凍干優(yōu)化方案

1、凍干優(yōu)化方案徐秀20140123一.背景介紹1凍干發(fā)展背景由于凍干藥品呈多孔狀、能長時間穩(wěn)定貯存、并易重新復水而恢復活性,因此冷凍干燥技術廣泛應用于制備固體蛋白質藥物、口服速溶藥物及藥物包埋劑脂質體等藥品。從國家藥品監(jiān)督管理局數據庫得知,目前國內已有注射用重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子、注射用重組人干擾素2b、凍干鼠表皮生長因子、外用凍干重組人表皮生長因子、注射用重組鏈激酶、注射用重組人白介素-2、注射用重組人生長激素、注射用A群鏈球菌、注射用重組人干擾素2b、凍干人凝血因子V、凍干人纖維蛋白原、間苯三酚口服凍干片等凍干藥品獲準上市。截止2000年2月,美國FDA已批準的生物技術藥共計76個

2、。冷凍干燥技術最早于1813年由英國人Wollaston發(fā)明。1909年Shsckell試驗用該方法對抗毒素、菌種、狂犬病毒及其它生物制品進行凍干保存,取得了較好效果。在第二次世界大戰(zhàn)中,對血液制品的大量需求大大刺激了冷凍干燥技術的發(fā)展,從此該技術進入了工業(yè)應用階段。此后,制冷和真空設備的飛速發(fā)展為快速發(fā)展冷凍干燥技術提供了強有力的物質條件。進入上個世紀后,科學技術的迅猛發(fā)展和人民群眾對健康保障的需求為藥品冷凍干燥技術的飛速發(fā)展提供了強大的動力,在藥品凍干損傷和保護機理、藥品凍干工藝、藥品冷凍干燥機等方面取得了巨大的成績。但藥品冷凍干燥技術是一門邊緣學科,需要生物學、藥學、制冷、真空和控制等知

3、識的交叉和綜合,因此仍存在亟待解決的問題。2藥品冷凍干燥原理及特點藥品冷凍干燥是指把藥品溶液在低溫下凍結,然后在真空條件下升華干燥,除去冰晶,待升華結束后再進行解吸干燥,除去部分結合水的干燥方法。該過程主要可分為:藥品準備、預凍、一次干燥(升華干燥和二次干燥(解吸干燥、密封保存等五個步驟。藥品按上述方法凍干后,可在室溫下避光長期貯存,需要使用時,加蒸餾水或生理鹽水制成懸浮液,即可恢復到凍干前的狀態(tài)。與其它干燥方法相比,藥品冷凍干燥法具有非常突出的優(yōu)點和特點:a 藥液在凍結前分裝,劑量準確;b 在低溫下干燥,能使被干燥藥品中的熱敏物質保留下來;c 在低壓下干燥,被干燥藥品不易氧化變質,同時能因缺

4、氧而滅菌或抑制某些細菌的活力;d 凍結時被干燥藥品可形成"骨架",干燥后能保持原形,形成多孔結構而且顏色基本不變;e 復水性好,凍干藥品可迅速吸水還原成凍干前的狀態(tài);f 脫水徹底,適合長途運輸和長期保存。雖然藥品冷凍干燥具有上述優(yōu)點,但是干燥速率低、干燥時間長、干燥過程能耗高和干燥設備投資大等仍是該技術的突出缺點。3藥品凍干損傷和保護機理藥品冷凍干燥是一個多步驟過程,會產生多種應力使藥品變性,如低溫應力、凍結應力和干燥應力。其中凍結應力又可分為枝狀冰晶的形成,離子濃度的增加,PH值的改變和相分離等情況。因此,為了保護藥品的活性,通常在藥品配方中添加活性物質的保護劑。二、凍干

5、優(yōu)化1凍干保護液配方的優(yōu)化配方中的固體含量會影響凍結和干燥過程。如果固體含量少于2%,那么凍干藥品結構的機械性能就會不穩(wěn)定。尤其在干燥過程中,藥品微粒不能粘在基質上,逸出的水蒸氣會把這些微粒帶到小瓶的塞子上,有時甚至會帶到真空室當中。此外,為了獲得均勻一致、表面光滑、穩(wěn)定的蛋白質藥品,配方中必須含有填充劑、賦形劑、穩(wěn)定劑等保護劑,這些保護劑對實現藥品的玻璃化凍結有重大的影響。很多糖類或多元醇經常被用于溶液凍融和凍干過程中非特定蛋白質的穩(wěn)定劑,它們既是有效的低溫保護劑又是很好的凍干保護劑,它們對凍結的影響取決于種類和濃度。凍干制品的整個凍干過程存在著各種各樣的應力,通常包括低溫應力、凍結應力(包

