CHO細胞株開發(fā)技術策略探討

1、CHO 細胞株開發(fā)技術策略探討陶維紅， 秦民民， 張哲如上海津曼特生物科技有限公司，上海 201210摘 要: 主要介紹了單克隆抗體藥物工業(yè)生產(chǎn)中宿主細胞選擇、表達載體構建、轉(zhuǎn)染方法、篩選技術、細胞培養(yǎng)工藝技術方法以及最后選定細胞株的標準等，結合單抗藥物 CHO 細胞株開發(fā)和培養(yǎng)工藝的經(jīng)驗，對當前我國單抗 CHO 細胞株開 發(fā)技術策略進行了探討。關鍵詞: 單克隆抗體; CHO 細胞; 細胞株開發(fā); 培養(yǎng)工藝DOI: 10 3969 / j issn 2095-2341 2014 06 03Strategy Discussion for CHO Cell Line DevelopmentTAO

2、Wei-hong，QIN Min-min，ZHANG Zhe-ruShanghai JMT-Bio Science Technology Co Lt ，Shanghai 201210，ChinaAbstract: Several strategies for industrial production of monoclonal antibody drug were introduced in this paper，including hostcell selection，construction of expression vector，transfection method，screeni

3、ng techniques，cell culture technology as well as thestandard method of final cell lines selection On the basis of the progress of monoclonal antibody drug CHO cell line development and cell culture process，current strategy for the development of CHO cell lines in monoclonal antibody technology were

4、also discussedKey words: monoclonal antibody; CHO cell; cell line development; cell culture process20 世紀 80 年 代 初，基因重組技術開始應用 于動物 細 胞。1984 年，Genentech 公 司 首 次 實 現(xiàn) 重組中國倉鼠卵巢 ( Chinese hamster ovary，CHO) 細胞表達組織型纖溶酶原激活劑( tissue type plas- minogen activator，t-PA) ，標 志 著 哺乳動物細胞表 達系統(tǒng)的建立1。隨后，許多外源蛋白基因相繼被轉(zhuǎn)染到哺乳

5、動物細胞，一些有價值的蛋白不斷 實現(xiàn)表達，包括凝血因子、促紅細胞生成素( eryth-ropoietin，EPO) 、免 疫 球 蛋 白、尿 激 酶 ( urokinase， UK) 、乙肝表面抗原( HBsAg) 和單克隆抗體2等。 近幾年，平均每年有 15 種以上重組蛋白新藥通過 美國食品和藥物管理局 ( FDA) 批準3，并且?guī)讉€ 重磅生物抗體藥專利即將到期促使生物仿制藥的出現(xiàn)，全球生物抗體藥銷售額已超過 1 200 億 美 元 / 年4，預計到 2015 年，全球生物抗體藥銷售額將超過 1 500 億美元5。最突出的重磅炸彈級藥物包括: 美羅華利妥昔單抗ituximab( itaxan

6、) ，美國 Genentech 和 Biogen Idec 公司研制、赫賽汀 曲 妥 珠 單 抗 Trastuzumab ( Herceptin ) ，美 國 Genentech 公司 研 制 、阿伐斯汀貝伐單 抗Bev-acizumab( Avastin) ，美國 Genentech 公司研制、艾比特思西妥昔單抗Cetuximab( Erbitux) ，美國 Im- Clone 公司和 Bristol-Myers Squibb 公司研制和修 美 樂 阿 木 達 單 抗 adalimumab ( Humira ) ，美 國Cambridge 抗體公司和 Abbo 公司研制，這幾種單抗藥物在 2

7、011 年全球銷售額分別都在近 50 億 美元以上6。在國內(nèi)，生產(chǎn)單抗藥物的上市公司目前僅僅有上海的中信國建、賽金和北京的百泰，國內(nèi)市場空間巨大，很多從事小分子藥物或者中 藥的企業(yè)已經(jīng)進軍單抗藥物領域，包括海正藥業(yè)、復星醫(yī)藥、榮昌制藥、麗珠藥業(yè)和沃森藥業(yè)等。最 近幾年，單抗藥物領域中小型企業(yè)也應運而生，其收稿日期: 2014-10-30; 接受日期: 2014-11-02基金項目: 上海市科學技術委員會“科技型中小企業(yè)技術創(chuàng)新資金”項目( 1402H195100) 資助。作者簡介: 陶維紅，工程師，碩士，主要從事 CHO 細胞株開發(fā)和細胞培養(yǎng)工藝開發(fā)研究。E-mail: taoweihong1

