4物理圖的繪制ppt課件

1、物理圖的繪制1;.23分子信標(biāo)及FRET分析4;.5分子信標(biāo)原理提出的原因：分子信標(biāo)的設(shè)想其是一種設(shè)計(jì)巧妙的熒光標(biāo)記的核酸探針。6分子信標(biāo)工作原理7分子信標(biāo)的結(jié)構(gòu)環(huán) 含識(shí)別序列，一般15 -33個(gè)核苷酸莖 在兩末端各接上5到8個(gè)核苷酸的互補(bǔ)序列，富含GC熒光素及猝滅劑89分子信標(biāo)的設(shè)計(jì)分子信標(biāo)探針部分的長(zhǎng)度為1533個(gè)核苷酸探針-靶雜交物的熔點(diǎn)，可由GC按規(guī)律預(yù)測(cè) 小于20 Tm=2（A+T）4（G+C）10選定探針序列后，在其兩端各加上一段莖分子信標(biāo)莖的長(zhǎng)度一般為57bp分子信標(biāo)Tm值，不可從GC含量來(lái)推算G 有時(shí)有熒光猝滅作用分子信標(biāo)和PCR引物之間沒(méi)有互補(bǔ)部分重要一點(diǎn)是讓分子信標(biāo)成為設(shè)計(jì)

2、中的發(fā)夾結(jié)構(gòu)自由能愈高結(jié)構(gòu)愈穩(wěn)定11熒光素又稱熒光染料，多數(shù)是雜環(huán)或多環(huán)芳烴類(lèi)化合物可吸引光能成為不穩(wěn)定的激發(fā)態(tài)，存在時(shí)間為10-910-8 s吸光波長(zhǎng)與發(fā)光波長(zhǎng)之差，稱為Stokes偏移1213幾個(gè)概念最大激發(fā)波長(zhǎng)最大發(fā)射波長(zhǎng)消光系數(shù)發(fā)射效率14熒光素的光漂白熒光基因在激發(fā)態(tài)時(shí)受到光的不可逆破壞解決辦法 抗光漂白試劑加入 用低強(qiáng)度及寬譜帶的光激發(fā)并用最高靈敏度的檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè) 改用光穩(wěn)定性較好，具有類(lèi)似吸收/發(fā)射光譜的染料1516猝滅劑熒光染料發(fā)射的光能，可被鄰近的染料或非染料分子所吸收轉(zhuǎn)成熱能而不再發(fā)射熒光，也可以發(fā)射能量較低的熒光1718PRET激光共振能量轉(zhuǎn)移：受激發(fā)熒光素的能量轉(zhuǎn)移到鄰

3、近的另一熒光素，并不發(fā)射熒光而使激發(fā)熒光素回復(fù)基態(tài)時(shí)的現(xiàn)象。條件 熒光素間的距離要近 光譜要有一定程度重疊1920能量變化的可能情況內(nèi)部能量轉(zhuǎn)換光發(fā)射動(dòng)態(tài)靜態(tài)猝滅PRET21PRET的基本要求供體分子喪失激發(fā)能S1到S 0要與受體分子被激發(fā)所需能量相匹配發(fā)生PRET的另一要求是供體分子與受體分子間的能量轉(zhuǎn)移與距離密切相關(guān)22232425遺傳圖的不足遺傳圖的分辯率有限遺傳圖的精確度較低26物理作圖技術(shù)限制性作圖依靠克隆的基因作圖熒光標(biāo)記原位雜交（FISH）順序標(biāo)簽位點(diǎn)（STS）作圖27限制性作圖基因原位點(diǎn)工理： 比較不同酶解產(chǎn)生片段的大小 對(duì)于2個(gè)或者多個(gè)相同酶切位點(diǎn)區(qū)域，采用部分酶切 當(dāng)限制位

4、點(diǎn)過(guò)多時(shí)，采用末端同位素標(biāo)記的方法結(jié)合部分酶解處理28稀有切點(diǎn)限制酶內(nèi)切酶的類(lèi)型內(nèi)切酶的切割結(jié)果內(nèi)切酶的切割片段的推斷4n稀有切點(diǎn)限制圖繪制 識(shí)別順序越長(zhǎng)，產(chǎn)生的片段越大 識(shí)別片段的堿基組成影響片段的大小 對(duì)于識(shí)別位點(diǎn)較長(zhǎng)的限制酶，不區(qū)別應(yīng)用 基因組的甲基化狀態(tài)2930DNA分子限制性作圖限制性作圖只適應(yīng)于較小的DNA分子，上限取決于作圖分子中限制酶位點(diǎn)的頻率。一般50KB以下。限制圖能否用于50KB以上？31大分子DNA片段的分離小分子，一般分子分子雜交32交變電場(chǎng)瓊脂糖凝膠電泳33基于克隆的基因組作圖質(zhì)料載體克隆載體及與質(zhì)料結(jié)合的粘粒擬南芥，1.2108，需要2500個(gè)40KB克隆，如果達(dá)

