食品發(fā)酵實(shí)驗(yàn)講義

1、 實(shí)驗(yàn)一淀粉酶的制備一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)并掌握淀粉酶的制備工藝。二、實(shí)驗(yàn)原理淀粉酶廣泛存在于植物、哺乳動(dòng)物和微生物中。淀粉酶是內(nèi)切酶，酶的作用點(diǎn)僅限于淀粉鏈的1，4糖苷鍵，對(duì)1，6糖苷鍵不能作用，但能越過1，6糖苷鍵，將1，4糖苷鍵隨機(jī)切斷成長(zhǎng)短不一的短鏈糊精，而使淀粉對(duì)碘呈藍(lán)紫色的特異性反應(yīng)逐漸變紅棕色。在酶解的最初階段，淀粉酶對(duì)淀粉的水解速度很快，但當(dāng)水解到一定程度后，水解雖在繼續(xù)進(jìn)行，水解速度卻變得緩慢。該酶的最小作用底物是麥芽三糖以上的低聚糖，對(duì)麥芽三糖的作用很弱，對(duì)麥芽糖沒有水解能力。枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是當(dāng)今工業(yè)酶制劑的主要生產(chǎn)菌種之一，主要用于生產(chǎn)淀粉酶

2、、蛋白酶和脂肪酶等。本實(shí)驗(yàn)利用高產(chǎn)淀粉酶的枯草芽孢桿菌T2生產(chǎn)淀粉酶用于制備淀粉水解糖。三、實(shí)驗(yàn)器材1.菌種：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）T22.儀器：潔凈工作臺(tái)、滅菌鍋、振蕩培養(yǎng)箱、高速冷凍離心機(jī)、高壓滅菌鍋四、實(shí)驗(yàn)步驟1.培養(yǎng)基的制備與滅菌發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨5g，酵母膏2.5g，葡萄糖0.5g,可溶性淀粉2.5g，KH2PO4 1g，MgSO4.7H2O 0.25g，CaCl2.2H2O 0.1g，H2O 500mL，pH7.0。分裝于100mL錐形瓶中，每瓶50mL，121滅菌20min。2.接種與產(chǎn)酶培養(yǎng)接種環(huán)灼燒滅菌后，輕輕刮取斜面種子培養(yǎng)基中的少量菌體，接入液

3、體培養(yǎng)基中，并使環(huán)在液體與管壁接觸的部位輕輕摩擦，使菌體分散于液體中。37振蕩培養(yǎng)48 h。3.離心將發(fā)酵液置高速冷凍離心機(jī)中10000r/min離心10 min，除菌體，上清液即為淀粉酶粗酶液。1 / 16實(shí)驗(yàn)二糖化酶的制備一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)并掌握黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)生糖化酶的基本原理及操作方法。二、實(shí)驗(yàn)原理糖化酶又稱葡萄糖淀粉酶 (glucoamylase, EC 3.2.1.3)，其作用方式不像-淀粉酶那樣無(wú)作用次序,而是從底物鏈的非還原性末端開始,順次切下一個(gè)個(gè)葡萄糖單位,遇到分支處的-1,6糖苷鍵時(shí),可將-1,6糖苷鍵切開,然后繼續(xù)作用-1,4糖苷鍵,直到產(chǎn)物全部成為葡萄糖為止。但糖化酶對(duì)-

4、1,6糖苷鍵的作用速度遠(yuǎn)不及對(duì)-1,4糖苷鍵的作用速度，因此水解支鏈淀粉多的淀粉時(shí)，需延長(zhǎng)水解作用時(shí)間或添加部分支鏈淀粉酶。 我國(guó)糖化酶的生產(chǎn)主要由黑曲霉優(yōu)良菌種經(jīng)深層發(fā)酵精制提煉而成。本實(shí)驗(yàn)利用黑曲霉具有多種活力較強(qiáng)酶系的特點(diǎn)，利用淀粉類物質(zhì)為原料，獲得制備淀粉水解糖所需的糖化酶。三、實(shí)驗(yàn)材料1. 菌種：黑曲霉（Aspergillus niger）2. 儀器：潔凈工作臺(tái)、滅菌鍋、振蕩培養(yǎng)箱、高速冷凍離心機(jī)、高壓滅菌鍋四、實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)流程：保藏菌種®菌株活化及平板擴(kuò)大培養(yǎng)®搖瓶培養(yǎng)1.菌株活化及擴(kuò)大培養(yǎng)制備PDA培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g切成小塊，加水約500 mL，煮沸