8、23 163 com殯陶維紅，等: CHO 細胞株開發(fā)技術策略探討395中不具備單抗藥物研發(fā)平臺的企業(yè)在初始階段會考慮技術外包，于是藥明康德、睿智化學等生物醫(yī)DHF 體系。GS( 谷氨酰胺合成酶) 擴增系統(tǒng)，以CHO-K1 為宿主 細 胞，是 近 些 年發(fā)展的一種新型 基因擴增篩選系統(tǒng)，較 DHF 系統(tǒng)有明顯的優(yōu)越 性，目前在國際上得到了廣泛的認可15 17。其原 理是 GS 在 ATP 水解提供能量的同時，利用細胞內(nèi)的氨和谷氨酸合成谷氨酰胺。在缺乏外源谷氨 酰胺的培養(yǎng)基中加入 GS 抑制劑甲硫氨酸亞砜亞銨( L-methioninesulfoximine，MSX) ，可 使 GS 基 因 及

9、與之相連的目的基因得到有效擴增，從而達到 提高目的基因表達水平的目的。該系統(tǒng)的優(yōu)點主藥研 發(fā) 外 包 公 司 ( contractresearch organization，CO) 也進入單抗藥物研發(fā)、生產(chǎn)等領域。但是我國動物細胞表達水平較低和發(fā)酵規(guī)模普遍偏小的 現(xiàn)狀制約了我國抗體藥物產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展。因此有 必要對國內(nèi)細胞株開發(fā)技術策略進行探討。1宿主細胞抗 體藥物生產(chǎn)的宿主細胞 主 要 有NS0、17要在 : 不需要基因缺陷型的 CHO-K1 細胞株作為宿主細胞; CHO-K1 細 胞 易 于 培 養(yǎng)，更 強 壯; 在 培養(yǎng)基中無需加谷氨酰胺，能夠避免谷氨酰胺分 解造成培養(yǎng)體系中氨水平高的問題

10、，降低了工藝 控制的難度，并且可有效提高細胞發(fā)酵密度和延 長細胞生存時間。HEK293、Hybridoma、SP2 /0 和 CHO 等7。其 中，CHO 細 胞是生產(chǎn)抗體藥 物應用最廣的宿主細 胞8，主要有以 下 原 因3: CHO 細 胞 能 夠 較 好 地適應懸浮培養(yǎng)，在生物反應器中可獲得較高的 密度，有利于工業(yè)上大規(guī)模培養(yǎng); CHO 細 胞 不 易傳播人類感染病毒9; CHO 細胞能夠在無血 清和化學成分明確的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，能夠確保不 同批次培養(yǎng)的重現(xiàn)性; CHO 細胞能夠在翻譯后 進行修飾10，尤其是在糖蛋白 糖 基 化 方 面，其 糖 型與人類基 本 一 致; dhfr 和 GS

11、等 基 因 能 夠 在 CHO 細胞實現(xiàn)共擴增，并最終獲得目的蛋白的高 表達。 此 外，CHO 細胞類型也比較 多，例 如: DG44、DXB11、CHO K1 和 CHO-S 等。自 20 世紀80 90 年 代 開 始，工業(yè)上較早使用 的 是 DHF ( 二氫葉酸還原酶缺陷型) 基因擴增篩選系統(tǒng)，宿 主細胞株為 DG4411 13。當細胞培養(yǎng)基內(nèi)含有甲氨蝶 呤 ( methotrexate，MTX) 時，二 氫 葉 酸 還 原 酶 被抑制，通過反饋調(diào)節(jié)，使得該基因進行擴增14， 其上下游 100 1 000 kb 范圍內(nèi)的基因都會隨之 擴增，因此將目的基因插入此位點范圍即可得到擴增?，F(xiàn)在很

