蛋白質(zhì)核酸沉淀楊

1、沉淀分離技術(shù)沉淀分離技術(shù)第三章第三章n沉淀和結(jié)晶的區(qū)別沉淀和結(jié)晶的區(qū)別: 形態(tài)形態(tài) 成分純度成分純度n 結(jié)晶結(jié)晶:同類分子或離子以規(guī)則排列形式析出；同類分子或離子以規(guī)則排列形式析出；n 沉淀沉淀:無序析出，純度遠低于結(jié)晶。無序析出，純度遠低于結(jié)晶。n操作方式可分操作方式可分連續(xù)法連續(xù)法或或間歇法間歇法兩種，規(guī)模較小時，常兩種，規(guī)模較小時，常采用間歇法。采用間歇法。n生物分子在水中形成穩(wěn)定的溶液是有條件的，這生物分子在水中形成穩(wěn)定的溶液是有條件的，這些就是溶液的各種理化參數(shù)。些就是溶液的各種理化參數(shù)。n任何能夠影響這些條件的因素都會破壞溶液的穩(wěn)任何能夠影響這些條件的因素都會破壞溶液的穩(wěn)定性。定性

2、。n沉淀法就是沉淀法就是采用適當?shù)拇胧└淖內(nèi)芤旱睦砘瘏?shù)，采用適當?shù)拇胧└淖內(nèi)芤旱睦砘瘏?shù)，控制溶液的各種成分的溶解度控制溶液的各種成分的溶解度，從而將溶液中的，從而將溶液中的欲提取的成分和其它成分分開的技術(shù)。欲提取的成分和其它成分分開的技術(shù)。n沉淀法操作步驟沉淀法操作步驟 ：加入沉淀劑。加入沉淀劑。沉淀劑的陳化，促進粒子生長；沉淀劑的陳化，促進粒子生長；離心或過濾，收集沉淀物。離心或過濾，收集沉淀物。n加沉淀劑的方式和陳化條件對產(chǎn)物的純度、加沉淀劑的方式和陳化條件對產(chǎn)物的純度、收率和沉淀物的形狀都有很大影響。收率和沉淀物的形狀都有很大影響。 沉淀能否發(fā)生；沉淀能否發(fā)生； 沉淀劑或沉淀條件下對

3、活性結(jié)構(gòu)是否有破壞作用；沉淀劑或沉淀條件下對活性結(jié)構(gòu)是否有破壞作用； 沉淀劑是否容易除去；沉淀劑是否容易除去； 用于食品、醫(yī)藥產(chǎn)品的沉淀劑是否對人體有害。用于食品、醫(yī)藥產(chǎn)品的沉淀劑是否對人體有害。沉淀過程應(yīng)考慮的問題沉淀過程應(yīng)考慮的問題：n 沉淀技術(shù)分離生化產(chǎn)物的典型例子是沉淀技術(shù)分離生化產(chǎn)物的典型例子是蛋白質(zhì)的分離提取蛋白質(zhì)的分離提取 優(yōu)點優(yōu)點：設(shè)備簡單、成本低、原材料易得、：設(shè)備簡單、成本低、原材料易得、 便于小批量生產(chǎn)；便于小批量生產(chǎn)； 缺點缺點：所得沉淀物可能聚集有多種物質(zhì)，：所得沉淀物可能聚集有多種物質(zhì)， 或含有大量的鹽類，或包裹著溶劑，或含有大量的鹽類，或包裹著溶劑， 產(chǎn)品純度常比

4、結(jié)晶法低，產(chǎn)品純度常比結(jié)晶法低， 過濾也較困難。過濾也較困難。eg. 從血漿中通過從血漿中通過5步沉淀生產(chǎn)純度高達步沉淀生產(chǎn)純度高達99%的免疫球蛋白的免疫球蛋白和和96%99%的白蛋白。的白蛋白。圖圖1 利用蛋白質(zhì)沉淀大規(guī)模提純白蛋白與免疫球蛋白的工藝流程圖利用蛋白質(zhì)沉淀大規(guī)模提純白蛋白與免疫球蛋白的工藝流程圖n 沉淀法分離蛋白質(zhì)的特點：沉淀法分離蛋白質(zhì)的特點：u生產(chǎn)前期可使原料液體體積很快減小生產(chǎn)前期可使原料液體體積很快減小1050倍，從而倍，從而簡化生產(chǎn)工藝、降低生產(chǎn)費用簡化生產(chǎn)工藝、降低生產(chǎn)費用；u使中間產(chǎn)物保持在一個使中間產(chǎn)物保持在一個中性溫和的環(huán)境中性溫和的環(huán)境；u可及早將目標蛋白

