生物學(xué)抗體免疫技術(shù)

1、生物學(xué)抗體免疫技術(shù) 基本概念基本概念抗原的制備：顆?？乖?、半抗原、人工抗原抗原的制備：顆?？乖?、半抗原、人工抗原抗體的制備：多克隆抗體、單克隆抗體、基因工程抗體抗體的制備：多克隆抗體、單克隆抗體、基因工程抗體第三第三章章抗原抗體反抗原抗體反應(yīng)應(yīng) 可對抗原或抗體進(jìn)行可對抗原或抗體進(jìn)行定性、定量、定位的定性、定量、定位的檢測檢測 抗體抗原以非共價鍵抗體抗原以非共價鍵結(jié)合結(jié)合 不可見反應(yīng)：幾秒不可見反應(yīng)：幾秒-幾分鐘幾分鐘 可見反應(yīng)：數(shù)分鐘可見反應(yīng)：數(shù)分鐘（小時、日）（小時、日） 影響因素影響因素 電解質(zhì)電解質(zhì) 溫度溫度 酸堿度酸堿度第三第三章章酶聯(lián)免疫法酶聯(lián)免疫法放射免疫法放射免疫法熒光免疫法熒光

2、免疫法其他其他第三第三章章酶聯(lián)免疫法（酶聯(lián)免疫法（enzyme immunoassay) 以酶標(biāo)記抗體或抗原進(jìn)行的抗體抗原反應(yīng)以酶標(biāo)記抗體或抗原進(jìn)行的抗體抗原反應(yīng) 酶結(jié)合物應(yīng)具有雙功能：酶結(jié)合物應(yīng)具有雙功能： 高度特異的免疫反應(yīng)、生物催化放大作用高度特異的免疫反應(yīng)、生物催化放大作用 基本方法基本方法 間接法間接法 雙抗體夾心法雙抗體夾心法 競爭法競爭法 生物素生物素-親和素系統(tǒng)（親和素系統(tǒng)（biotin-avidin system，BAS） 某些新進(jìn)展某些新進(jìn)展酶聯(lián)免疫吸附酶聯(lián)免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assayenzyme linked immunos

3、orbent assay） 間接法間接法1、將已知可溶性抗原吸附于載體、將已知可溶性抗原吸附于載體2、溫育后清洗、溫育后清洗3、加入可能含特異性抗體的待檢液、加入可能含特異性抗體的待檢液4、溫育后清洗、溫育后清洗5、加入酶標(biāo)記的二抗、加入酶標(biāo)記的二抗6、溫育后清洗、溫育后清洗7、加入酶作用底物、加入酶作用底物8、測定反應(yīng)顏色深淺、測定反應(yīng)顏色深淺 雙抗體夾心法雙抗體夾心法1、將已知抗體吸附于載體上、將已知抗體吸附于載體上2、溫育后清洗、溫育后清洗3、加入可能含特異性抗原的待檢液、加入可能含特異性抗原的待檢液4、溫育后清洗、溫育后清洗5、加入酶標(biāo)記特異性抗體、加入酶標(biāo)記特異性抗體6、溫育后清洗、

4、溫育后清洗7、加入酶作用底物、加入酶作用底物8、測定顏色反應(yīng)深淺、測定顏色反應(yīng)深淺酶聯(lián)免疫吸附酶聯(lián)免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assayenzyme linked immunosorbent assay） 競爭法競爭法1、將已知抗體吸附于載體上、將已知抗體吸附于載體上2、溫育后清洗、溫育后清洗3、加入可能含特異性抗原的待檢液、加入可能含特異性抗原的待檢液和酶標(biāo)記的已知抗原液和酶標(biāo)記的已知抗原液4、溫育后清洗、溫育后清洗5、加入酶作用底物、加入酶作用底物6、測定顏色反應(yīng)深淺、測定顏色反應(yīng)深淺酶聯(lián)免疫吸附酶聯(lián)免疫吸附（enzyme linked immunos

