溶菌酶結晶法提取及其酶活力的探討_黃贊良

1、 作為一種糖苷水解酶的溶菌酶,又稱 N-乙 酰胞壁質聚糖水解酶或胞壁質酶,是一種能水解 致病菌中黏多糖的堿性酶。溶菌酶廣泛存在于鳥 類的蛋清及哺乳動物的尿液、淚液、血液、體液 (如淋巴液 、組織 (如肝 、腎細胞內等 1。主要 通過破壞細胞壁中的 N-乙酰胞壁酸 (NAM和 N-乙酰氨基葡糖 (NAG之間的 -1,4糖苷鍵,使 細胞壁不溶性黏多糖分解為可溶性糖肽,導致細 胞壁破裂而使細菌溶解。溶菌酶對人體無毒副作 用,是一種安全的天然防腐劑,具有抗病毒、抗 菌、抗腫瘤之功效?？捎米鳛樗幬镏苿⒎栏瘎?、 基因與細胞工程中細胞融合劑等 2。作為堿性酶的溶菌酶,其來源不同,水解細 胞壁的性能也表現為

2、較大差異 3。溶菌酶水解微 生物細胞壁的作用機理是破壞細胞壁結構中的肽 聚糖, 作用位點是 NAM 與 NAG 碳原子間的 -1.4糖苷鍵 4。肽聚糖作為微生物細胞壁的主要成份 (骨架 ,是 NAG 與 NAM 通過 -1,4 糖苷鍵交 替排列形成的多層網狀結構的共聚物 5。肽聚糖 結構中的任何化學鍵斷裂,都能促使細胞壁中的 肽聚糖分解,導致細菌細胞壁被破壞,從而體現 溶菌酶的溶菌特性 6。近年來,根據不同原料及溶菌酶的特性,提 取分離溶菌酶的方法有結晶法、反膠團萃取法、 離子交換法、色譜法、親和層析法等。結晶法這 一傳統(tǒng)的方法,是由 Mayer Abraham 等提出并獲 得結晶狀溶菌酶 7

3、。本文利用湖光巖地區(qū)的鵪鶉 蛋為提取原料,采用結晶法提取分離溶菌酶,進 而利用重結晶的方法反復精制,可提取到所需純 度的溶菌酶晶體 8。1實驗1.1主要儀器、試劑與材料1.1.1 主要儀器UV-29200 紫外可見分光光度計 ; JJ-a 數控恒 溫磁力攪拌器 ; M304781 離心機 ; DSX-280B 蒸 氣壓力滅菌鍋 ; KYC-111 搖床 ; SW-CJ-2F 超凈 工作臺 ; FD-1B-50 冷凍干燥機 ; 2X-15D 旋片式 真空泵 ; R201 旋轉蒸發(fā)儀 ; Sorvalls Upert-21 高 速離心機 ; YP-5002 電子天平。1.1.2 主要試劑R-250

4、、G-250考 馬 斯 亮 藍 ; NaH 2PO 4; Na 2HPO 4; 1mol/L NaOH; 20000 u/mg溶菌酶標準液; 3g/L牛肉膏 ; 營養(yǎng)肉湯 ; 10g/L胰蛋白陳 ; 微球菌 ; 5.1%的 NaCl溶液 ; HCl ; CH3COOH ; 瓊脂。 1.1.3 主要材料新鮮湖光巖鵪鶉蛋,購置于湖光巖農貿市場。 1.2實驗方法溶菌酶結晶法提取及其酶活力的探討黃贊良,談海玉,鄧彩思,張兆霞 *,李泳 *(廣東海洋大學,廣東 湛江 524088摘要:以湖光巖鵪鶉蛋為原料,采用結晶法從蛋清中分離提取溶菌酶。探討不同條件對溶菌 酶收率及活性的影響,確定溶菌酶最佳的分離提取