5、從其與蛋白水解酶混合液中分離出可及早將目標蛋白從其與蛋白水解酶混合液中分離出來，來，避免蛋白質(zhì)的降解，提高產(chǎn)物穩(wěn)定性避免蛋白質(zhì)的降解，提高產(chǎn)物穩(wěn)定性；u用蛋白質(zhì)沉淀法作為色譜分離的前處理技術(shù)，可用蛋白質(zhì)沉淀法作為色譜分離的前處理技術(shù)，可使色使色譜分離使用的限制因素降低到最少譜分離使用的限制因素降低到最少。3.2 蛋白質(zhì)的溶解特性蛋白質(zhì)的溶解特性n蛋白質(zhì)的溶解行為是一個獨特的性質(zhì)，由其組成、蛋白質(zhì)的溶解行為是一個獨特的性質(zhì)，由其組成、構(gòu)象以及分子周圍的環(huán)境所決定。構(gòu)象以及分子周圍的環(huán)境所決定。n蛋白質(zhì)在自然環(huán)境中通常是可溶的，所以其大部蛋白質(zhì)在自然環(huán)境中通常是可溶的，所以其大部分是親水的，但其內(nèi)

6、部大部分是疏水的。分是親水的，但其內(nèi)部大部分是疏水的。n一般而言，小分子蛋白質(zhì)比起在化學上類似的大一般而言，小分子蛋白質(zhì)比起在化學上類似的大分子蛋白質(zhì)更易溶解。分子蛋白質(zhì)更易溶解。圖圖2 蛋白質(zhì)分子表面的憎水區(qū)域和荷電區(qū)域蛋白質(zhì)分子表面的憎水區(qū)域和荷電區(qū)域蛋白質(zhì)性質(zhì)蛋白質(zhì)性質(zhì)溶液性質(zhì)溶液性質(zhì)分子大小分子大小溶劑可利用度（如：水）溶劑可利用度（如：水）氨基酸組成氨基酸組成 pH值值氨基酸序列氨基酸序列離子強度離子強度可離子化的殘基數(shù)可離子化的殘基數(shù)溫度溫度極性極性/非極性殘基比率非極性殘基比率極性極性/非極性殘基分布非極性殘基分布氨基酸殘基的化學性質(zhì)氨基酸殘基的化學性質(zhì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)

7、電性蛋白質(zhì)電性化學鍵性質(zhì)化學鍵性質(zhì)表表1 影響蛋白質(zhì)溶解度的參數(shù)影響蛋白質(zhì)溶解度的參數(shù)3.3 蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性防止蛋白質(zhì)凝聚沉淀的屏障：防止蛋白質(zhì)凝聚沉淀的屏障：蛋白質(zhì)周圍的水化層（蛋白質(zhì)周圍的水化層（hydration shell)hydration shell)可可以使蛋白質(zhì)形成穩(wěn)定的膠體溶液。以使蛋白質(zhì)形成穩(wěn)定的膠體溶液。蛋白質(zhì)分子間靜電排斥作用。（存在雙電層）蛋白質(zhì)分子間靜電排斥作用。（存在雙電層） 因此，可通過降低蛋白質(zhì)周圍的水化層和因此，可通過降低蛋白質(zhì)周圍的水化層和雙電層厚度（雙電層厚度（電位）降低蛋白質(zhì)溶液的穩(wěn)電位）降低蛋白質(zhì)溶液的穩(wěn)定性，實現(xiàn)蛋白質(zhì)

8、的沉淀。定性，實現(xiàn)蛋白質(zhì)的沉淀。其他沉淀法其他沉淀法金屬沉淀法金屬沉淀法聚電解質(zhì)沉淀法聚電解質(zhì)沉淀法非離子型聚合物沉淀法非離子型聚合物沉淀法3.4 蛋白質(zhì)沉淀方法蛋白質(zhì)沉淀方法有機溶劑沉淀法有機溶劑沉淀法等電點沉淀法等電點沉淀法中性鹽鹽析法中性鹽鹽析法一、中性鹽沉淀法（鹽析法）一、中性鹽沉淀法（鹽析法）鹽濃度鹽濃度Salting-in溶解度溶解度Salting-out 蛋白質(zhì)和酶均易溶于水，分子中的蛋白質(zhì)和酶均易溶于水，分子中的COOH、NH2和和OH等親水基團，與極性水分子相互作用形成水化層，等親水基團，與極性水分子相互作用形成水化層，包圍于蛋白質(zhì)分子周圍形成包圍于蛋白質(zhì)分子周圍形成，削弱了

