免疫熒光檢測Reg

1、免疫熒光檢測 Reg- 與 PML 的定位為例1. 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?通過免疫熒光檢測 Reg- 與 PML是否存在共定位2. 實(shí)驗(yàn)原理： 細(xì)胞內(nèi)的蛋白可通過特異性的抗體識別，帶有熒光基團(tuán)的二抗識別一抗從而放大信號，用特定的激發(fā)波長激發(fā)熒光基團(tuán)可觀察被檢蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位或者表達(dá)情況。 不同種屬來源的不同抗體可識別兩個(gè) （理論上可多個(gè)）抗體，再用相應(yīng)的帶有不同熒光基團(tuán)的二抗去識別各自的一抗，可觀察到兩個(gè)蛋白之間的定位情況。3. 實(shí)驗(yàn)過程：（1）各實(shí)驗(yàn)組取 2000030000 個(gè)細(xì)胞，用 1640 補(bǔ)齊各組的體積于100-200 l ，1000rpm，5min 甩片，用鉛筆標(biāo)記各處理組。（2）稍晾干

2、細(xì)胞，用阻水筆畫圈，圈中滴滿預(yù)冷的4的多聚甲醛，室溫固定 10min。（3）預(yù)冷的 PBS 洗去多聚甲醛，將載玻片浸沒于甲醇中，室溫透化10min。（4）預(yù)冷的 PBS 洗去甲醇，將載玻片放入濕盒中，2的 BSA 室溫封閉 2h。（5）吸去 BSA ，加入配制于 2的 BSA 中的一抗， 50 l/片，放入濕盒，冷庫過夜或者室溫 2h。（6）吸去一抗， PBS 洗 3 次，每次 5min（7）加入配制于 2的 BSA 中的二抗， 50 l/ 片，放入濕盒，避光。室溫孵育2h。（8）吸去一抗， PBS 洗 3 次，每次 5min，注意避光。（9）吸去 PBS，DAPI 室溫染色 35min。（1

3、0）PBS 吸去游離的 DAPI ，加入抗淬滅劑， 10 l/ 片，指甲油封片。（11）濕盒避光冷藏或者鏡檢。4. 實(shí)驗(yàn)實(shí)例及注意事項(xiàng)：（1）整個(gè)過程中注意保持載玻片在一個(gè)潮濕的環(huán)境中，不能讓細(xì)胞區(qū)域太干燥。（2）從加入熒光基團(tuán)開始應(yīng)注意避光，一抗如帶有熒光基團(tuán)應(yīng)從加入一抗后避光。檢測活細(xì)胞狀態(tài)下標(biāo)記的熒光物質(zhì)應(yīng)從一開始進(jìn)行避光。（3）注意二抗的種屬來源， 二抗之間不可有反應(yīng)， 否則無法判斷二者之間的共定位。（4）不宜過長時(shí)間冷場片子，做完后盡早鏡檢。（5）鏡檢時(shí)不宜長時(shí)間對一塊區(qū)域長時(shí)間激發(fā)。（6）共聚焦顯微鏡觀察時(shí)不一定要用指甲油封片（指甲油掉在共聚焦的鏡頭上老師會不高興），應(yīng)加入抗淬滅劑

4、后，改上蓋玻片后及時(shí)去拍片。（7）Reg- 與 PML 的共定位5. 實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑的配制：（1）實(shí)驗(yàn)中的 buffer 為普通的 PBS， PH7.4,實(shí)驗(yàn)前可在冰箱預(yù)冷。（2）一抗配制時(shí)可根據(jù)看體的效價(jià)調(diào)整， 一般是 1：50 1：200，實(shí)驗(yàn)中的 PML（SantaCruz）、 Reg- （華師大李曉濤）均為1： 100。二抗（國產(chǎn)，康陳生物，mouse-Rho,rabbit-Fitc），抗淬滅劑（ Vector, Laboratories, Inc, CA），DAPI（Sigma）, 多聚甲醛（鼎國），甲醇（國藥）。6. 附錄：（1）用貼壁細(xì)胞實(shí)驗(yàn)時(shí)，可在接種時(shí)放入滅菌的蓋玻片進(jìn)行爬片，處理結(jié)束