12、多單抗生產(chǎn)的體系依然是 DG44 的2表達載體的構建與轉(zhuǎn)染策略適合于 CHO 細胞表達的載體 ( Vector) 的 基本元素包括: 啟動子( promoter) 、poly A 加尾信號( poly A signal) 、篩選標記 ( selectable marker) 、克隆位點 ( cloning site) 和 復 制 起 始 位 點 ( originofreplication) ，有 些 還 有 報 告 基 因 ( reporter gene ) 。啟動子一般較多采用 SV40 和 CMV 兩種，CMV 啟 動子通常位于目的基因 ( 輕 鏈 和 重 鏈 可 變 區(qū) 基 因) 之前，

13、而 SV40 則位于篩選標記之前。篩選標 記一般有兩種: 代謝型和抗生素型，或者也可稱為 擴增型基因篩選標記和非擴增型基因篩選標記。 常見的篩選標記見表 1，當前工業(yè)界較多采用的 篩選標記為 DHF、GS、G418 和 puromycin 等。表 1 哺乳動物細胞表達載體中常用的篩選標記Selectable markers commonly used in mammalian cell expressionTable 1類別篩選標記篩選試劑二氫葉酸還原酶( DHF)谷氨酰胺合成酶( GS)甲氨蝶呤( MTX)氨基亞砜蛋氨酸( MSX)代謝型篩選標記( 擴增型基因篩選標記)嘌呤霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(

14、puromycin acetyltransferase)殺稻瘟霉素脫氨酶( blasticidin deaminase )組氨醇脫氫酶( histidinol dehydrogenase)潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶( hygromycin phosphotransferase)氯林可霉素耐藥基因( zeocin resistance gene)博來霉素耐藥基因( bleomycin resistance gene)氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶( aminoglycoside phosphotransferase)嘌呤霉素( puromycin)殺稻瘟霉素( blasticidin )組氨醇( histidinol

15、)潮霉素( hygromycin)氯林可霉素( zeocin)博萊霉素( bleomycin)新霉素( neomycin or G418)抗生素篩選標記( 非擴增型基因篩選標記)生物技術進展 C urrent Biotechnology396Li 等18研究顯示，在載體設計中插入篩選標記的不同策略，會影響最終的篩選結果。為比較 不同質(zhì)粒構建和篩選策略，分別設計了兩種質(zhì)粒， 一種帶有 DHF 單 個 篩 選 標 記，另 一 種 帶 有 GS 單個篩選標記，兩種質(zhì)粒都同時具有輕鏈和重鏈 基因。共 進 行 五 組 實 驗: 轉(zhuǎn) 染 質(zhì) 粒 一，加 入25 nmol / L MTX 進 行 篩 選;

16、轉(zhuǎn) 染 質(zhì) 粒 二，加 入25 mol / L MSX 進 行 篩 選; 轉(zhuǎn) 染 質(zhì) 粒 二，加 入50 mol / L MSX 進行篩選; 混合轉(zhuǎn)染兩種質(zhì)粒， 加入 25 nmol / L MTX 和 25 mol / L MSX 進 行 篩 選; 混合轉(zhuǎn)染兩種質(zhì)粒，加入 25 nmol / L MTX 和50 mol / L MSX 進行篩選。比較上述轉(zhuǎn)染后的篩 選結果顯示，和條件篩選的高表達的克隆數(shù) 量明顯較高。因此，這種采用兩種篩選標記的質(zhì) 粒構建 與 篩選方法又稱雙重篩選 ( double selec-tion) ，比 單 篩選標記的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后篩選效率高 很多。目前，商業(yè)中所選擇的載

17、 體供應商主要是 Life technologies 公司，從 pcDNA3 系列到 Freedom pCHO1 0，其大小由原來的 4 000 5 000 bp 到現(xiàn) 在的近 13 000 bp 不等。圖 1 圖 3 分別顯示了 三種典 型 的 載 體 圖 譜 ( 均 來 自 www lifetechnolo- gies com) 。pcDNA3 1 是 Life technologies 公司早 期開發(fā) 的 載 體，其構造相對較簡單。 pOptiVEC- TOPO 載體的最大特點在于具有 TOPO 酶和 IES( internal ribosome entry site) 組件。TOPO