9、蛋白質(zhì)分子，削弱了蛋白質(zhì)分子之間的作用力，之間的作用力，蛋白質(zhì)分子表面極性基團越多，水化層越蛋白質(zhì)分子表面極性基團越多，水化層越厚，蛋白質(zhì)分子與溶劑分子之間的親和力越大，因而溶解厚，蛋白質(zhì)分子與溶劑分子之間的親和力越大，因而溶解度也越大度也越大。 1、中性鹽沉淀蛋白質(zhì)的基本原理、中性鹽沉淀蛋白質(zhì)的基本原理親水膠體在水中的穩(wěn)定因素親水膠體在水中的穩(wěn)定因素 等點電時的蛋白質(zhì)等點電時的蛋白質(zhì)（親水膠體）（親水膠體）帶負電荷蛋白質(zhì)帶負電荷蛋白質(zhì)（親水膠體）（親水膠體）脫水脫水脫水脫水脫水脫水帶負電荷蛋白質(zhì)帶負電荷蛋白質(zhì)（疏水膠體）（疏水膠體）不穩(wěn)定蛋白顆粒不穩(wěn)定蛋白顆粒陰離子陰離子陽離子陽離子堿堿酸酸

10、酸酸蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)聚集聚集沉淀沉淀帶正電荷蛋白質(zhì)帶正電荷蛋白質(zhì)（親水膠體）（親水膠體）堿堿水化膜水化膜帶正電荷蛋白質(zhì)帶正電荷蛋白質(zhì)（疏水膠體）（疏水膠體）由于中性鹽的親水性大于蛋白質(zhì)由于中性鹽的親水性大于蛋白質(zhì)和酶分子的親水性，所以加入大和酶分子的親水性，所以加入大量中性鹽后，量中性鹽后，奪走了水分子奪走了水分子，破，破壞了水化膜，暴露出疏水區(qū)域。壞了水化膜，暴露出疏水區(qū)域。同時又同時又中和了電荷中和了電荷，破壞了親水，破壞了親水膠體，蛋白質(zhì)分子即形成沉淀。膠體，蛋白質(zhì)分子即形成沉淀。選用鹽析用鹽的幾點考慮：選用鹽析用鹽的幾點考慮：n鹽析作用要強鹽析作用要強n鹽析用鹽需有較大的溶解度鹽析用鹽需有

11、較大的溶解度n鹽析用鹽必須是惰性的鹽析用鹽必須是惰性的n來源豐富、經(jīng)濟來源豐富、經(jīng)濟2、中性鹽的選擇、中性鹽的選擇陰離子：陰離子： 檸檬酸根檸檬酸根-3酒石酸根酒石酸根-3 F-I03-H2P04-S04-CH3C00-Cl-Cl03-Br-N03-Cl04-I-CNS-陽離子：陽離子： Th4+Al3+H+Ba2+Sr2+Ca2+Cs+Rb+NH4+K+Na+Li+ Hofmeister對一系列離子沉淀蛋白質(zhì)的能力對一系列離子沉淀蛋白質(zhì)的能力進行排序，稱進行排序，稱Hofmeister序列序列，或感膠離子序。，或感膠離子序。 常用于蛋白質(zhì)沉淀的鹽為硫酸銨和硫酸鈉。常用于蛋白質(zhì)沉淀的鹽為硫酸銨

12、和硫酸鈉。硫酸鈉硫酸鈉雖無腐雖無腐蝕性但蝕性但低于低于40400 0C C就不易溶解就不易溶解，因此只適用于熱穩(wěn)定性較好的蛋，因此只適用于熱穩(wěn)定性較好的蛋白質(zhì)的沉淀過程。白質(zhì)的沉淀過程。02080100 （NH4)2SO470.675.495.3103Na2SO44.918.943.342.2NaH2PO41.67.893.8101（1）溶解度大）溶解度大（2）分離效果好）分離效果好（3）不易引起變性，有穩(wěn)定酶與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用。）不易引起變性，有穩(wěn)定酶與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用。（4）價格便宜，廢液不污染環(huán)境。）價格便宜，廢液不污染環(huán)境。最常用的鹽：最常用的鹽：硫酸銨硫酸銨緩沖能力弱，具腐蝕性，含緩