5、條件:鹽析NaCl質量分數為5.1%,pH=10.7,鹽 析時間為120h,收率達到 0.378%,酶活力達到 13700 U/mg。關鍵詞:鹽析法;溶菌酶;酶活力中圖分類號:S188 文獻標識碼:A 文章編號:1004-275X(201705-083-04_收稿日期:2017-04-25基金項目:廣東海洋大學團隊項目(項目編號:C13435, 大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目(項目編號:CXXL2016152。 作者簡介:黃贊良,廣東海洋大學,制藥工程專業(yè),大學生。*通訊作者:張兆霞,李泳,廣東海洋大學教師,從事生物酶相關方面的科研工作。1.2.1 溶菌酶的提取1將新鮮鵪鶉蛋洗凈晾干、用無菌注射器收 集鵪

6、鶉蛋清液并攪拌均勻后,用紗布過濾去除蛋 清中的卵帶備用。2 取 一 定 量 蛋 清 液, 加 入 適 量 NaCl 后 攪 拌 均 勻, 用 1M 的 NaOH 溶 液 調 節(jié) 蛋 清 液, 使 pH=10.7左右, 投入適量溶菌酶晶種后, 放置于 4 環(huán)境大約 5d,待析出溶菌酶晶體后,冷凍干燥得 干粉溶菌酶。1.2.2 溶菌酶底物的制備1培養(yǎng)基的配制取 5g NaCl,3.0g 牛肉浸取物,10.0g 蛋白胨, 放置于 1 L 蒸餾水中溶解,加入 2%的瓊脂液, 用酸堿液調節(jié) pH 為 7.0,用三角瓶分裝成斜面, 在 120的水蒸氣條件下滅菌 20min 后備用。 2底物的制備用 0.5

7、mL 的無菌水振蕩溶解凍干溶壁微球菌, 并將菌體接種于培養(yǎng)基斜面中,于 25培養(yǎng) 2 d, 備用(如果需要,可再次接種擴培 。用無菌水洗 滌菌體,5000r/min 離心 15min,收集沉淀菌體, 反復洗滌至無蛋白 (以考馬斯亮藍 R250蛋白質顯 色法 9檢測 ,冷凍干燥得干粉菌體。用 0.5g 干 粉菌體和適量的 0.1mol/L、pH=6.2的磷酸緩沖溶 液,于瑪瑙研缽中研磨 5min后,稀釋至 3040mL備用。1.2.3 溶菌酶活力的測定1酶液的制備 :以 0.1% 的氯化鈉溶液作為 激活劑,稱 5mg 干粉溶菌酶與 0.1mol/L、pH=6.2 的磷酸緩沖液溶配制成 5.0&#

8、215;10-2mg/mL的溶菌酶 溶液。2 1個酶活力單位:在 1min、 pH= 6.2的條件下, 使溶菌酶溶液 OD 450值降低 1×10-3個單位定義為 1個酶活力單位。以標準溶菌酶的檢測條件為固 定的標準測定條件。酶 活 力 單 位 計 算 公 式 :在 光 密 度 OD 450為 0.50.6 的范圍內,酶活力單位 (U/mg = (ODt=0-OD t=60/樣品的質 量 (mg×10003酶活力的測定。將底物液與溶菌酶溶液分 別于常溫水浴中保溫 10min,測量底物液的 OD 450值作為空白值,接著加入 0.2mL 溶菌酶溶液迅速 搖勻,并開始記時,每隔

9、 1min 測 1 次 OD 450值。 2結果與討論2.1鹽析時間對溶菌酶活性的影響由于溶菌酶處于鹽析條件下,其活性隨時間 而減退,所以確定適當的鹽析時間是十分重要的。 在鹽析實驗過程中,每隔 20h 取樣一次,并測定 鵪鶉蛋清的比酶活,結果見圖 1。圖 1鹽析時間對溶菌酶收率的影響由圖 1知,在鹽析 20h 時,酶活力測定最高 為 16100 U/mg,隨著鹽析時間的增加,酶活力逐 步下降,在鹽析 120h 時,酶活力為 13700 U/mg, 此后,酶活力迅速下降。說明隨鹽析時間增加, 酶活力逐漸下降。2.2pH 值對溶菌酶活性的影響每隔 0.5個 pH 值單位取一次溶菌酶溶液,并 測定