18、酶具有 無縫克隆的特點，與多克隆位點相比，優(yōu)勢在于插圖 2Fig 2pOptiVEC-TOPO 圖譜pOptiVEC-TOPP profile圖 3Fig 3Freedom pCHO1 0 圖譜Freedom pCHO1 0 profile入目的基因時不會帶有酶切位點; 而 IES 組件的功能主要是能夠?qū)⑺B接的兩個基因共用同一個 啟 動 子 進 行 表 達3，即pOptiVEC-TOPO( 4 420 bp) 上的 CMV 啟動子同時作用于目的基 因和 DHF 篩選標記基因。Freedom pCHO1 0 是Life technologies 最 新 開 發(fā) 的 一 個 載 體，大 小 為

19、12 988 bp，具有以 下 特 點: 目的基因的輕鏈和 重鏈可以同時插入一個載體上，以前的載體設計 多數(shù)是插入一個輕鏈或者重鏈; 外源基因插入 位點之前設計的啟動子在 CMV 基礎上進行了較 大的改善; 具有兩個篩選標記。在啟動子的設 計上面，尤其 是 對 于 使 用 DHF 或 GS 這 類 擴 增 型基因篩選標記的表達體系，目的基因前面的啟動子一般比篩選標記的啟動子轉(zhuǎn)錄活性要強19。圖 1 pcDNA3 1 圖譜Fig 1 pcDNA3 1 profile主要有三種: 96 孔單克隆有限稀釋法20、流式細胞儀法21和 Clone Pix System 篩選法22。96 孔單克隆有限稀釋

20、法是早期最廣 泛 應 用 的單克隆細胞株篩選法，理論上可以得到非常均 一的單克隆，同時可以篩選懸浮細胞穩(wěn)定株。其 缺點是工作量比較大，效率較低。流式細胞儀法 主要針對膜蛋白或者內(nèi)分泌抗體，具有一定的局 限性3。流式細胞儀可同時進行多參數(shù)測量，信息主要來自特異性熒光信號及非熒光散射信號。在應用中，通常細胞目的基因帶有熒光報告蛋白 基因或者加入帶有熒光標記的抗抗體。Clone Pix System 篩選法是目前工業(yè) 上 較 為 流行的 篩 選 法3，是 由 Molecular Devices 公 司 開發(fā)的自動挑選克隆的設備，較有限稀釋法具有更 高篩選效率( 表 2) 。該方法使用半固體培養(yǎng)基，

21、將細胞固定在半固體培養(yǎng)基中進行生長，并在半固體培養(yǎng)基中加入帶有熒光標記的二抗，通過與細胞表達的抗體進行結合，形成熒光光圈，在熒光 顯微鏡下可以 看 出 所 謂 的“光 暈”。如 果 光 暈 越大、熒光強度越強，理論上說明克隆表達量越高，也即篩選 所 得 的 克 隆。Clone Pix System 儀 器 主 要結合這一原理，能夠快速挑選高表達的單一克隆。與其配套 的 Clone Select Imager 儀 器 可 以 客觀定量評估孔板中的細胞生長，判斷是否是單個 克隆。最近出現(xiàn)了與 Clone Pix System 類似的篩選 儀器，是德國 ALS( Automated Lab Solu

22、tions) 公司開 發(fā)的 Cell Celector23，應用范圍更廣。表 2 有限稀釋法和 Clone Pix System 方法比較 Table 2 Comparison of limited dilution method and the Clone Pix System method3轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染類型一般有穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和瞬時轉(zhuǎn)染兩種。在單抗細胞株篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染前通常通過瞬時轉(zhuǎn)染 得到一些抗體，進行質(zhì)量分析，以初步判斷抗體是 否滿足需要; 或者進行一些前期的啟動子、密碼子 等組件的優(yōu)化。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染中外源 DNA 既可以整 合到宿主染色體中，也可能作為一種游離體存在。 在 CHO 細胞中進行穩(wěn)定