13、沖能力弱，具腐蝕性，含N（1）加入固體鹽法）加入固體鹽法3、 鹽析的操作方法鹽析的操作方法適用：飽和度高，不增大溶液體積適用：飽和度高，不增大溶液體積加入硫酸銨固體的量：查表、計算加入硫酸銨固體的量：查表、計算飽和度飽和度： 在給定條件下以可能達到的最大濃度的百分數(shù)表示的鹽在給定條件下以可能達到的最大濃度的百分數(shù)表示的鹽濃度。濃度。（1）加入固體鹽法）加入固體鹽法2025g ：加入固體硫酸銨的質(zhì)量：加入固體硫酸銨的質(zhì)量S2：所需達到的硫酸銨飽和度：所需達到的硫酸銨飽和度S1：原溶液的硫酸銨飽和度：原溶液的硫酸銨飽和度適用：蛋白質(zhì)溶液體適用：蛋白質(zhì)溶液體積不大，所需調(diào)整的積不大，所需調(diào)整的硫酸銨

14、濃度不高。硫酸銨濃度不高。 V：所需加進的飽和硫酸銨溶液的體積；：所需加進的飽和硫酸銨溶液的體積；V0：原溶液體積；：原溶液體積；S2：所需達到的硫酸銨飽和度；：所需達到的硫酸銨飽和度；S1：原溶液的硫酸銨飽和度。：原溶液的硫酸銨飽和度。 飽和硫酸銨的配制方法飽和硫酸銨的配制方法 在一定量的水中加入在一定量的水中加入過量的硫酸銨，加熱至過量的硫酸銨，加熱至50506060，趁熱濾去沉淀，趁熱濾去沉淀，再在再在00或室溫平衡或室溫平衡1 12 2天，有固體析出時達天，有固體析出時達100100飽和度。飽和度。 優(yōu)點優(yōu)點 硫酸銨濃度變化連硫酸銨濃度變化連續(xù)，鹽析效果較好。續(xù)，鹽析效果較好。缺點缺點

15、 硫酸銨飽和度的測硫酸銨飽和度的測定、計算工作手續(xù)繁定、計算工作手續(xù)繁瑣，而且透析袋容積瑣，而且透析袋容積有限、鹽析速度慢、有限、鹽析速度慢、硫酸銨耗費大。硫酸銨耗費大。 （3）透析平衡法）透析平衡法 方法一方法一：取料液分成等體積幾份，冷卻至：取料液分成等體積幾份，冷卻至004、鹽析曲線的制作、鹽析曲線的制作 各級均離心分離沉淀物，將沉淀溶于各級均離心分離沉淀物，將沉淀溶于2 2倍體積的緩沖液中，測倍體積的緩沖液中，測定其中定其中總蛋白總蛋白和和目標蛋白目標蛋白濃度（或測定離心上清液）濃度（或測定離心上清液）以飽和度為橫坐標，沉淀（或上清液）中總蛋白和目標蛋白濃以飽和度為橫坐標，沉淀（或上清

16、液）中總蛋白和目標蛋白濃度為縱坐標，得到蛋白質(zhì)溶解度曲線度為縱坐標，得到蛋白質(zhì)溶解度曲線 蛋白質(zhì)量蛋白質(zhì)量(mg)或酶或酶活力活力硫酸銨飽和度硫酸銨飽和度蛋白質(zhì)量蛋白質(zhì)量(mg)或酶或酶活力活力硫酸銨飽和度硫酸銨飽和度方法二方法二各級均離心分離沉淀物，將沉淀溶于各級均離心分離沉淀物，將沉淀溶于2 2倍體積的緩沖液中，測倍體積的緩沖液中，測定其中定其中總蛋白總蛋白和和目標蛋白目標蛋白濃度濃度以飽和度為橫坐標，總蛋白和目標蛋白濃度為縱坐標，得到蛋以飽和度為橫坐標，總蛋白和目標蛋白濃度為縱坐標，得到蛋白質(zhì)溶解度曲線白質(zhì)溶解度曲線 蛋白質(zhì)量蛋白質(zhì)量(mg)或酶或酶活力活力硫酸銨飽和度硫酸銨飽和度蛋白質(zhì)

17、量蛋白質(zhì)量(mg)或酶或酶活力活力硫酸銨飽和度硫酸銨飽和度KS分段鹽析法分段鹽析法分段鹽析法分段鹽析法 在一定在一定pH、溫度條件下，改變離子強度。、溫度條件下，改變離子強度。適用于早期粗提階段的分步分離。適用于早期粗提階段的分步分離。 在一定離子強度下，改變在一定離子強度下，改變pH、溫度。適、溫度。適于后期分離純化和精制。于后期分離純化和精制。1）注意飽和度表中規(guī)定的溫度；）注意飽和度表中規(guī)定的溫度；2）分段鹽析中，應(yīng)考慮每次分段后蛋白質(zhì)濃度的變化；）分段鹽析中，應(yīng)考慮每次分段后蛋白質(zhì)濃度的變化；3）鹽析后一般放置半小時至一小時，待沉淀完全后才過濾）鹽析后一般放置半小時至一小時，待沉淀完全