10、比酶活,結果見圖 2。圖 2pH 值對溶菌酶活性的影響由圖 2知,溶菌酶在 pH=6.5時酶活力最高, 為 13700U/mg,升高或降低溶菌酶溶液的 pH 值, 酶活力都將迅速下降。2.3溫度對溶菌酶活性的影響改變溶菌酶溶液的溫度, 每隔 10 取樣一次, 并測定其溶液的比酶活,結果見圖 3。圖 3溫度對溶菌酶活性的影響由圖 3可見,在 2090的范圍內,溶菌酶活 性于 50 時最高,為 13700 U/mg。2.4鹽析時間對溶菌酶收率的影響在鹽析過程中,每隔 20h,測定一次溶菌酶的 收率,結果見圖 4。圖 4鹽析時間對溶菌酶收率的影響由圖 4 可見,溶菌酶的收率在 0120h的鹽析 時間

11、內是逐漸增加的,且鹽析達到 120h 時,酶的 收率最高。當鹽析超過 120h 后,酶的收率則有些 下降。所以,鵪鶉蛋溶菌酶的鹽析時間應不小于120h。2.5pH 值對溶菌酶收率的影響選用不同 PH 值條件下,提取分離溶菌酶,每 隔 0.5個 pH 值單位,測定一次溶菌酶的收率,結 果見圖 5。圖 5pH 值對溶菌酶收率的影響由圖 5可知,pH 值介于 9.010.7范圍內,溶 菌酶的收率隨 pH 的升高而逐步增大,當 pH = 10.7 時,溶菌酶的收率達到最高。當 pH 值超過 10.7時,隨著 pH 值的增加,溶菌酶的收率又迅 速降低, 所以, 溶菌酶的鹽析 pH 值應在 10.7左右。

12、 2.6NaCl 的質量分數對溶菌酶收率的影響選用不同 NaCl 的質量分數, 鹽析分離溶菌酶, 每隔 0.5個質量分數單位, 測定一次溶菌酶的收率, 結果見圖 6。圖 6NaCl 的質量分數對溶菌酶收率的影響由圖 6可知,NaCl 質量分數介于 3.0%5.1%范圍內,隨質量分數的升高溶菌酶的收率逐步提 高, 當 NaCl 質量分數達 到 5.1%時, 溶 菌 酶 的 收率最高。隨著 NaCl 質量分數繼續(xù)增大,溶菌 酶的收率反而逐步下降,所以,溶菌酶的鹽析 NaCl 質量分數應在 5.1左右。3結論采用 NaCl 作為鹽析劑,于等電點分離并結晶溶菌酶。得出提取分離鵪鶉蛋溶菌酶最佳條件 :鹽

13、 析 用 5.1% 的 NaCl 溶 液 的 質 量 分 數、10.7的 pH、120h 的鹽析時間。獲得溶菌酶活力最高達 13700 U/mg,溶菌酶的收率為 0.378%。溶菌酶在 工農業(yè)生產中應用廣泛,溶菌酶因來源不同,所 得分子量、結構及性質等會有所不同,因而,應 根據具體提取物質,來制定不同的分離工藝路線。參考文獻 :1 陳慧英, 吳曉英, 林影.溶菌酶分離純化方法的研究新進 展J.廣東藥學院學報, 2003, 19(4:356-358.2 谷絨, 車振明, 萬國福.溶菌酶在食品工業(yè)中的應用J.保 鮮與加工, 2006, 6:5-6.3 王鏡巖, 朱圣庚等.生物化學, 北京:高等教育

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