5、到99.9%的覆蓋率，需要25000個(gè)，人類(lèi)基因則需要上百萬(wàn)個(gè)。34大分子DNA的克隆載體YAC（yeast artificial chromosomes,酵母人工染色體）其是根據(jù)真核染色體的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的 著絲粒 端粒起點(diǎn) 自主復(fù)制可載容易為2301700KB之間3536含有人工染色體的酵母方可在基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，插入片段存在時(shí)，酶失活，克隆顯示紅色，否則為白色37YAC缺陷插入部分的穩(wěn)定性問(wèn)題同一細(xì)胞內(nèi)不同YAC的重組交換，形成嵌合順序38噬菌體P1載體將天然噬菌體基因組中的一段缺失，容易相當(dāng)于缺失區(qū)段的大小及顆粒所容納的空間?？蛇_(dá)125kb3940是 Sternberg 基于 P1 噬菌體構(gòu)

6、建的，與黏粒載體工作原理比較相似的一種高通量載體。它含有很多 P1 噬菌體來(lái)源的順式作用元件，能容納 70100kb 大小的基因組DNA片段（Sternberg 1990, 1992, 1994） 。在這種系統(tǒng)中，含有基因組和載體序列的線狀重組分子在體外被組裝到 P1 噬菌體顆粒中，后者總?cè)萘靠蛇_(dá) 115kb （包括載體和插入片段）。將重組 DNA 注射到表達(dá) Cre 重組酶的大腸桿菌中，線狀 DNA 分子通過(guò)重組于載體的兩個(gè) loxP 位點(diǎn)之間而發(fā)生環(huán)化。另外，載體還攜帶一個(gè)通用的選擇標(biāo)記 kan r ，一個(gè)區(qū)分?jǐn)y帶外源 DNA 克隆的陽(yáng)性標(biāo)記 sacB 以及一個(gè)能夠使每個(gè)細(xì)胞都含有約一個(gè)拷

7、貝環(huán)狀重組質(zhì)粒的 P1 質(zhì)粒復(fù)制子。另一個(gè) P1 復(fù)制子（ P1 裂解性復(fù)制子）在可誘導(dǎo)的 lac 啟動(dòng)子（IPTG 誘導(dǎo)）控制下，用于 DNA 分離前質(zhì)粒的擴(kuò)增。41結(jié)合了 P1 載體和 BAC 載體的最佳特性，包括陽(yáng)性選擇標(biāo)記 sacB 及噬菌體 P1 的質(zhì)粒復(fù)制子和裂解性復(fù)制子。然而除了將連接產(chǎn)物包裝進(jìn)入噬菌體顆粒以及在 cre-loxP 位點(diǎn)使用位點(diǎn)特異性重組產(chǎn)生質(zhì)粒分子以外，在載體連接過(guò)程中產(chǎn)生的環(huán)狀重組 PAC 也可能用電穿孔的方法導(dǎo)入大腸桿菌中，并且以單拷貝質(zhì)粒狀態(tài)維持 （Ioannou et al. 1994） 。代表性 PAC 載體 pCYPAC1 遺傳結(jié)構(gòu)圖 見(jiàn)圖 3-30

8、 ?；?PAC 的人類(lèi)基因組文庫(kù)插入片段的大小在 60kb150kb 之間。 42細(xì)菌人工染色體BAC（bacterial artificial chromosomes)其源于大腸桿菌的F質(zhì)料，容易可達(dá)300KB特點(diǎn)： 單拷貝復(fù)制 相對(duì)分子質(zhì)量大 穩(wěn)定 制備方法簡(jiǎn)單，便于機(jī)械化操作43BAC載體物理圖44P1人工染色體PAC（P1derived artificial chromosomes)結(jié)合了P1載體與BAC載體的優(yōu)點(diǎn)，可載片段達(dá)300KB45P1人工染色體4647F粘粒具有F質(zhì)料的復(fù)制起點(diǎn)及的COS位點(diǎn)，功能與粘粒類(lèi)似，拷貝數(shù)低。48重疊群的組建相互重疊的DNA片段組成的物理圖稱為重疊