18、后才過濾或離心；或離心；4）加入硫酸銨時應(yīng)注意攪拌，避免局部過濃；）加入硫酸銨時應(yīng)注意攪拌，避免局部過濃；5）硫酸銨使用前須用）硫酸銨使用前須用H2S處理，高濃度的硫酸銨溶液使用處理，高濃度的硫酸銨溶液使用前需用氨水或硫酸調(diào)節(jié)至所需前需用氨水或硫酸調(diào)節(jié)至所需pH。 6、注意事項、注意事項 蛋白質(zhì)等電點沉淀法是基于不同蛋白蛋白質(zhì)等電點沉淀法是基于不同蛋白質(zhì)離子具有不同等電點這一特性，依次改質(zhì)離子具有不同等電點這一特性，依次改變?nèi)芤鹤內(nèi)芤簆HpH值的辦法，將雜蛋白沉淀除去，值的辦法，將雜蛋白沉淀除去，最后獲得目標產(chǎn)物。最后獲得目標產(chǎn)物。二、等電點沉淀法二、等電點沉淀法 （1）適用于疏水性強的蛋白質(zhì)

19、）適用于疏水性強的蛋白質(zhì)（2）中性鹽濃度增大時，等電點向偏酸方向移動，）中性鹽濃度增大時，等電點向偏酸方向移動，同時最低溶解度會有所增大。同時最低溶解度會有所增大。 （3）無機酸通常價格便宜，無毒）無機酸通常價格便宜，無毒（4）蛋白質(zhì)對低）蛋白質(zhì)對低pH 敏感，易失活敏感，易失活未沉淀蛋白質(zhì)的分率未沉淀蛋白質(zhì)的分率pH對大豆蛋白質(zhì)溶解度的影響對大豆蛋白質(zhì)溶解度的影響利用等電點除雜蛋白時必須利用等電點除雜蛋白時必須了解制備物對酸堿的穩(wěn)定性了解制備物對酸堿的穩(wěn)定性，不然盲目使用十分危險。不少蛋白質(zhì)與金屬離子結(jié)合后，不然盲目使用十分危險。不少蛋白質(zhì)與金屬離子結(jié)合后，等電點會發(fā)生偏移，故等電點會發(fā)生偏

20、移，故溶液中含有金屬離子時，必須注意溶液中含有金屬離子時，必須注意調(diào)整調(diào)整PH值值。由于許多蛋白質(zhì)的等電點十分接近，而且?guī)в兴さ牡鞍子捎谠S多蛋白質(zhì)的等電點十分接近，而且?guī)в兴さ牡鞍踪|(zhì)等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，質(zhì)等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，因此，單獨使用此法分辨率較低，效果不理想單獨使用此法分辨率較低，效果不理想。主要用于在分離純化流程中去除雜蛋白主要用于在分離純化流程中去除雜蛋白例如：工業(yè)上生產(chǎn)胰島素例如：工業(yè)上生產(chǎn)胰島素粗提液粗提液調(diào)調(diào)PH8.0調(diào)調(diào)PH3.0去除堿性蛋白質(zhì)去除堿性蛋白質(zhì)去除酸性蛋白質(zhì)去除酸性蛋白質(zhì)胰島素胰島素三、有機溶劑沉

21、淀法三、有機溶劑沉淀法 許多能與水互溶的有機溶劑如乙醇、丙酮、許多能與水互溶的有機溶劑如乙醇、丙酮、甲醇和乙腈，常用于低鹽濃度下沉淀蛋白質(zhì)甲醇和乙腈，常用于低鹽濃度下沉淀蛋白質(zhì)。加入溶劑后會加入溶劑后會使水溶液的介電常數(shù)降低使水溶液的介電常數(shù)降低，而使蛋白質(zhì)分，而使蛋白質(zhì)分子間的靜電引力增大，導(dǎo)致凝集和沉淀。子間的靜電引力增大，導(dǎo)致凝集和沉淀。蛋白質(zhì)的溶劑化蛋白質(zhì)的溶劑化，使原來和蛋白質(zhì)結(jié)合的水被溶劑所取，使原來和蛋白質(zhì)結(jié)合的水被溶劑所取代，從而降低了它們的溶解度。代，從而降低了它們的溶解度。有機溶劑有機溶劑可能破壞了蛋白質(zhì)的某種鍵可能破壞了蛋白質(zhì)的某種鍵如氫鍵，使其空間如氫鍵，使其空間結(jié)構(gòu)發(fā)