23、轉(zhuǎn)染時，外源 DNA 整合 到 CHO 染色體上，未整合的游離態(tài)的 DNA 會隨 傳代而丟失。常用于哺 乳 動 物 細胞轉(zhuǎn)染的方法有磷酸鈣 法、陽離子 脂 質(zhì) 體 法、陽離子聚合物法 和 電 穿 孔 法，在工業(yè)界使用最多的是陽離子脂質(zhì)體法和電穿孔法18。4篩選技術CHO 細胞 轉(zhuǎn) 染 之 后，通 常 會做一個克隆池 ( pool) ，然后進行篩選。篩選策略主要涉 及 抗 生 素或藥物的代謝途徑，常見的篩選試劑包括 puro- mycin、G418、MTX 和 MSX 等。Puromycin 為 氨 基 糖甙類抗生素，通過干擾核糖體功能阻斷哺乳動 物細胞的蛋白質(zhì)合成，來自鏈霉菌 的 pac 基

24、因 具 有解除 嘌 呤 霉 素 ( puromycin) 毒 性 的 作 用。在 篩 選的時候，puromycin 濃度一般在 10 50 g / mL。 G418 也是一種氨基糖苷類抗生素，是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染最 常用的抗性篩選試劑之一。G418 在篩選的時 候 一般濃度范圍為 200 1 000 g / mL。MTX 為 葉 酸拮抗劑，在細胞內(nèi)經(jīng)過轉(zhuǎn)換后可抑制 DHF 的 活 性，抑 制 核 酸 合 成，引 起 細 胞 毒 性。 Schimke等14的研究顯示，隨著 MTX 濃度的增加，絕大多 數(shù)細胞死亡，但在極少數(shù)幸存下來的抗性細胞中，DHF 基因得以擴增，目的基因拷貝數(shù)隨之增加，提高了 表 達

25、量。 MTX 篩 選 時，一般濃度范圍為 25 1 000 nmol / L。MSX 篩選采用的是谷氨酰胺 合成酶基因 GS 系統(tǒng)壓力。谷氨酰胺合成酶( GS) 擴增系統(tǒng)是新近發(fā)展的更有效的系統(tǒng)，具有更高 的擴增效應。MSX 篩 選 時，一 般 濃 度 范 圍: 25 500 mol / L。方法學比較有限稀釋法Clone Pix System復 雜 ELISA 實 驗檢測熒光標記特異性抗 體檢測篩選檢測原理機器全 自 動 化 操 作:可以根 據(jù) 光 暈 大 小、熒光強度挑選手工實 驗: 有 限 稀釋、細胞分選等工作模式單位時間效率人工低效率200 個克隆 / h10 000 細胞 /3 周1

26、 000細胞 /5 h篩選效率1 000 細胞 /8 周在工業(yè)上，單克隆細胞大部分是懸浮培養(yǎng)，所以在篩選細胞株的時候，應該盡量接近工業(yè)生產(chǎn) 條件。結合實踐經(jīng)驗來看，在篩選細胞株早期，應該考慮將細胞靜止培養(yǎng)轉(zhuǎn)向搖床或者動態(tài)培養(yǎng)，4 1篩選方法哺乳動物細胞篩選穩(wěn)定的細胞株常用的方法陶維紅，等: CHO 細胞株開發(fā)技術策略探討397生物技術進展 C urrent Biotechnology398以便篩選出更為穩(wěn)定的、接 近 生 產(chǎn) 型 的 細 胞 株。篩選穩(wěn)定、高表達的細胞株，一般周期需要 6 12個月。體的克隆等。克隆在搖瓶考察后，需要選定一定數(shù)量的克 隆進入反應器進行評價，主要考察細胞生長、單抗

27、 表達和單抗質(zhì)量等。一般篩選克隆會做 1 2 次 亞克隆，以確保是單克隆。當然如果在初期母克隆篩選的時候能夠確保是單克隆，可 以 不 做 亞 克隆。篩選準則以及檢測方法克隆的篩選通常關注滴度水平及單位 時 間 單 個 細 胞 所 表 達 的 抗 體 量 ( cell specific produc- tivity，Qp) 選擇 克 隆 的 Qp 在所有克隆中至少要 排 在 中 等。 工業(yè)上所用的克隆 Qp 一 般 在20 100 pg / cell·d。同時還要關注克隆生 長 狀 態(tài)，工業(yè)上 CHO 細胞的翻倍時間 一 般 為 15 24 h，在批次培養(yǎng)或者流加培養(yǎng)的時候，平臺期能夠