5、30 min，然后用紗布過濾，濾液加蔗糖20 g，瓊脂20 g。溶化后加水定容至1000 mL，分裝于250 ml錐形瓶中，121滅菌20 min，自然pH。接種：取滅菌后PDA培養(yǎng)基倒平板，冷卻后，接種斜面保藏的黑曲霉（Aspergillus niger）菌種，28恒溫培養(yǎng)3d。 2.搖瓶發(fā)酵培養(yǎng) 發(fā)酵培養(yǎng)基的制備：玉米粉培養(yǎng)基：玉米粉30g,米糠5g,麩皮5g,加水1000ml,拌勻至無(wú)干粉又無(wú)結(jié)團(tuán)，分裝于250 ml錐形瓶?jī)?nèi)，每瓶100 ml, 自然pH，121滅菌20 min。接種與產(chǎn)酶培養(yǎng):取培養(yǎng)72h的黑曲霉平板，用打孔器打孔制成菌片。每個(gè)錐形瓶中接種12片，28振蕩培養(yǎng)96 h。

6、3.離心將搖床培養(yǎng)4d的黑曲霉發(fā)酵液4層紗布過濾后離心（10000r/min，10min）除菌體，所得上清液即為糖化酶粗酶液。實(shí)驗(yàn)三 糖化酶活力測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 掌握糖化酶酶活定義及其計(jì)算方法。酶活定義：將1g固體酶粉（或1ml液體酶），于40、pH4.6的條件下，1 h分解可溶性淀粉產(chǎn)生1mg葡萄糖所需的酶量定義為1個(gè)酶活力單位，以u(píng)/g（u/mL）表示。2. 掌握糖化酶的測(cè)定方法及原理。二、實(shí)驗(yàn)原理糖化酶是一種外切型糖苷酶，可從淀粉分子的非還原性末端依次水解-1，4-糖苷鍵生成葡萄糖。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)3，5二硝基水楊酸(DNS)與葡萄糖共熱后被還原成棕紅色的3氨基5硝基水楊酸在波長(zhǎng)540nm

7、處有較強(qiáng)光吸收且吸光度值與葡萄糖量呈正比的原理，利用分光光度計(jì)測(cè)定顯色反應(yīng)的吸光度值并根據(jù)吸光度值與葡萄糖含量的相互關(guān)系（見附圖）確定糖化酶活力。附圖：葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線三、實(shí)驗(yàn)材料1.儀器：恒溫水浴鍋、分光光度計(jì)、秒表、比色管、玻璃儀器等2.酶液：實(shí)驗(yàn)二所得粗酶液3.試劑（1）0.2 mol/L pH 4.5醋酸緩沖液：稱取16.4 g無(wú)水醋酸鈉，溶解并定容至1000 mL(A液)。取分析純冰醋酸11.6 mL定容至1000 mL（B液）。分別取A液25.5 mL，B液25.5 mL混合,加50 mL蒸餾水。（2）1mo1/L NaOH溶液:稱取40 g NaOH加蒸餾水溶解，定容至1000 m

8、l。（3）1% 3，5-二硝基水楊酸（DNS）試劑：酒石酸鉀鈉100 g溶于400 mL蒸餾水，加熱中依次加入NaOH 5 g，3，5-二硝基水楊酸5 g，苯酚1 g，亞硫酸鈉0.25 g，攪拌至溶。冷卻后定容至500 mL，儲(chǔ)于棕色瓶室溫保存。（4）2可溶性淀粉溶液：準(zhǔn)確稱取2 g可溶性淀粉(預(yù)先于100105烘干約2 h)，加少量蒸餾水調(diào)勻，傾入80 mL左右的沸蒸餾水中，繼續(xù)煮沸至透明，冷卻后定容至100 mL。四、實(shí)驗(yàn)步驟于甲、乙兩支50 mL比色管中，分別加入2可溶性淀粉25 mL及0.2mol/L醋酸緩沖液5 mL，搖勻后置40恒溫水浴中預(yù)熱510min。在甲管中加入待測(cè)酶液2 m