22、生某種程度的變化，致使一些原來包在內(nèi)部的疏結(jié)構(gòu)發(fā)生某種程度的變化，致使一些原來包在內(nèi)部的疏水基團暴露于表面并與有機溶劑的疏水基團結(jié)合形成疏水基團暴露于表面并與有機溶劑的疏水基團結(jié)合形成疏水層，從而使蛋白質(zhì)沉淀。水層，從而使蛋白質(zhì)沉淀。機理分析進展機理分析進展 對某些具有生物活性的大分子容易引起變對某些具有生物活性的大分子容易引起變性失活，操作需在低溫下進行。成本高。性失活，操作需在低溫下進行。成本高。 分辨能力比鹽析法高，即一種蛋白質(zhì)或其他分辨能力比鹽析法高，即一種蛋白質(zhì)或其他溶質(zhì)只在一個比較窄的有機溶劑濃度范圍內(nèi)沉淀。溶質(zhì)只在一個比較窄的有機溶劑濃度范圍內(nèi)沉淀。 沉淀不用脫鹽，過濾比較容易（

23、如有必要，沉淀不用脫鹽，過濾比較容易（如有必要，可用透析袋脫有機溶劑）?？捎猛肝龃撚袡C溶劑）。2、有機溶劑的選擇和濃度的計算、有機溶劑的選擇和濃度的計算 不同有機溶劑沉淀蛋白質(zhì)的效率受多方面的影響，需通過不同有機溶劑沉淀蛋白質(zhì)的效率受多方面的影響，需通過試驗加以選擇。大致上以試驗加以選擇。大致上以丙酮最佳，乙醇次之，甲醇更次丙酮最佳，乙醇次之，甲醇更次。 前提：能與水互溶前提：能與水互溶離子強度離子強度 3、有機溶劑沉淀的影響因素、有機溶劑沉淀的影響因素 溫度溫度 樣品濃度樣品濃度 pHpH值值 四、非離子多聚物沉淀法四、非離子多聚物沉淀法 20世紀世紀60年代非離子型聚合物開始用于分離年代

24、非離子型聚合物開始用于分離血纖維蛋白原和免疫球蛋白，從此高相對分子質(zhì)血纖維蛋白原和免疫球蛋白，從此高相對分子質(zhì)量非離子聚合物沉淀蛋白質(zhì)的方法被廣泛使用，量非離子聚合物沉淀蛋白質(zhì)的方法被廣泛使用，如：如：聚乙二醇（聚乙二醇（PEG）、聚乙烯吡咯烷酮）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、葡聚糖）、葡聚糖等。等。 u沉淀作用是聚合物與生物大分子發(fā)生沉淀作用是聚合物與生物大分子發(fā)生共沉淀共沉淀作用。作用。u由于聚合物有較強的親水性，使生物大分子由于聚合物有較強的親水性，使生物大分子脫水脫水而發(fā)而發(fā)生沉淀。生沉淀。u聚合物與生物大分子之間聚合物與生物大分子之間以氫鍵相互作用形成復(fù)合物以氫鍵相互作用形成復(fù)合物，在

25、重力作用下形成沉淀析出。在重力作用下形成沉淀析出。u通過通過空間位置排斥空間位置排斥，使液體中生物大分子被迫擠聚在，使液體中生物大分子被迫擠聚在一起而發(fā)生沉淀。一起而發(fā)生沉淀。非離子多聚物沉淀蛋白的原理非離子多聚物沉淀蛋白的原理 操作條件溫和，不易引起生物大分子變性。操作條件溫和，不易引起生物大分子變性。 沉淀效能高，使用很少量的沉淀效能高，使用很少量的PEG即可以沉淀即可以沉淀相當多的生物大分子。相當多的生物大分子。 沉淀后有機聚合物較難去除。沉淀后有機聚合物較難去除。 特特 點：點： 1）選用）選用兩種水溶性非離子多聚物兩種水溶性非離子多聚物組成液液兩相體組成液液兩相體系，不等量分配，而造