28、 盡量長些。在孔板期 間 滴 度 的檢測一般通過 ELISA 方 法或者均相時間分辨熒光技術( homogeneous timeresolved fluorescence，HTF) 24，后者是目前高通量篩選克隆常用的檢測方法。HTF 技術是對時 間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移的檢測技術 ( time-re- solved fluoresence resonance energy transfer assay，T-FET assay) 平臺的進 一 步 改 良，可 提 供 更 高 的靈敏度和穩(wěn)定性。該技術是法國 Cisbio Bioas- says 公司的專利技術。最近又有一種新的微量檢4 2培養(yǎng)工藝

29、5細胞株開發(fā)的過程中，一般需要在一定的培養(yǎng)工藝平臺基礎上進行克隆篩選。中試生產(chǎn)申報 藥品臨床 試 驗 ( investigational new drug，IND) 時， 一般會 選 定 2 3 個來自不同系列的克隆，其 中1 2 個克隆作為備選。培養(yǎng)工藝對最終生物制品的產(chǎn)量、質(zhì)量和安 全有巨大影響，其中以細胞培養(yǎng)基的選擇最為重7。在篩選培養(yǎng)基和補料培養(yǎng)基時，初期流加要培養(yǎng)時候基礎培養(yǎng)基和同品牌的補料培養(yǎng)基應該配對進行篩選。初步篩選之后，將基礎培養(yǎng)基和 補料培養(yǎng)基進行分類，如促進生長類型、維持活率類型、促進表達類型等。將培養(yǎng)基進行混合優(yōu)化 時，盡量將不同類型的培養(yǎng)進行組合，并且應用實 驗設計(

30、 design of experiment，DOE) 優(yōu)化。在補料策略方面，普遍將基礎培養(yǎng)進行濃縮后添加到補料培養(yǎng)基中，因為基礎培養(yǎng)基一般營 養(yǎng)比較全面，但也有可能導致滲透壓偏高。一般 來講，補料體積應該在終體積的 40% 以內(nèi)。有的 策略會按照天數(shù)和一定的補料體積來補加，有的會按照細胞密度來補加，也有按照葡萄糖濃度來 補加，或者按照一定代謝狀態(tài)補加等。由于克隆具有非常強的特異性，不同的克隆在反應器中對于 pH、DO 值、CO2 分壓、攪拌速度、測 方 法 出 現(xiàn)，該 方 法 稱 為ForteBio Octet分 析法25，采用生物膜干涉技術，與 ELISA 法 相 比，Octet 平臺自動化

31、程度高，測 定 的 速 度 快，更 貼 近 搖瓶和反應器中細胞表達量測定的試驗需要，但 其費用可能偏高，暫時沒有在測定孔板滴度中得 到廣泛的應用。篩選的克隆到達搖瓶之后，應盡快建立研究 型細胞庫( research cell banking，CB) ，做穩(wěn)定性試驗?？疾炜寺〉姆€(wěn)定性一般會傳代至 60 代，并觀察克隆生長的穩(wěn)定性，即翻倍時間的穩(wěn)定性; 克 隆表達的穩(wěn)定性，即滴度或者 Qp 的穩(wěn)定性; 克隆 遺傳的穩(wěn)定性; 以及克隆質(zhì)量的穩(wěn)定性，即克隆前 后表達抗體的質(zhì)量是否有較大差別?？寺∵M入搖 瓶的同時，還 會 進 行 cDNA 序 列 的 鑒 定、肽 圖 分 析、CE-SDS 和 SDS-P

32、AGE 單抗純 度 分 析 等，主 要 為避免抗體氨基酸序列突變或克隆的丟失; 進行 HPLC-SEC 分析，以剔除容易形成多聚體的克隆;進行糖型分析，盡量避免一些糖型較差的克隆; 進行等電 聚 焦 電 泳 ( isoelectric focusing electrophore- sis，IEF) 或 者 成 像 毛 細管等電聚焦電泳 ( imaged capillary isoelectric focusing，iCIEF) ，以 及 離 子 交 換色譜 HPLC 分析，避免一些產(chǎn)生高酸或高堿變溫度、乳 酸 耐 受 能 力、NH +4 耐 受 能 力 以 及 葡 萄 糖濃度等條件的敏感程度不