5、orbent assayenzyme linked immunosorbent assay） 生物素生物素-親和素系統(tǒng)（親和素系統(tǒng)（biotin-avidin system） 基本概念基本概念 生物素：是一種維生素生物素：是一種維生素H，經(jīng)活化后，可與抗體、抗原、酶以多，經(jīng)活化后，可與抗體、抗原、酶以多 配一的方式共價結(jié)合，且不影響它們的活性配一的方式共價結(jié)合，且不影響它們的活性 親和素：從卵蛋白中提取的一種堿性糖蛋白，可與酶偶合，以親和素：從卵蛋白中提取的一種堿性糖蛋白，可與酶偶合，以1配多的方式對生物素有很強(qiáng)的親和力配多的方式對生物素有很強(qiáng)的親和力 BAS用于檢測的基本方法：用于檢測的基本

6、方法： BAB法或法或BRAB法法 BA法法 ABC法法酶聯(lián)免疫吸附酶聯(lián)免疫吸附（enzyme linked immunosorbent enzyme linked immunosorbent assayassay）酶聯(lián)免疫吸附酶聯(lián)免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assayenzyme linked immunosorbent assay） 均相酶免疫測定法均相酶免疫測定法 無需無需“固定在載體固定在載體上上”；無需；無需“溫育后清溫育后清洗洗” 斑點免疫結(jié)合試驗斑點免疫結(jié)合試驗 以微孔薄膜為載體，以微孔薄膜為載體，酶免疫反應(yīng)陽性結(jié)果在酶免疫反應(yīng)陽性結(jié)果在膜上

7、出現(xiàn)色斑點膜上出現(xiàn)色斑點 膠體金標(biāo)記較酶標(biāo)記膠體金標(biāo)記較酶標(biāo)記更為簡便更為簡便酶聯(lián)免疫吸附酶聯(lián)免疫吸附（enzyme linked immunosorbent enzyme linked immunosorbent assayassay）豬肉和尿液鹽酸克倫特羅的豬肉和尿液鹽酸克倫特羅的免疫膠體金法快速檢測免疫膠體金法快速檢測瘦肉精中毒事件瘦肉精中毒事件l 20002000年以來，內(nèi)地相繼發(fā)生年以來，內(nèi)地相繼發(fā)生1818起瘦肉精中毒事件，中毒人數(shù)達(dá)起瘦肉精中毒事件，中毒人數(shù)達(dá)17001700多人，死亡多人，死亡1 1人（不包括上海人（不包括上海20062006年集體中毒事件）年集體中毒事件）l

8、瘦肉精殘留及危害不容忽視，瘦肉精替代品暗潮涌動瘦肉精殘留及危害不容忽視，瘦肉精替代品暗潮涌動l 上海上海9.139.13瘦肉精食物中毒事件（瘦肉精食物中毒事件（20062006年）年）l “瘦肉精瘦肉精”學(xué)名為鹽酸克倫特羅，醫(yī)學(xué)上又稱克喘素，常用于治療哮學(xué)名為鹽酸克倫特羅，醫(yī)學(xué)上又稱克喘素，常用于治療哮喘。喘。l 由于鹽酸克倫特羅添加于飼料飼喂動物后可明顯促進(jìn)動物生長由于鹽酸克倫特羅添加于飼料飼喂動物后可明顯促進(jìn)動物生長, ,提高提高 瘦肉率瘦肉率, , 所以養(yǎng)殖戶稱其為所以養(yǎng)殖戶稱其為“瘦肉精瘦肉精”，曾在國內(nèi)外廣泛用于動物飼，曾在國內(nèi)外廣泛用于動物飼養(yǎng)養(yǎng)l 生豬食用瘦肉精后皮毛光亮，呼吸急

