中，使其形成偶氮色素。于重氮鹽溶液中，使其

11、形成偶氮色素。 目前，可用這種方法證明的酶有：目前，可用這種方法證明的酶有：堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、酯酶、堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、酯酶、-葡葡苷酸酶、苷酸酶、-半乳糖苷酶、半乳糖苷酶、-葡糖苷酶、葡糖苷酶、N-N-乙?；阴；?氨基葡糖酶、氨基肽酶、硫氨基葡糖酶、氨基肽酶、硫酸酯酶等等。酸酯酶等等。 3.3.色素形成法色素形成法 （1 1）四唑鹽法）四唑鹽法 四唑鹽法是指含有四唑鹽法是指含有四唑鹽或雙四唑鹽的底物混合液，在脫四唑鹽或雙四唑鹽的底物混合液，在脫氫酶的作用下，從底物分離出來的氫原氫酶的作用下，從底物分離出來的氫原子與無色的四唑鹽或雙四唑鹽相結(jié)合，子與無色的四唑鹽或雙四唑鹽相結(jié)合，形

12、成紅色或藍(lán)色的甲形成紅色或藍(lán)色的甲 （formazanformazan）或）或二甲二甲 （diformazandiformazan）色素。該法主要）色素。該法主要證明各種脫氫酶。證明各種脫氫酶。 （2 2）靛酚藍(lán)法）靛酚藍(lán)法 靛酚藍(lán)法用于檢測(cè)靛酚藍(lán)法用于檢測(cè)氧化酶的方法，把二甲基氧化酶的方法，把二甲基- -對(duì)對(duì)- -苯二胺和苯二胺和- - 萘酚加入底物混合液中，由酶作用萘酚加入底物混合液中，由酶作用而釋放的氧與此二者發(fā)生結(jié)合，形成靛而釋放的氧與此二者發(fā)生結(jié)合，形成靛酚藍(lán)，而顯示出酶的定位。酚藍(lán)，而顯示出酶的定位。 4.4.底物薄膜法底物薄膜法 底物薄膜法是把酶底物在載物片上涂底物薄膜法是把酶底

13、物在載物片上涂成膜，然后再將含酶的組織切片貼附其上，成膜，然后再將含酶的組織切片貼附其上，給以條件讓酶發(fā)生反應(yīng)，使底物分解。接給以條件讓酶發(fā)生反應(yīng)，使底物分解。接著剝離貼附的切片，對(duì)膜進(jìn)行特殊染色，著剝離貼附的切片，對(duì)膜進(jìn)行特殊染色，只有底物被分解的部位不著色，而未被分只有底物被分解的部位不著色，而未被分解的部位被染色，故未著色部位就是酶的解的部位被染色，故未著色部位就是酶的定位定位。三、電鏡酶組織化學(xué)證明法三、電鏡酶組織化學(xué)證明法 1 1氧化還原酶氧化還原酶 （1 1）四唑鹽法）四唑鹽法 四唑鹽是水溶性四唑鹽是水溶性的，在水溶液中幾乎無色，還原后則的，在水溶液中幾乎無色，還原后則難溶于水和脂

14、質(zhì)，變成有色的高電子難溶于水和脂質(zhì)，變成有色的高電子密度的甲密度的甲 ?，F(xiàn)在最常用的四唑鹽有。現(xiàn)在最常用的四唑鹽有NBTNBT和和TNBTTNBT等。等。 （2）高鐵氰化物還原法）高鐵氰化物還原法 本法是金本法是金屬鹽法的一種，高鐵氰化物作為人工受屬鹽法的一種，高鐵氰化物作為人工受氫體而被使用。高鐵氰化物接受由酶作氫體而被使用。高鐵氰化物接受由酶作用而游離出來的氫，從而變成亞鐵氰化用而游離出來的氫，從而變成亞鐵氰化物，此物質(zhì)不溶于水，并以電子密度高物，此物質(zhì)不溶于水，并以電子密度高的亞鐵氰化銅的形式在酶活性部位被捕的亞鐵氰化銅的形式在酶活性部位被捕捉而沉著。捉而沉著。 琥珀酸琥珀酸 延胡索酸延

15、胡索酸 琥珀酸脫氫酶琥珀酸脫氫酶 Fe(CN)Fe(CN)6 63- 3- Fe(CN) Fe(CN)6 64-4- 高鐵氰化物高鐵氰化物 亞鐵氰化物亞鐵氰化物 CuCu2+2+ Cu Cu2 2Fe(CN)Fe(CN)6 6XHXH2 2O O 亞鐵氰化物亞鐵氰化物 （3）二氨基聯(lián)苯胺法）二氨基聯(lián)苯胺法 二氨基聯(lián)苯二氨基聯(lián)苯胺法（胺法（diaminobenzidine method，DAB）法主要用在直接證明細(xì)胞色素氧化酶、法主要用在直接證明細(xì)胞色素氧化酶、過氧化物酶（內(nèi)源性）、過氧化氫酶活過氧化物酶（內(nèi)源性）、過氧化氫酶活性檢測(cè)。性檢測(cè)。DAB還用于形成嗜鋨性多聚體。還用于形成嗜鋨性多聚體

16、。 2.2.水解酶水解酶 （1）膽堿酯酶活性檢查法）膽堿酯酶活性檢查法 1 1）乙硫羧酸法根據(jù)使用的捕捉金屬種類）乙硫羧酸法根據(jù)使用的捕捉金屬種類的不同可有鉛乙硫羥酸法等，在酶的作用下，的不同可有鉛乙硫羥酸法等，在酶的作用下，游離的硫化氫與鉛反應(yīng)，形成硫化鉛沉著于酶游離的硫化氫與鉛反應(yīng)，形成硫化鉛沉著于酶的活性部位。的活性部位。 酯酶酯酶 Pb(NOPb(NO3 3) )2 2 CH CH3 3COSH CHCOSH CH3 3COOH + HCOOH + H2 2S PbSS PbS 2 2）嗜鋨性硫酯法）嗜鋨性硫酯法 是以嗜鋨性硫是以嗜鋨性硫酯作為底物，用堅(jiān)牢藍(lán)酯作為底物，用堅(jiān)牢藍(lán)BBNB

17、BN做偶聯(lián)劑的做偶聯(lián)劑的方法。方法。四、對(duì)照實(shí)驗(yàn)四、對(duì)照實(shí)驗(yàn) 1.1.抑制劑對(duì)照抑制劑對(duì)照 用酶活性的抑制劑確認(rèn)酶活性受到抑制。用酶活性的抑制劑確認(rèn)酶活性受到抑制。 cATP cATP 腺苷腺苷 + Pi+ Pi ATP PPi ATP PPi ADP + Pi ADP + Pi 環(huán)化酶環(huán)化酶ATPATP酶酶四氧嘧啶四氧嘧啶磷酸二酯酶磷酸二酯酶茶堿茶堿特異性底物：特異性底物：5-5-腺苷酰腺苷酰- -亞氨二磷酸亞氨二磷酸 cATP + PNPcATP + PNP（亞氨二磷酸）（亞氨二磷酸）ATP-PNP ATP-PNP 無水解作用無水解作用 環(huán)化酶環(huán)化酶ATPATP酶酶 2. 2.去底物對(duì)照去底物對(duì)照 用去底物的無底物孵育液進(jìn)行反用去底物