一體化層狀梯度修復(fù)體用于骨軟骨組織工程的實(shí)驗(yàn)研究

1、一體化層狀梯度修復(fù)體用于骨軟骨組織工程的實(shí)驗(yàn)研究                   作者：白雪東，胡蘊(yùn)玉，嚴(yán)樂平，任力，吳剛，李丹，孫效棠，白建萍【摘要】  目的探索膠原/殼聚糖/納米?擦姿崛?鈣一體化層狀梯度修復(fù)體在組織工程中用作骨軟骨缺損修復(fù)的可行性。方法以型膠原、殼聚糖、納米?擦姿崛?鈣（?TCP）為基本原料，采用無毒交聯(lián)并通過冷凍干燥法成型；掃描電鏡觀察，測定支架材料的孔徑、孔隙率以及交通孔情況；

2、分離擴(kuò)增兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC），將BMSC接種于材料上，掃描電鏡觀察細(xì)胞在材料上的黏附狀態(tài)，MTT法測定細(xì)胞在材料上的生長曲線；以軟骨誘導(dǎo)液體外誘導(dǎo)細(xì)胞?倉芨春銜鏘蛉砉欠只?，2周后植入自體股部肌袋，6周取材，HE、甲苯胺藍(lán)染色、型膠原免疫組化鑒定誘導(dǎo)分化效果。結(jié)果材料疏松多孔，孔徑大于100m，孔隙率大于95。細(xì)胞在材料上黏附狀態(tài)良好，并且增殖迅速。BMSC?膊牧細(xì)春咸寰?體外三維誘導(dǎo)后可在自體異位向軟骨分化。 結(jié)論型膠原/殼聚糖/納米TCP一體化層狀梯度修復(fù)體具有良好的孔隙結(jié)構(gòu)和生物相容性，有望成為一種新型的組織工程支架材料用于骨軟骨缺損修復(fù)。 【關(guān)鍵詞】  組織工程；

3、骨軟骨； 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞； 膠原； 納米?擦姿崛?鈣    Abstract：ObjectiveTo explore the potential of a novel collagen I / chitosan /Nano?tricalcium phosphate(?TCP)bilayered scaffold for being used in tissue engineering(TE)of osteochondral repair.MethodBilayered scaffolds were produced with collagen ,chitosan

4、 and?TCP,using a special cross?linking and freeze drying method.The pore size,porosity and interpores of the scaffold were observed by scanning electron microscopy(SEM).Rabbit bone mesenchymal stem cells （BMSC）were isolated and amplified,then inoculated onto the scaffold.By SEM scanning,the conditio

5、n of the cells adhering onto the scaffold was observed.The proliferation of the cells on the scaffolds was examined using MTT method,and the growth curve was drawn.The cell?scaffold composite were then induced to differentiate towards cartilage by 3?D culturing,and then implanted into muscle pouches

6、 2 weeks later.The result was observed 6 weeks later by HE staining,toluidine blue staining and type collagen immunohistochemistry.ResultThe scaffold possessed high porosity and proper pore size,the porosity was above 95%.BMSC could adhere onto the scaffold well,and the proliferation rate of the cel

7、ls on the scaffolds was perfectly good.After in vitro induction,BMSC?scaffold composite can differentiate toward cartilage ectopicly.ConclusionThe novel collagen I / chitosan /?TCP bilayered scaffold possesses good pore structure and biocompatibility,and will possibly become a new biomaterial of TE

8、used for osteochondral repair.    Key words：tissue engineering(TE);  osteochondral;  bone mesenchymal stem cells(BMSC);  collagen;  Nano?tricalcium    組織工程學(xué)的發(fā)展為軟骨損傷修復(fù)提供了新的方法，可有效地解決移植物來源以及供區(qū)損傷問題，并且移植物可以在體外任意塑形，以適應(yīng)損傷部位的需要1。軟骨缺損的修復(fù)包含2個(gè)主要方面：（1）以功能性修復(fù)組織填充