9、群，其組建采用染色體步移法。 從基因組文庫(kù)中挑取一個(gè)指定的或者隨機(jī)的克隆，然后尋找與之重疊的另一個(gè) 依次延伸。4950指紋作圖在基因組范圍內(nèi)查找重疊的克隆，最好的方法首推克隆指紋排序。指紋系指確定DNA樣品所具有的特定DNA片段組成，一個(gè)克隆的指紋表示了該克隆具有的限定的順序特征。51限制性帶型指紋限制性酶處理凝膠分離DNA片段部分相同，說(shuō)明具有重疊的順序52重復(fù)順序DNA指紋不同克隆的DNA用限制性酶處理雜交具有相同的帶型，說(shuō)明具有相同的重復(fù)順序53重復(fù)順序DNAPCR指紋確定重復(fù)順序之間的單一順序設(shè)計(jì)重復(fù)順序互補(bǔ)的引物，進(jìn)行凝膠分離比較帶型差異A平均為4KB，54STS目錄作圖需要將某一克

10、隆重疊群錨定到現(xiàn)有已具有STS標(biāo)記的物理圖上時(shí)，此法有效。根據(jù)STS設(shè)計(jì)引物，凡能擴(kuò)增出條帶的克隆，具有順序重疊的插入子。5556熒光標(biāo)記原位雜交Fluorescent in situ hybridization , FISH標(biāo)記信號(hào)為熒光素，結(jié)果可在顯微鏡下觀察，直接顯示探針與染色體雜交的位置。原位雜交：靶子為完整的染色體，由雜交信號(hào)提供作圖信號(hào)，DNA變性時(shí)不破壞染色體自然形態(tài)，575859與同位素探針雜交的區(qū)別方法基本一致，探針差異，解決敏感性與分辯率之間的矛盾對(duì)于重復(fù)順序的存在，采用預(yù)先與重復(fù)順序結(jié)合的方法，封閉部分結(jié)合點(diǎn)，降低非特異性順序的干擾60原位雜交的原理及應(yīng)用對(duì)特定探針而言，

11、原位雜交所的中期染色體熒光信號(hào)所處的位置與染色體短臂末端的相對(duì)距離是不變的，經(jīng)比例換算可標(biāo)注在連鎖圖上。此僅僅應(yīng)用于確定新發(fā)現(xiàn)的標(biāo)記屬于那條染色體原位雜交的分辯率取決于雜交技術(shù)及染色體在制備時(shí)所處的狀態(tài)61其它染色體的選用機(jī)械伸展的染色體 利用離心剪切力使染色體長(zhǎng)度增加20倍非中期染色體 利用新的方法，使染色體可既松散又保持分辨特征的染色體62順序標(biāo)簽位點(diǎn)作圖限制性作圖快速，提供詳細(xì)的信息，但不適合大基因組重疊群構(gòu)建程序復(fù)雜，費(fèi)時(shí)費(fèi)力指紋作圖對(duì)大基因組仍存在問(wèn)題原位雜交操作困難，資料累積慢，一次實(shí)驗(yàn)定位的分子標(biāo)記不超過(guò)34個(gè)63STS繪圖順序標(biāo)簽位點(diǎn)或STS（sequence tagged s

12、ite）為一段長(zhǎng)度100500BP的單一DNA順序，易于分辨。如果兩個(gè)序列片段含有同一STS，則表示兩個(gè)序列片段重疊。2個(gè)STS出現(xiàn)在同一片段中的機(jī)會(huì)取決于他們的位置是否靠得近。64STS作圖原理65合格的STS特點(diǎn)序列已知在染色體上獨(dú)一無(wú)二66尋找STS辦法表達(dá)序列標(biāo)簽（expressed sequence tag ,EST)從cDNA克隆中找到小段順序SSLP 具有多態(tài)性并已在連鎖分析中定位的SSLP具有特別的價(jià)值。隨機(jī)基因組測(cè)序67STS的物理定位輻射雜種克隆作圖68輻射雜種含有另一種生物染色體片段的嚙齒類(lèi)細(xì)胞人體細(xì)胞射線照射，染色體隨機(jī)斷裂，劑量與片段大小成反比。將輻射后細(xì)胞與正常倉(cāng)鼠細(xì)胞融合，片段將整合到鼠類(lèi)細(xì)胞染色體中進(jìn)行擴(kuò)增。利用胸苷激酶或次黃嘌呤磷酸轉(zhuǎn)移酶的缺陷細(xì)胞，采用HAT培養(yǎng)基選擇。獲得TK和HPRT基因的可生長(zhǎng)。一般每個(gè)陽(yáng)性雜種細(xì)胞保存DNA占人基因組1530%，510Mb6970僅含單個(gè)染色體的雜