6、括枝狀冰晶的形成、離子強度的增加、PH值的改變、相分離等、干燥應力(移去蛋白質表面單層水分子等,這些應力常常是直接或間接導致蛋白質藥物不穩(wěn)定的因素。根據保護劑對抗應力的不同可把蛋白質保護劑初步分為冷凍保護劑和凍干保護劑。一個優(yōu)良的蛋白質保護劑不僅能夠在整個凍干過程中對蛋白質藥物起到良好的保護作用,而且能夠對成品貯藏期內蛋白質藥物的變性起到抑制作用,因為蛋白質藥物在貯藏期的變性率往往比在整個凍干過程中的變性率要大。保護劑的分類a糖類:蔗糖、海藻糖、甘露醇、乳糖、葡萄糖、麥芽糖等;糖是最常見、使用最廣的一類凍干保護劑,是蛋白質的非特異性穩(wěn)定劑,在凍干的各個階段(如冷凍凍融及升華干燥等均能對蛋白質藥

7、物起到一定的保護作用。糖的保護作用與其及蛋白質的種類有關。而雙糖是研究最多也是公認最有效的保護劑。糖對蛋白質的保護作用大小有時依賴于其濃度,通常在某個濃度范圍內糖的保護作用隨著濃度的升高而增大,當達到某一濃度時保護作用達到最大值而此后再增大糖的濃度則保護效果不再顯著增加有時反而會降低。蔗糖是由一分子葡萄糖及一分子果糖所構成的雙糖化學性質穩(wěn)定,多呈無定型結構。對阻止蛋白質二級結構改變,凍干處理過程中及貯藏期內蛋白質的伸展和聚集起顯著作用。海藻糖具有更高的玻璃化溫度更低的引濕性更不具有還原性。這些優(yōu)點均預示著海藻糖可能具有更廣闊的應用前景。葡萄糖在凍干過程中可部分保持無定型,對某些蛋白質藥物具有一

8、定的保護作用但應該注意的是葡萄糖系還原性糖。在選其作為蛋白質的保護劑時要慎重。b 聚合物:HES、PVP、PEG、葡聚糖、明膠、白蛋白等;通常聚合物的穩(wěn)定作用取決于聚合物的多重性質,如優(yōu)先從蛋白質表面析出、表面活性、使蛋白質溶液黏度升高從而阻止其他小分子(如糖及多羥基化合物的結晶、抑制冷凍過程中值的劇烈變化等。c 多羥基化合物:甘露醇、肌醇、聚乙二醇等;甘露醇不僅可作為優(yōu)良的骨架劑使用而且在一些處方中它能夠兼作蛋白質的凍干保護劑。d 表面活性劑:Tween、曲拉通等;吐溫、布里杰普朗尼克及十二烷基磺酸鈉等一些表面活性劑有時對冷凍及干燥過程中的蛋白質起到一定的保護作用。e 氨基酸:L-絲氨酸、谷

9、氨酸鈉、丙氨酸、甘氨酸、肌氨酸等;無定型甘氨酸可阻止凍干過程中,重組人生長激素的聚集結晶型甘氨酸能升高成品的塌陷溫度阻止因塌陷而引起的蛋白質藥物的破壞。f 鹽和胺:磷酸鹽、醋酸鹽、檸檬酸鹽等;某些凍干制品中加入鹽和胺可獲得特定的蛋白質穩(wěn)定化效果。g蛋白質:BSA、人血清蛋白蛋白質藥物本身:一些蛋白質經凍融后的活性直接和蛋白質的起始濃度有關,起始濃度升高有時會促進蛋白質的復性。外來蛋白質類保護劑:為血清白蛋白它是一個經典優(yōu)良的蛋白質穩(wěn)定劑。保護劑的選擇如何獲得穩(wěn)定的蛋白質凍干制品選擇適宜的保護劑至關重要,那么如何去選擇適宜的保護劑呢?首先要對被保護的蛋白質藥物理化特性有一個充分的了解,繼而再通過

10、試驗,摸索出在凍干過程及貯藏過程中導致該蛋白質藥物不穩(wěn)定的因素,然后針對這些不穩(wěn)定性因素選擇具體的保護劑。一般而言糖及多羥基化合物是最常用的凍干保護劑。其中蔗糖海藻糖等雙糖對一些蛋白質均能顯示出良好的保護作用。故在選取凍干保護劑時應給予優(yōu)先考慮,一個優(yōu)良的凍干保護劑應該具備多種保護特性。如高的玻璃化溫度低的吸濕性能低的結晶速率及不具有還原性基團等。 但任何單一的保護劑都不可能具備所有的保護特性,因此有時還得考慮使用兩種或兩種以上的保護劑來穩(wěn)定蛋白質藥物 。在考慮合用保護劑時,通常使用不同種類的保護劑能獲得顯著的保護效果,但是采用盡可能少的輔料種類對實際生產有著重要意義。所以在選擇保護劑時要綜合