33、一樣，有些對于其中一項可能非常敏感，有些可能對其中幾項都很敏感，因此在工藝開發(fā)的階段需要特別關注。6展望目前中國抗體藥物產(chǎn)業(yè)正進入關鍵的發(fā)展時期，在細胞株開發(fā)方面需要不斷堅持自主創(chuàng)新，吸 取國外先進的技 術，結合自身發(fā)展需 要，選 擇陶維紅，等: CHO 細胞株開發(fā)技術策略探討399CHO K1 或者 CHO-S 為宿主細胞、谷氨酰胺合成酶表達體系，結合 Clone Pix System 半固體培養(yǎng)基 方式挑選克隆，利用商業(yè)培養(yǎng)基快速推進 IND 申 報，同時開發(fā)自己的培養(yǎng)基和細胞培養(yǎng)工藝平臺 模式，選擇合適的產(chǎn)業(yè)化方式，促使整個抗體藥物 產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。mammalian cells with

34、 an amplifiable dominant-acting geneJProc Natl Acad Sci USA，1980，77( 6) : 3567 357013 Urlaub G，Chasin L A Isolation of Chinese hamster cell mutants deficient in dihydrofolate reductase activityJ Proc Natl Acad Sci USA，1980，77( 7) : 4216 422014 Schimke T Gene amplification in cultured animal cellsJ C

35、ell，1984，37( 3) : 705 71315 Liu P Q，Chan E M，Cost G J，et al Generation of a triple- gene knockout mammalian cell line using engineered zinc-finger nucleasesJ Biotechnol Bioeng ，2010，106( 1) : 97 10516 Lonza Group Ltd Lonza launches next generation GS geneexpression systemTM EB / OL http: / / www lon

36、za com / about-lonza / media-center / news /2012 /120710-GS-System-e aspx，2013 02 1517 劉彥君，趙 陽，王 征 我國抗體藥物產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的策略探討J 中國生物工程雜志，2006，( 10) : 93 9718 Li F，Vijayasankaran N，Shen A Y， et al Cell culture processes for monoclonal antibody productionJ Mabs，2010，2( 5) : 466 47919 Ng S K，Wang D I，Yap M G Appl

37、ication of destabilizing sequences on selection marker for improved recombinant protein productivity in CHO-DG44J Metab Eng ，2007，9 ( 3 ) :304 31620 Lietzke ，Unsicker K A statistical approach to determine monoclonality after limiting cell plating of a hybridoma cloneJ J Immunol Methods ，1985，76( 2)

38、: 223 22821 DeMaria C T，Cairns V，Schwarz C，et al Accelerated clone selection for recombinant CHO cells using a FACS-based high- throughput screenJ Biotechnol Prog ，2007，23( 2) : 465 47222 Dharshanan S，Chong H，Hung C S，et al apid automated selection of mammalian cell line secreting high level of huma

39、nized monoclonal antibody using Clone Pix FL system and the correlation between exterior median intensity and antibody productivityJ Electron J Biotechnol ，2011，14 ( 2 ) : 1 923 Haupt S，Grützner J，ath B H，et al Automated selection and collection of pluripotent stem cell colonies using the Cell

40、CelectorTMJ Nat Methods，2009，( 6) : 24 Degorce F，Card A，Soh S，et al HTF: A technology tailored for drug discovery-a review of theoretical aspects and recent applicationsJ Curr Chem Genomics，2009，( 3) : 22 3225 Li J，Schantz A，Schwegler M，et al Detection of low-affinity anti-drug antibodies and improv

41、ed drug tolerance inimmunogenicity testing by Octet ( ) biolayer interferometryJ J Pharm Biomed Anal ，2011，54( 2) : 286 294參 考 文 獻1 Deschênes I，F(xiàn)inkle C D，Winocour P D Effective use of BCH-2763，a new potent injectable direct thrombin inhibitor，in combination with tissue plasminogen activator ( tPA) in a rat arterial thrombolysis modelJ Thromb Haemost ，1998，80( 1) : 186 1912 Bi