9、促，個別會出現(xiàn)腿抽搐，站不生豬食用瘦肉精后皮毛光亮，呼吸急促，個別會出現(xiàn)腿抽搐，站不 穩(wěn)，爬坡困難；宰后豬的肌肉特別鮮紅，后臀肌肉飽滿，肥肉非常薄穩(wěn)，爬坡困難；宰后豬的肌肉特別鮮紅，后臀肌肉飽滿，肥肉非常薄瘦肉精介紹瘦肉精介紹瘦肉精介紹瘦肉精介紹l “瘦肉精瘦肉精”化學(xué)性質(zhì)特別穩(wěn)定，加熱到化學(xué)性質(zhì)特別穩(wěn)定，加熱到170時才能被分解，故一時才能被分解，故一般家庭廚房加熱不能將其分解破壞般家庭廚房加熱不能將其分解破壞l 食用后在胃腸道吸收快，作用維持時間持久。中毒后主要癥狀表食用后在胃腸道吸收快，作用維持時間持久。中毒后主要癥狀表現(xiàn)為頭疼、頭暈、心悸、心慌、面色潮紅、四肢發(fā)抖等癥狀現(xiàn)為頭疼、頭暈、

10、心悸、心慌、面色潮紅、四肢發(fā)抖等癥狀l 違法者使用該物質(zhì)以提高豬的瘦肉率和顏色鮮艷程度，不知情的違法者使用該物質(zhì)以提高豬的瘦肉率和顏色鮮艷程度，不知情的市民市民 錯誤地認(rèn)為這樣的肉才是錯誤地認(rèn)為這樣的肉才是“好肉好肉”而特別喜歡選購而特別喜歡選購l 食品衛(wèi)生法食品衛(wèi)生法l食品添加劑衛(wèi)生管理辦法（食品添加劑衛(wèi)生管理辦法（GB2760）l動物性食品中獸藥殘留最高限量（農(nóng)業(yè)部公告第動物性食品中獸藥殘留最高限量（農(nóng)業(yè)部公告第235號，號， 2002年年12月月24日）規(guī)定：禁用藥物，動物性食品中不得檢出：日）規(guī)定：禁用藥物，動物性食品中不得檢出： 瘦肉精、沙丁胺醇、西馬特羅等瘦肉精、沙丁胺醇、西馬特羅

11、等31種種l 違法者的法律責(zé)任：民事賠償、行政處罰、刑事處罰違法者的法律責(zé)任：民事賠償、行政處罰、刑事處罰法律規(guī)定法律規(guī)定鹽酸克倫特羅殘留檢測方法鹽酸克倫特羅殘留檢測方法 l 動物性食品中克倫特羅殘留量的測定動物性食品中克倫特羅殘留量的測定 （GB5009.192-2003） 第三法：酶聯(lián)免疫法（第三法：酶聯(lián)免疫法（ELISA篩選法）篩選法） ，檢出限：，檢出限：0.5ppb l 動物組織中鹽酸克倫特羅的測定動物組織中鹽酸克倫特羅的測定氣相色譜氣相色譜/質(zhì)譜法質(zhì)譜法l 動物尿液中鹽酸克倫特羅的測定動物尿液中鹽酸克倫特羅的測定氣相色譜氣相色譜/質(zhì)譜法質(zhì)譜法l 尿液中鹽酸克侖特羅的測定膠體金免疫層

12、析法尿液中鹽酸克侖特羅的測定膠體金免疫層析法 豬肉全程監(jiān)控中瘦肉精檢測方法的選擇豬肉全程監(jiān)控中瘦肉精檢測方法的選擇生豬飼養(yǎng)生豬飼養(yǎng)屠宰場屠宰場大型批發(fā)市場大型批發(fā)市場零售市場零售市場飼料檢測飼料檢測豬尿檢測豬尿檢測豬尿檢測豬尿檢測豬肉檢測豬肉檢測豬肉豬肉檢測檢測豬肉豬肉檢測檢測酶聯(lián)免疫法酶聯(lián)免疫法免疫膠體金免疫膠體金免疫膠體金免疫膠體金酶聯(lián)免疫法酶聯(lián)免疫法免疫膠體金免疫膠體金篩檢陽性篩檢陽性GC-MSGC-MS確認(rèn)確認(rèn)大型儀器確認(rèn)大型儀器確認(rèn)政府部門政府部門監(jiān)督抽檢監(jiān)督抽檢GC-MS餐飲業(yè)餐飲業(yè)豬肉豬肉檢測檢測免疫膠體金免疫膠體金銷毀和溯源銷毀和溯源陽性陽性GC-MSGC-MS確認(rèn)確認(rèn)大型儀器