11、考慮多種因素盡量節(jié)約成本和減少工作量保護劑對某一蛋白質的保護作用通常有一個最佳的使用濃度或使用量 。故選擇保護劑時還要合理選擇使用量。附:配方方案計劃方案緩沖液體系硼酸緩沖液Tris-HCL 體系磷酸鹽體系碳酸鹽體系糖類蔗糖海藻糖甘露醇氨基酸甘氨酸聚合物PEG PVP 蛋白質BSA PH7.68.6鹽和胺多羥基化合物1.選取配方16種配方,分別凍乳膠標記物和質控品2計劃量乳膠每種180只質控品高低各90只100ng/ml,10ng/ml 3觀察外觀(淘汰不合格配方a外形b復水性好, 藥品可形成"骨架",干燥后能保持原形,形成多孔結構而且顏色基本不變凍干藥品可迅速吸水還原成凍

12、干前的狀態(tài)4功能性(淘汰不合格配方凍干前后對比(熒光值和效價均一性(10個平行樣線性乳膠標記物:凍干前后熒光值對比。質控品:凍干前后賦值對比2凍干曲線(希望至少3條凍干曲線一般情況下,凍干曲線的選擇是三個參數:板層溫度/真空度/產品溫度.通常來說,凍干曲線的制定是一個固定模式:制訂凍干曲線應該知道產品的一些數據和裝載情況,作為設定溫度,時間和真空的依據,這些數據和情況是:產品的共晶點和崩解點溫度,產品冷凍時是否會形成玻璃態(tài),如果會形成玻璃態(tài),產品的回熱溫度是多少,產品的裝載厚度,產品的容器和裝載方法,產品的濃度,產品的最高許可溫度和干燥后的殘水含量等。例如假設某一產品的共晶點是-20,崩解點高

13、于共晶點,產品冷凍時會形成玻璃態(tài),產品的回熱溫度是-18,產品的裝載厚度是12 毫米,小瓶裝載并直接放置在板層上,產品的濃度是15%,產品的最高許可溫度是30,干燥后殘余水分含量要求是2%。要制訂凍干工藝曲線。預凍階段:為了獲得產品一致的冷凍結構,產品在5進箱,進箱完畢后保持1 小時,使所有產品從5的同一起點降溫到-40,并在-40并保持1 小時,由于產品冷凍時形成玻璃態(tài),因此需做回熱處理,把產品加熱到-18并保持1 小時,使產品從玻璃態(tài)轉變?yōu)榻Y晶態(tài),然后使產品再次降溫,并在-35保持1 小時,預凍階段結束。升華階段:板層溫度控制在10,使產品的溫度維持在-25,比產品的共晶點溫度低5,并在此

14、狀況下維持15 小時,直到產品中的凍結冰升華完畢為止;凍干箱的真空度控制在產品溫度所對應的飽和蒸汽壓的30%左右,-25對應的飽和蒸汽壓是0.63 毫巴,0.63×30%=0.189 毫巴。解吸階段:把產品溫度加熱到最高許可溫度30并維持到凍干結束,真空控制在產品溫度達到最高溫度后停止使用,恢復高真空,在最高許可溫度和高真空的狀況下保持6 小時,使產品的殘余水分達到低于2%的要求。另外,凍干良好的產品應有良好的物理形態(tài),外觀無缺損,表面平整,體積與凍結時的體積基本相等,顏色均勻一致,內部疏松多孔,復水迅速而完全,殘余水分含量合格,效價高,能長期存放。如果按照某一凍干曲線凍出的產品全部合格,凍干時間也合適,那么該凍干曲線是成熟的曲線。如果干燥后的產品不理想,某些項目不合格,那么要對凍干曲線作適當的調整。5穩(wěn)定性4和37(2個月(兩個月基本可以淘汰穩(wěn)定性不好分別測4和37的檢測值每個星期一次。乳膠標記物每個配方測高低值各5個平行樣。(所以每次每個配方需要20只凍干品質控品每個配方測高低值各5個平行樣(所以每次每個配方高低值各需要10只凍干品6連續(xù)穩(wěn)定性在合格的配方中再次凍干,