9、L，乙管中加2 mL蒸餾水作對(duì)照，搖勻，立即記時(shí)，準(zhǔn)確反應(yīng)30 min。取出試管，各加1 mo1/L NaOH溶液0.2 mL終止酶反應(yīng)，冷卻至室溫。吸取上述反應(yīng)液與空白液各2.5 mL于25 mL比色管中，用蒸餾水定容至刻度。分別吸取稀釋液2 mL于試管中，加入2 mL DNS，共同沸水浴3min，冷卻至室溫后測(cè)定540nm處的光吸收值。比色時(shí)空白液用于調(diào)零。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果根據(jù)下式計(jì)算出發(fā)酵液的酶活大小XA×B×32.2××n×2式中X糖化酶活力（u/mL）A根據(jù)OD值查出的葡萄糖量B吸取稀釋后糖化液2 mL，換算為1 mL，即1/21/2吸取

10、酶液2 mL，換算為1 mLn糖化液稀釋倍數(shù)（ 10×）2反應(yīng)30 min，換算成1h32.2反應(yīng)液的總體積（mL）實(shí)驗(yàn)四淀粉水解糖的制備一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)并掌握淀粉水解糖的酶法制備工藝。二、實(shí)驗(yàn)原理根據(jù)淀粉的性質(zhì)及采用的水解催化劑的不同，可將淀粉的水解方法分為酸解法、酸酶結(jié)合法和酶解法。酶解法是指利用淀粉酶將淀粉水解為葡萄糖的過程。酶解法制葡萄糖可分為兩步，第一步是利用淀粉酶將淀粉液化為糊精及低聚糖，使淀粉的可溶性增加，這個(gè)過程稱為液化；第二步是利用糖化酶將糊精或低聚糖進(jìn)一步水解，轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟堑倪^程，在生產(chǎn)上稱為糖化。淀粉的液化和糖化都是在酶的作用下進(jìn)行的，故也稱為雙酶水解法。酶解法

11、制葡萄糖的優(yōu)點(diǎn)有：（1）酶水解過程條件比較溫和，不需耐高溫、高壓和耐酸的設(shè)備，便于就地取材。（2）由于酶具有專一性，水解副反應(yīng)少，所得糖液純度高，淀粉的轉(zhuǎn)化率高。（3）可在較高淀粉乳濃度下水解。酸解法一般使用1012°Bé（含淀粉18%20%）；酶解法用2023°Bé（含淀粉34%40%），而且可以采用粗原料。（4）用酶解法制得的糖液顏色淺、較純凈、無(wú)苦味、質(zhì)量高，有利于糖液的精制。三、實(shí)驗(yàn)材料1.材料：可溶性淀粉淀粉酶糖化酶CaCl22.儀器：恒溫水浴鍋四、實(shí)驗(yàn)步驟1.淀粉的液化稱取淀粉2 g，加水至100 mL，滴加NaOH調(diào)節(jié)pH為6.06.5，加

12、0.11g CaCl2使Ca2濃度達(dá)到0.01mol/L，加入50 mL實(shí)驗(yàn)一中枯草芽孢桿菌T2產(chǎn)生的淀粉酶粗酶液，在8590下保溫30min，碘液檢測(cè)顯棕色時(shí)，迅速升溫至100，加熱5min使淀粉酶失活，即可轉(zhuǎn)入糖化階段。2.淀粉的糖化將上述液化液降溫至60，調(diào)整pH為4.04.5，按100u/g淀粉的量加入實(shí)驗(yàn)二中黑曲霉產(chǎn)生的糖化酶粗酶液，保溫48h左右，分別在0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、6h、12h、24h、48h取反應(yīng)液加入碘液5ml，觀察顏色變化。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果接近碘液顏色時(shí)表明糖化完畢。實(shí)驗(yàn)五檸檬酸的發(fā)酵與結(jié)晶一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆沼靡后w發(fā)酵法生產(chǎn)檸檬酸及用鈣鹽法獲得檸