9、缺損；（2）修復(fù)組織與周圍宿主軟骨和骨的整合2。目前軟骨組織工程中存在的一個(gè)突出問題是移植物與宿主組織間缺乏穩(wěn)固的錨定，單純依賴軟骨?踩砉墻緱嫖醯牧?接往往難于達(dá)到滿意的修復(fù)效果3。    為有效解決移植物與宿主組織的整合問題，作者研制了一種新型組織工程骨軟骨一體化材料膠原/殼聚糖/?TCP一體化層狀梯度修復(fù)體。該材料在結(jié)構(gòu)上分為上層的軟骨部分和下層的軟骨下骨部分，但整個(gè)材料一體化交聯(lián)，避免了軟骨與骨部分在修復(fù)過程中分離。憑借骨組織之間快速而牢固的整合，有望使整個(gè)修復(fù)體在早期穩(wěn)固地錨定于缺損區(qū)，為關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)提供良好的穩(wěn)定性和機(jī)械支持。  &

10、#160; 本實(shí)驗(yàn)對該組織工程骨軟骨一體化修復(fù)體的一般性能以及體外生物相容性進(jìn)行了研究，并且通過體外誘導(dǎo)以及自體異位實(shí)驗(yàn)初步探討其用于組織工程骨軟骨損傷修復(fù)的可行性。    1  材料和方法    1.1  膠原/殼聚糖/納米TCP一體化層狀梯度修復(fù)體的研制    支架材料由華南理工大學(xué)生物材料研究所研制提供，以型膠原、殼聚糖為基材,與具有良好生物活性的?TCP粉體共混交聯(lián)，經(jīng)冷凍干燥成型。上層為膠原/殼聚糖，下層為膠原/殼聚糖/?TCP，無機(jī)粉體含量由下到上呈梯度變化。 &

11、#160;  1.2   支架材料的形態(tài)和孔隙率    以排水法測材料的孔隙率，掃描電鏡觀察材料的孔隙大小以及孔隙貫通情況。    1.3   MTT法測細(xì)胞在支架材料上的增殖活性    取3個(gè)月齡日本大耳白兔，體重2.1 kg，常規(guī)麻醉消毒后自脛骨平臺下0.5 cm處以18號穿刺針穿刺，兩側(cè)各抽取骨髓23 ml，小心加入預(yù)裝有等體積percoll工作液（密度1.073）的離心管，以2 000r/min離心25 min后收集有核細(xì)胞層，重懸于含10新生牛血

12、清（GIBCO）的高糖DMEM培養(yǎng)液中，接種于100 ml培養(yǎng)瓶，于37 、體積分?jǐn)?shù)為5 CO2的孵箱中培養(yǎng)。3 d后首次換液，以后每23 d換液，待原代細(xì)胞80%鋪滿瓶底時(shí)傳代。    取第2代細(xì)胞，胰酶消化后制成3.0×105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液。在48孔板內(nèi)放置20塊同等型號的材料，以滴注法將細(xì)胞懸液接種于材料，每塊材料150 l；另將5塊材料以單純培養(yǎng)液滴注用做對照。培養(yǎng)箱內(nèi)靜置4 h后，每孔加入培養(yǎng)液700 l以充分覆蓋材料，18h待細(xì)胞完全貼壁后，將復(fù)合有細(xì)胞的材料轉(zhuǎn)移至新孔，每孔加培養(yǎng)液1.5 ml，以后每2 d給予換液。分別在轉(zhuǎn)孔后第2、4

13、、6、9和12 d隨機(jī)選取3塊復(fù)合細(xì)胞的材料和1塊對照材料，每孔加入700 l培養(yǎng)液和70 l 5 mg/ml的MTT溶液，于培養(yǎng)箱內(nèi)4 h后吸棄各孔內(nèi)液體，并在各孔加入700 l DMSO，微量振蕩器上振蕩10 min后，每孔吸取150 l液體加入96孔板用作檢測。選擇492 nm波長，以對照孔調(diào)零，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸收值。以時(shí)間點(diǎn)為橫坐標(biāo)，各時(shí)間點(diǎn)MTT均值為縱坐標(biāo)繪制生長曲線。    1.4   掃描電鏡觀察細(xì)胞在材料上的黏附狀態(tài)    將細(xì)胞懸液以3.0×105個(gè)/ml的密度接種于支架