26、成分離。系，不等量分配，而造成分離。2）選用）選用一種水溶性非離子多聚物一種水溶性非離子多聚物，使生物大分子，使生物大分子在同一液相中，由于被排斥相互凝聚而沉淀析出。在同一液相中，由于被排斥相互凝聚而沉淀析出。方方 法法 聚電解質(zhì)是含有重復(fù)離子化基團的水溶性聚合物，可聚電解質(zhì)是含有重復(fù)離子化基團的水溶性聚合物，可用于蛋白質(zhì)沉淀的聚電解質(zhì)有用于蛋白質(zhì)沉淀的聚電解質(zhì)有聚丙烯酸、聚乙烯亞胺、羧甲聚丙烯酸、聚乙烯亞胺、羧甲基纖維素和離子型多糖基纖維素和離子型多糖如肝素等。如肝素等。沉淀機理沉淀機理五、聚電解質(zhì)沉淀法五、聚電解質(zhì)沉淀法 蛋白質(zhì)分子的相反電荷與聚電解質(zhì)結(jié)合，形成一個多蛋白質(zhì)分子的相反電荷與

27、聚電解質(zhì)結(jié)合，形成一個多分子絡(luò)合物，當絡(luò)合物超過游離蛋白質(zhì)的溶解度極限值時，分子絡(luò)合物，當絡(luò)合物超過游離蛋白質(zhì)的溶解度極限值時，就發(fā)生沉淀。就發(fā)生沉淀。六、生成鹽復(fù)合物沉淀法六、生成鹽復(fù)合物沉淀法 金屬復(fù)合鹽法金屬復(fù)合鹽法有機鹽法有機鹽法無機復(fù)合鹽法無機復(fù)合鹽法u能與能與羧基、胺基等含氮化合物以及含氮雜環(huán)化合物羧基、胺基等含氮化合物以及含氮雜環(huán)化合物強烈強烈結(jié)合的金屬離子，如：結(jié)合的金屬離子，如：Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+、Cd2+；u能與能與羧酸結(jié)合而不與含氮化合物結(jié)合羧酸結(jié)合而不與含氮化合物結(jié)合的金屬離子，如：的金屬離子，如：Ca2+、Ba2+、Mg2+、P

28、b2+；u與與巰基化合物巰基化合物強烈結(jié)合的金屬離子，如：強烈結(jié)合的金屬離子，如：Hg2+、Ag+、Pb2+。金屬離子沉淀蛋白質(zhì)可分為三類：金屬離子沉淀蛋白質(zhì)可分為三類：實際使用時，金屬離子的濃度常為實際使用時，金屬離子的濃度常為0.02 mol/L。ZnZn2+2+沉淀尿激酶沉淀尿激酶有機鹽法有機鹽法無機復(fù)合鹽法無機復(fù)合鹽法含氮有機酸如苦味酸、苦酮含氮有機酸如苦味酸、苦酮酸、鞣酸等能與有機分子的酸、鞣酸等能與有機分子的堿性功能團形成復(fù)合物而沉堿性功能團形成復(fù)合物而沉淀析出，沉淀后用乙醚除去淀析出，沉淀后用乙醚除去有機酸。有機酸。 如細胞色素如細胞色素C用用45%硫酸銨除雜后，硫酸銨除雜后，用

29、用20% TCA即可將即可將其沉淀。其沉淀。 如磷鎢酸鹽、磷鉬酸鹽等。如磷鎢酸鹽、磷鉬酸鹽等。可加入乙醚或采用離子交換除去無機鹽?？杉尤胍颐鸦虿捎秒x子交換除去無機鹽。 七、其他沉淀法七、其他沉淀法 1、選擇性變性法、選擇性變性法 p 選擇一定的條件使溶液中存在的某些選擇一定的條件使溶液中存在的某些雜蛋白雜蛋白等雜質(zhì)變性等雜質(zhì)變性沉淀下來，而與目的物分開，這種分離方法就稱為沉淀下來，而與目的物分開，這種分離方法就稱為選擇選擇性變性沉淀法。性變性沉淀法。2、親和沉淀、親和沉淀 利用蛋白質(zhì)與特定的生物或合成的分子之間高度專一利用蛋白質(zhì)與特定的生物或合成的分子之間高度專一的作用而設(shè)計出來的一種特殊選擇