13、檬酸結(jié)晶的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理以淀粉質(zhì)為原料發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸的微生物，都需要先將淀粉分解成葡萄糖，然后再進(jìn)一步由葡萄糖生成檸檬酸。由于黑曲霉自身能產(chǎn)生液化酶和糖化酶，且糖化酶活力較高，故檸檬酸生產(chǎn)的糖化、發(fā)酵是由黑曲霉（Aspergillus niger）一個(gè)菌株完成的，即黑曲霉可以邊長(zhǎng)菌、邊糖化、邊發(fā)酵產(chǎn)酸的方式生產(chǎn)檸檬酸。發(fā)酵前期我們利用了黑曲霉產(chǎn)生的糖化酶來(lái)制備淀粉水解糖（實(shí)驗(yàn)二），本實(shí)驗(yàn)利用鈣鹽法從后期黑曲霉檸檬酸發(fā)酵液中分離提取并獲得檸檬酸的結(jié)晶。鈣鹽法結(jié)晶檸檬酸的主要原理是，在除雜后的發(fā)酵液中加鈣鹽生成檸檬酸鈣沉淀，達(dá)到與其它可溶性雜質(zhì)分開的目的；然后在檸檬酸鈣中加入硫酸酸解，生成檸檬

14、酸和硫酸鈣沉淀，濃縮除去硫酸鈣沉淀后的檸檬酸溶液即得檸檬酸結(jié)晶。主要反應(yīng)式為：2C 6H 8O 7·H 2O+3CaCO3®Ca3(C6H 5O 7)2·4H2O+3CO2+H 2OCa3(C6H 5O 7) 2·4H 2O+3H2SO4+4H 2O®2C6H 8O7·H2O+3CaSO4·2H2OCaCO3+H2SO4 ®CaSO4+H2O+CO2附錄：1.根據(jù)檸檬酸的生成量，由上面反應(yīng)式可計(jì)算出中和檸檬酸所需CaCO3的量（每中和C6H 8O7·H 2O 100 g需要CaCO3 71.5 g）及酸解

15、時(shí)加入H2SO4的量（每加入1g CaCO3需要H2SO4 0.98 g）。2.檸檬酸含量的測(cè)定：吸取1 mL除雜后的上清液，加入到100 mL錐形瓶中，再加適量的去離子水，加23滴1酚酞試劑，用0.1429 molL NaOH進(jìn)行滴定至微紅色，計(jì)算用去的NaOH體積，記為檸檬酸的百分含量（每消耗1mLNaOH為1%的酸度，即每100 ml檸檬酸溶液中所含檸檬酸的質(zhì)量為1g），用檸檬酸的百分含量乘以發(fā)酵液的體積即檸檬酸的含量。三、實(shí)驗(yàn)材料1.儀器：恒溫水浴鍋，鼓風(fēng)干燥箱，離心機(jī) 2.發(fā)酵液：實(shí)驗(yàn)二中搖床培養(yǎng)4d的黑曲霉發(fā)酵液3.試劑：CaCO3 ，1酚酞試劑硫酸溶液（1 molL H2SO4）

16、氫氧化鈉溶液（NaOH，0.1429 molL）四、實(shí)驗(yàn)流程檸檬酸發(fā)酵液®離心去除菌體及殘?jiān)?#174; CaCO3中和上清液®離心得檸檬酸鈣沉淀®H2SO4酸解®離心除硫酸鈣沉淀®濃縮含檸檬酸的上清液®檸檬酸結(jié)晶五、實(shí)驗(yàn)步驟1.除雜：將實(shí)驗(yàn)二所得粗酶液加熱至80保溫30 min，離心（4000r/min，10min）取上清，用酸堿滴定法測(cè)上清液中檸檬酸含量（方法見上附錄）。2CaCO3中和沉淀：根據(jù)檸檬酸的含量計(jì)算出CaCO3的添加量。在上述上清液中，邊攪拌邊緩慢加入CaCO3，然后置85恒溫水浴中加熱，保溫?cái)嚢?0min，趁熱離心