14、材料，置24孔板內(nèi)培養(yǎng)12 d后以3%的戊二醛固定，梯度酒精脫水，叔丁醇置換，真空干燥，離子噴射儀噴金，掃描電鏡下觀察細(xì)胞在材料表面及內(nèi)部的黏附形態(tài)。    1.5   MSCs在支架材料上的誘導(dǎo)分化    取3個(gè)月齡日本大耳白兔，體重22.5 kg，依上述方法分離擴(kuò)增兔BMSC。取第2代細(xì)胞，消化后配成2×106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液在24孔板內(nèi)接種于支架材料，每塊材料150 l，于培養(yǎng)箱內(nèi)靜置4 h后，加2 ml培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后將材料轉(zhuǎn)移至新孔，并將培養(yǎng)液更換為以高糖DMEM配制的成

15、軟骨誘導(dǎo)液(含rhTGF1 10g/L，地塞米松1×107 mol/L，VitC 50 g/L，新生牛血清100 ml/L)，以后每2 d換液。持續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)14d后，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物常規(guī)麻醉消毒，分別切開股部皮膚、皮下及筋膜，沿肌纖維走行鈍性制造肌袋。左側(cè)植入空白載體為對照側(cè)；右側(cè)植入經(jīng)誘導(dǎo)的細(xì)胞-支架復(fù)合體為實(shí)驗(yàn)側(cè)。術(shù)后6周后取材，制成石蠟切片行HE、甲苯胺藍(lán)染色和型膠原免疫組化鑒定軟骨分化情況。    2   結(jié)  果    2.1   材料的形態(tài)和孔隙率  

16、;  SEM可以觀察到支架材料具有疏松多孔結(jié)構(gòu)，孔隙結(jié)構(gòu)規(guī)則，孔徑約100150 m，材料內(nèi)部孔與孔之間貫通良好（圖1）；納米TCP被包裹在修復(fù)體表面，兩者結(jié)合緊密，顆粒分布均勻（圖2）。通過排水法測定材料的孔隙率大于95%。     2.2   細(xì)胞在材料上的黏附狀態(tài)和增殖曲線    SEM顯示BMSC在材料上經(jīng)三維培養(yǎng)14 d后生長狀態(tài)良好，細(xì)胞成片地黏附于支架表面及孔隙側(cè)壁,并可見細(xì)胞間通過突起相互連接成片（圖3）。    圖1支架內(nèi)部孔隙結(jié)構(gòu)(SEM×100

17、)  圖2包裹-TCP的支架表面(SEM×2 000)  圖3細(xì)胞在材料表面的黏附形態(tài)（SEM×500）    BMSC在材料上增殖迅速，三維培養(yǎng)12 d，MTT值由2 d時(shí)的0.255上升至1.557，細(xì)胞基本呈現(xiàn)對數(shù)生長趨勢，其中46 d、912 d期間增殖最為顯著（P0.05）；但69 d期間增殖不顯著(P0.05)（圖4）。    2.3  MSC?倉蘢蘊(yùn)逡煳懷扇砉鞘笛?    術(shù)后2周可在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部位觸及質(zhì)韌小結(jié)節(jié)，以后實(shí)驗(yàn)側(cè)結(jié)節(jié)逐漸變硬，而對照

18、側(cè)則無明顯變化。實(shí)驗(yàn)側(cè)支架材料經(jīng)過體外培養(yǎng)2周、體內(nèi)6周后大部分降解，但仍可見殘留支架的輪廓（深紅染色），支架孔隙內(nèi)充填成團(tuán)的類軟骨組織，未見明顯炎癥反應(yīng)（圖5）。甲苯胺藍(lán)染色見材料內(nèi)部大量異染組織，細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)均有明顯著色（圖6）。型膠原免疫組化可見新生組織呈陽性反應(yīng)（圖7）。    3  討  論    支架材料是組織工程研究中的重要課題，理想的軟骨組織工程支架材料應(yīng)具備以下特點(diǎn)：（1）良好的生物相容性，其本身或降解產(chǎn)物對種子細(xì)胞和機(jī)體無毒性，不會引起炎癥和免疫排斥反應(yīng)；（2）適宜的生物降解性，降解速度需和