13、確認(rèn)大型儀器確認(rèn)陽性陽性免疫膠體金快速檢測板的外觀圖免疫膠體金快速檢測板的外觀圖 免疫膠體金快速檢測板免疫膠體金快速檢測板(試劑試劑)的結(jié)構(gòu)圖的結(jié)構(gòu)圖檢測原理檢測原理l 鹽酸克倫特羅快速檢測試劑板的中央膜面上固定有兩條隱形線，克鹽酸克倫特羅快速檢測試劑板的中央膜面上固定有兩條隱形線，克倫特羅抗原固定在測試區(qū)作為檢測線（倫特羅抗原固定在測試區(qū)作為檢測線（T T線），二抗固定在質(zhì)控區(qū)作線），二抗固定在質(zhì)控區(qū)作為對照線（為對照線（C C線）。線）。l 當(dāng)待檢樣品溶液滴入試劑板加樣孔后，樣品溶液因?qū)游鲎饔猛蠑U(kuò)當(dāng)待檢樣品溶液滴入試劑板加樣孔后，樣品溶液因?qū)游鲎饔猛蠑U(kuò)散。如果樣品溶液含有相應(yīng)藥物的殘留

14、，藥物將和膠體金顆粒上的散。如果樣品溶液含有相應(yīng)藥物的殘留，藥物將和膠體金顆粒上的抗體先行反應(yīng)，因此當(dāng)膠體金顆粒隨樣品溶液擴(kuò)散至抗體先行反應(yīng)，因此當(dāng)膠體金顆粒隨樣品溶液擴(kuò)散至T T線時，膠體金線時，膠體金顆粒上抗體活性位點將因被樣品溶液中的藥物占據(jù)而無法與顆粒上抗體活性位點將因被樣品溶液中的藥物占據(jù)而無法與T T線上藥線上藥物抗原結(jié)合；所以當(dāng)樣品中鹽酸克倫特羅含量物抗原結(jié)合；所以當(dāng)樣品中鹽酸克倫特羅含量1ppb(1ppb(檢測限檢測限) )以上時，以上時，試劑板上的試劑板上的T T線將較線將較C C線顯色淡或甚至無顯色，判定為陽性。反之，線顯色淡或甚至無顯色，判定為陽性。反之，當(dāng)樣品中鹽酸克倫

15、特羅含量在當(dāng)樣品中鹽酸克倫特羅含量在1ppb1ppb以下或無殘留時，試劑板上的以下或無殘留時，試劑板上的T T線線顯色與顯色與C C線相近或偏深，判定為陰性線相近或偏深，判定為陰性l靈敏度靈敏度 肉樣或組織樣：肉樣或組織樣：1ppb(1ppb(標(biāo)準(zhǔn)前處理標(biāo)準(zhǔn)前處理) )或或5ppb5ppb（簡單前處理）（簡單前處理） 尿樣：尿樣： 1ppb( 1ppb(標(biāo)準(zhǔn)前處理標(biāo)準(zhǔn)前處理) )l特異性：與沙丁胺醇等苯乙胺類藥物沒有交叉反應(yīng)；特異性：與沙丁胺醇等苯乙胺類藥物沒有交叉反應(yīng)；l準(zhǔn)確性：與瘦肉精準(zhǔn)確性：與瘦肉精ELISAELISA試劑盒的檢測結(jié)果符合率試劑盒的檢測結(jié)果符合率9090l有效期：半年（冷藏閉光保存）有效期：半年（冷藏閉光保存）膠體金免疫層析法檢測瘦