17、（4000r/min，10min），并用80左右的熱水洗滌離心后的沉淀。3酸解：在檸檬酸鈣沉淀中加入100 mL去離子水調(diào)勻，再加熱至85，加入H2SO4溶液（添加量根據(jù)中和所用CaCO3的量計(jì)算），邊加邊攪拌，之后繼續(xù)保溫?cái)嚢?0min，離心（4000r/min，10min），得清亮棕黃色的酸解液。4濃縮：將酸解液置70鼓風(fēng)干燥箱中，過夜?jié)饪s。5結(jié)晶：將濃縮液置50恒溫水浴鍋中結(jié)晶。50保溫40 min后關(guān)掉電源，自然降至室溫，得檸檬酸結(jié)晶。六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.將實(shí)驗(yàn)中所得數(shù)據(jù)填入下表項(xiàng)目測(cè)定或計(jì)算值檸檬酸含量中和所需CaCO3的量酸解時(shí)添加H2SO4溶液的體積2.描繪檸檬酸的晶體形態(tài)。七、注意

18、事項(xiàng)結(jié)晶過程注意控制中和及酸解時(shí)加入的硫酸量不應(yīng)過多，否則易造成結(jié)晶后得到黑糊狀雜質(zhì)。實(shí)驗(yàn)六檸檬酸的紙層析鑒定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆沼眉垖游鲨b定檸檬酸的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理紙層析是以濾紙作為支持物的分配層析法，由于設(shè)備簡(jiǎn)單，操作方便，所需樣品量少，分辨力較高等優(yōu)點(diǎn)而廣泛用于物質(zhì)的分離及定性和定量分析。本實(shí)驗(yàn)用紙層析對(duì)實(shí)驗(yàn)五獲得的檸檬酸進(jìn)行鑒定，所用的展開劑是由水飽和的有機(jī)溶劑組成，由于水與濾紙纖維素有較強(qiáng)的親和力，因而其擴(kuò)散作用降低，形成固定相，而有機(jī)溶劑與濾紙親和力弱，可在濾紙毛細(xì)管中自由流動(dòng)，形成流動(dòng)相，由于混合液中各組分在兩相中的分配系數(shù)不同，在流動(dòng)相中的移動(dòng)速率（即遷移率Rf值）就不同，從而在

19、濾紙上形成距原點(diǎn)不等的層析點(diǎn)。Rf = 原點(diǎn)到層析斑點(diǎn)中心的距離/原點(diǎn)到溶劑前沿的距離三、實(shí)驗(yàn)材料1.器材：新華1號(hào)濾紙，噴霧器, 培養(yǎng)皿，吹風(fēng)機(jī)等。2.試劑：2 %檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)溶液及2 %草酸標(biāo)準(zhǔn)溶液展開劑：正丁醇：甲酸：水：冰醋酸=4：1：4：1（體積比）搖勻。顯色劑：稱取溴甲酚綠粉末0.1g移至研缽中，分?jǐn)?shù)次加入適量的0.01mol/L NaOH溶液，仔細(xì)研磨直至溶解為止，最終用蒸餾水稀釋至250 ml，配成0.04%溴甲酚綠試劑。（注意展開劑要現(xiàn)配現(xiàn)用，出現(xiàn)分層后不能繼續(xù)使用）四、實(shí)驗(yàn)步驟1.濾紙的準(zhǔn)備：取濾紙（新華一號(hào)濾紙4×15cm）1張，在濾紙縱向?qū)?yīng)的兩邊距邊沿2cm處

20、，各畫兩條平行線，一條作前沿標(biāo)志，一條作點(diǎn)樣線，在點(diǎn)線上每隔2cm畫一個(gè)“+”作為點(diǎn)樣位置，共3個(gè)點(diǎn)。2.點(diǎn)樣：分別點(diǎn)上標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸溶液、標(biāo)準(zhǔn)草酸溶液、檸檬酸樣品溶液，每個(gè)點(diǎn)樣10uL重復(fù)2次，每次點(diǎn)樣后要用吹風(fēng)機(jī)冷風(fēng)吹干，每點(diǎn)在紙上擴(kuò)散的直徑約35mm，注意點(diǎn)樣時(shí)勿用手直接觸碰濾紙。點(diǎn)樣完畢用標(biāo)簽紙或大頭針將濾紙做成筒形，點(diǎn)樣面向外,注意紙的兩邊不要接觸。3.展層：培養(yǎng)皿中加入展開劑，液層不要超過點(diǎn)樣線，（高約1.5cm，約5060 mL溶劑）將筒狀濾紙豎直放入，待溶劑到達(dá)標(biāo)志線后取出，冷風(fēng)吹干。展層時(shí)間約0.51 h。4.顯色：取出濾紙，用電吹風(fēng)吹干,用噴霧器噴上顯色劑后再吹干。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