19、組織再生速度相匹配，最后可完全吸收；（3）良好的結(jié)構(gòu)相容性，具有一定的強(qiáng)度和可塑性,能保持穩(wěn)定的三維立體結(jié)構(gòu)，多孔的三維支架應(yīng)具有互相連通的孔隙，以利于營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的擴(kuò)散?？紫堵试?5%以上，孔徑大小適當(dāng)，為種子細(xì)胞的均勻分布和生長提供足夠的空間；（4）良好的表面相容性和一定的生物活性，材料表面有利于種子細(xì)胞的黏附與生長4。作者所應(yīng)用的組織工程骨軟骨支架材料以細(xì)胞相容性良好的型膠原、殼聚糖為主體，通過特殊設(shè)計(jì)的交聯(lián)凍干技術(shù)，使支架材料在一體化的前提下將納米TCP粉體均勻的混于材料的下層，借以發(fā)揮其促進(jìn)成骨的作用。實(shí)驗(yàn)證明支架材料具有良好的孔隙結(jié)構(gòu)和孔隙率，無細(xì)胞毒性并且有利于附著的種子細(xì)

20、胞增殖，為體外進(jìn)行三維培養(yǎng)奠定了基礎(chǔ)。生長曲線上（圖4）第69 d細(xì)胞增殖不明顯，分析原因可能是隨著細(xì)胞數(shù)量的增加，其對營養(yǎng)的需求量亦增加，1.5 ml/2d的換液量已遠(yuǎn)不能滿足大量細(xì)胞增殖的需要，從而導(dǎo)致細(xì)胞因缺乏營養(yǎng)供應(yīng)而增殖受限；以后改為每日換液，到第12 d時(shí)MTT值迅速上升。材料亦具有良好的降解性能，體外培養(yǎng)2周后材料的大體形狀以及孔隙結(jié)構(gòu)基本保持不變，而體內(nèi)6周后則大部分降解，但材料的基本輪廓依然保存，基本滿足組織工程對材料降解性能的要求。    圖5細(xì)胞支架復(fù)合物植入肌袋6周（HE染色×100）  圖6細(xì)胞支架復(fù)合物植入肌袋6周（

21、甲苯胺藍(lán)染色×200）  圖7細(xì)胞支架復(fù)合物植入肌袋6周，型膠原免疫組化（×400）    由于軟骨細(xì)胞來源受限并且存在供區(qū)損傷等一系列不利因素，故本實(shí)驗(yàn)采用BMSC作為種子細(xì)胞。自體BMSC取材方便,不存在免疫排斥反應(yīng),同時(shí)具有體外擴(kuò)增能力強(qiáng)、自我更新快、多向分化潛能等特點(diǎn)，是骨軟骨組織工程最為理想的種子細(xì)胞5。BMSC不但可在體外誘導(dǎo)為軟骨細(xì)胞或骨細(xì)胞，還可在體內(nèi)受不同的生長環(huán)境刺激分化為軟骨或骨6。BMSC向軟骨或成骨方向分化需要特定的培養(yǎng)條件,雖然平面培養(yǎng)及三維培養(yǎng)條件下均可成功誘導(dǎo)BMSC向軟骨細(xì)胞分化，但合適三維培養(yǎng)條件下

22、更有利于軟骨或骨表型的維持7。本實(shí)驗(yàn)分離擴(kuò)增了成年兔BMSC，將其與支架材料復(fù)合進(jìn)行體外三維培養(yǎng)，證實(shí)了材料具有很好的生物相容性，適合于BMSC的生長增殖；進(jìn)而對細(xì)胞材料復(fù)合物進(jìn)行三維成軟骨誘導(dǎo)，證實(shí)了在適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)條件下，材料上的細(xì)胞可向軟骨分化。由于納米TCP具有良好的生物降解性和骨傳導(dǎo)性，納米TCP/膠原復(fù)合體被認(rèn)為是最能滿足骨組織工程需要的支架材料之一8。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)支架材料體外培養(yǎng)2周后下層的TCP粉體發(fā)生明顯礦化，其在本研究中成骨方面的作用尚有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)，但已有文獻(xiàn)表明，納米磷酸三鈣不僅可作為BMSC的細(xì)胞骨架,而且還可以加速骨的形成910。    結(jié)

23、論：膠原/殼聚糖/納米?擦姿崛?鈣一體化層狀梯度修復(fù)體具有良好的物理性能和生物相容性，適合于BMSC三維誘導(dǎo)培養(yǎng)，有望成為一種新型組織工程支架材料用于骨軟骨損傷修復(fù)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 Ivan M，Sylvie M,Andrea B，et al.Osteochondral tissue engineeringJ.Journal of Biomechanics,2007,40:750?765.2 Kenneth R,Gratza,Van W.Biomechanical assessment of tissue retrieved after in vivo cartilage def

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