30、性的分離技術(shù)，其沉淀原的作用而設(shè)計出來的一種特殊選擇性的分離技術(shù)，其沉淀原理是理是依據(jù)依據(jù)“吸附吸附”有特殊蛋白質(zhì)的聚合物的溶解度的大小有特殊蛋白質(zhì)的聚合物的溶解度的大小。引導(dǎo)產(chǎn)生沉淀的方法有：引導(dǎo)產(chǎn)生沉淀的方法有：u離子交聯(lián)離子交聯(lián)u加入帶相反電荷的聚合物加入帶相反電荷的聚合物u加入帶相反電荷的疏水基團加入帶相反電荷的疏水基團u改變改變pH值，誘導(dǎo)產(chǎn)生疏水沉淀值，誘導(dǎo)產(chǎn)生疏水沉淀u溫度誘導(dǎo)產(chǎn)生沉淀溫度誘導(dǎo)產(chǎn)生沉淀配基配基-載體復(fù)合物與目的蛋白質(zhì)的分離載體復(fù)合物與目的蛋白質(zhì)的分離基本過程：基本過程：親和結(jié)合親和結(jié)合 洗洗 滌滌 初始階段：將一個目標蛋白質(zhì)初始階段：將一個目標蛋白質(zhì)與鍵合在可溶性

31、載體上的親和與鍵合在可溶性載體上的親和配體絡(luò)合成沉淀；配體絡(luò)合成沉淀；所得沉淀物用一種適當?shù)乃贸恋砦镉靡环N適當?shù)木彌_溶液進行洗滌，洗去緩沖溶液進行洗滌，洗去可能存在的雜質(zhì)可能存在的雜質(zhì)用一種適當?shù)挠靡环N適當?shù)脑噭⒛繕说霸噭⒛繕说鞍踪|(zhì)從配體中白質(zhì)從配體中離解出來離解出來n概念：應(yīng)用強大的離心力，使物質(zhì)因沉降速度不同而進行概念：應(yīng)用強大的離心力，使物質(zhì)因沉降速度不同而進行分離、濃縮及提純的方法叫超離心技術(shù)分離、濃縮及提純的方法叫超離心技術(shù) 。n常用方法：差速離心，密度梯度離心和等密度離心。常用方法：差速離心，密度梯度離心和等密度離心。 8.1 差速離心差速離心 在離心管中進行，樣品在離心時受

32、離心作用移向離心管底在離心管中進行，樣品在離心時受離心作用移向離心管底部。其離心力是：部。其離心力是： F = 4 2 2 r2grF轉(zhuǎn)速（轉(zhuǎn)/s）離心管軸底部到轉(zhuǎn)軸中心之距離（cm）離心力（相對離心力）不同物質(zhì)其大小、比重和形狀不同而沉降速度不同。在相同不同物質(zhì)其大小、比重和形狀不同而沉降速度不同。在相同離心力的作用下，沉降速率大的離心力的作用下，沉降速率大的 先沉到底部。先沉到底部。 注：沉降速度相差越大越能得到良好分離。只能是一種粗分注：沉降速度相差越大越能得到良好分離。只能是一種粗分技術(shù)，多次重復(fù)操作是可以改善回收純度的。技術(shù)，多次重復(fù)操作是可以改善回收純度的。 8.2 密度梯度離心（

33、又叫速率區(qū)帶離心法密度梯度離心（又叫速率區(qū)帶離心法 ）n用來分離沉降速度差不太大的顆粒。用來分離沉降速度差不太大的顆粒。n方法：將小量樣品置于一個從上而下密度變大的密度梯度方法：將小量樣品置于一個從上而下密度變大的密度梯度液上進行離心。若物質(zhì)比溶劑重，物質(zhì)才下沉；若物質(zhì)比液上進行離心。若物質(zhì)比溶劑重，物質(zhì)才下沉；若物質(zhì)比溶劑輕，則物質(zhì)浮在其上面。所以在密度梯度液上面的樣溶劑輕，則物質(zhì)浮在其上面。所以在密度梯度液上面的樣品物質(zhì)品物質(zhì) ，在離心時各物質(zhì)按其沉降速率的不同而沉降，到，在離心時各物質(zhì)按其沉降速率的不同而沉降，到最后按各自的比重平衡停留在相應(yīng)密度的溶劑中。最后按各自的比重平衡停留在相應(yīng)密度的溶劑中。 8.3 應(yīng)用應(yīng)用 （利用物理性質(zhì)進行的不變質(zhì)的分離手段）（利用物理性質(zhì)進行的不變質(zhì)的分離手段） 可以用于制備，也可以用于分析?？梢杂糜谥苽洌部梢杂糜诜治?。 樣品量可大樣品量可大 可小，小到可小，小到0.2ml以下，大到幾千升。以下，大到幾千升。 分離的對象廣，包括各種分離的對象廣，包括各種 亞細胞物質(zhì)，各種蛋白質(zhì)和酶，亞細胞物質(zhì)，各種蛋白質(zhì)和酶，核糖核酸及