21、1. 繪出紙層析的顯色結(jié)果；2. 測(cè)量原點(diǎn)至色譜中心和至溶劑前沿的距離，計(jì)算Rf值。實(shí)驗(yàn)七葡萄酒的釀制葡萄酒是葡萄汁發(fā)酵而成的低度酒精飲料，它的主要成分有單寧、酒精、糖分、有機(jī)酸等。葡萄酒的品種繁多，按酒色分為白葡萄酒、桃紅葡萄酒、紅葡萄酒；按酒中糖分含量分為干葡萄酒、半干葡萄酒、半甜葡萄酒、甜葡萄酒；按飲用方式分為餐前、佐餐和餐后葡萄酒；按釀造方法分為天然葡萄酒、加強(qiáng)葡萄酒、添香葡萄酒；按酒中CO2含量分為靜酒和起泡酒。葡萄酒的生產(chǎn)工藝成熟，原料來(lái)源豐富。既可工廠大規(guī)模生產(chǎn)，又可莊園小批量釀造。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)葡萄酒釀制的原理，掌握干白和干紅葡萄酒釀制工藝。二、實(shí)驗(yàn)原理葡萄酒的釀造原理是利用

22、葡萄皮自帶的酵母或人工接種的酵母菌，將葡萄汁中的葡萄糖、果糖發(fā)酵，生成酒精、二氧化碳，同時(shí)生成副產(chǎn)物高級(jí)醇、脂肪酸、揮發(fā)酸和酯類等，并將葡萄原料中的色素、單寧、有機(jī)酸、果香物質(zhì)、無(wú)機(jī)鹽等所有與葡萄酒質(zhì)量有關(guān)的成分，都帶到發(fā)酵的原料酒中，再經(jīng)陳釀澄清，使酒質(zhì)達(dá)到清澈透明、色澤美觀、滋味醇和、芳香宜人。三、實(shí)驗(yàn)材料與儀器1材料：新鮮葡萄，活性干酵母菌，6的亞硫酸，白砂糖，酒石酸(檸檬酸)，濾紙，酒精，皂土，紗布，漏斗。 2.試劑：0.1molL NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液，4g/L濃度的碘液(精確濃度為3.97g/L)，2可溶性淀粉溶液，1.0g/L標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液（鹽酸酸化）， 1molL NaOH溶液，1

23、/3濃度的硫酸。3.儀器：手持式糖度，酒精度計(jì)，密度計(jì)。四、干白葡萄酒的釀造1.工藝流程成熟的葡萄（紅皮白肉或白葡萄）分選除梗破碎榨汁加二氧化硫靜置澄清分離清汁調(diào)整成分發(fā)酵分離酒泥原酒貯存換容器密閉貯存下膠過濾冷凍過濾灌裝干白葡萄酒2操作步驟（1）器具準(zhǔn)備破碎葡萄之前，先將用具洗刷干凈，發(fā)酵及貯酒容器用6的亞硫酸溶液沖洗，或用硫磺煙熏進(jìn)行消毒。所用器具應(yīng)選擇水缸、上釉陶缸、玻璃瓶、橡木桶、瓷盆等，不得用鐵、銅制作的工具，因葡萄汁（酒）與鐵、銅接觸，會(huì)使鐵、銅離子溶進(jìn)葡萄汁，而使酒變質(zhì)敗壞。（2）原料與分選釀酒用的葡萄要成熟。成熟的葡萄種子為褐色或深褐色，綠色的葡萄果皮由綠色變?yōu)辄S色或淺黃色，果

24、實(shí)透明發(fā)亮。紅色葡萄呈紫色或紫黑色，味酸甜。將采收的葡萄剔除霉?fàn)€的果子和青果以及其他雜質(zhì)，取樣化驗(yàn)酸度，糖度。（3）破碎與壓榨將分選好的葡萄放在瓷盆內(nèi)，除去果梗，榨取果汁，汁與皮渣分別放在不同的玻璃瓶?jī)?nèi)進(jìn)行發(fā)酵。葡萄汁發(fā)酵后為一級(jí)酒，皮渣發(fā)酵后為普通酒。（4）果汁澄清葡萄經(jīng)破碎榨汁后，按每升葡萄汁加入2.5ml 6的亞硫酸溶液（相當(dāng)于添加二氧化硫150mg/L），靜置24h待汁液澄清后，分離沉淀物，得澄清葡萄汁。（5）果汁成分調(diào)整我國(guó)大多數(shù)地區(qū)葡萄的含糖量在1220，發(fā)酵后生成711.7的酒精，因酒精含量較低，所以需要在葡萄汁發(fā)酵期，補(bǔ)加白砂糖,使發(fā)酵后生成所需濃度的酒精。實(shí)際生產(chǎn)上，每生成1

25、酒需要1.7度糖（1.7）。果汁含糖量調(diào)整到21-23，用葡萄汁溶解糖并在發(fā)酵旺盛時(shí)添加。式中m加糖量（g）0.6251kg糖溶解后所占體積（L）V葡萄汁體積（L） 需要達(dá)到的酒精含量（） b葡萄汁的含糖量（）（6）酸度調(diào)整配制葡萄酒，要求果汁含酸量在0.81.2g/100ml為宜，果汁的酸度如果低于0.5g/100ml，可補(bǔ)加酒石酸或利用酸度高的品種葡萄混合發(fā)酵，使其酸度達(dá)到要求。(本實(shí)驗(yàn)不調(diào))（7）發(fā)酵將調(diào)整成分的果汁放在玻璃試劑瓶中，果汁量約為容器的80，不宜過量，以防發(fā)酵時(shí)產(chǎn)生泡沫溢出而造成損失。瓶口蓋上安有發(fā)酵栓的橡膠塞，使發(fā)酵產(chǎn)生的CO2排出，又不致使發(fā)酵瓶外的雜菌進(jìn)入發(fā)酵瓶。本實(shí)

26、驗(yàn)用添加0.04的活性干酵母進(jìn)行發(fā)酵，方法是先用3040的水活化酵母2030min。發(fā)酵過程中，一般溫度為1418，不允許超過20。可把發(fā)酵瓶放在盛水的浴盆內(nèi)，通過調(diào)節(jié)浴盆內(nèi)水溫（比如加冰塊或換水）控制發(fā)酵溫度，也可把發(fā)酵瓶放在控溫培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行發(fā)酵。當(dāng)發(fā)酵進(jìn)入旺盛期時(shí)（液面有大量氣泡）一次性加入所要調(diào)整的糖（用正在發(fā)酵的葡萄汁溶解糖）低溫發(fā)酵的時(shí)間較長(zhǎng)，主發(fā)酵510d，后發(fā)酵為1525d，當(dāng)發(fā)酵液面較平靜，溫度下降，殘?zhí)切∮?g/L時(shí)（口嘗發(fā)酵液感覺不到甜味），表明發(fā)酵已完成。在發(fā)酵過程中，每天測(cè)兩次溫度和殘?zhí)?。測(cè)量前，把溫度計(jì)用70酒精擦洗，把取樣管經(jīng)干熱滅菌，以防發(fā)酵液染菌。取樣及測(cè)溫均應(yīng)

27、在發(fā)酵液位中部。（8）分離酒泥發(fā)酵結(jié)束1520d或1個(gè)月后即可分離酒腳，把相同的酒合并入一個(gè)容器內(nèi)，即用同品種、同類型的酒添至容器容積的9095，同時(shí)按每升2.5ml加入6的亞硫酸溶液,以防雜菌污染引起揮發(fā)酸升高。添完后，再用發(fā)酵栓封閉，進(jìn)入貯存期。（9）葡萄酒的貯存在貯存期應(yīng)定期檢查，經(jīng)常保持貯酒室的衛(wèi)生，切忌蒼蠅侵入酒內(nèi)并及時(shí)添加二氧化硫，添加量以化驗(yàn)為依據(jù)。酒中保持游離二氧化硫在3050mg/L，小于需添加。室內(nèi)定期消毒，冬季一般一月一次，夏季710d一次。換容器（大規(guī)模生產(chǎn)稱為換桶）：后發(fā)酵結(jié)束后，進(jìn)行第2次換容器，大約5個(gè)月后進(jìn)行第3次換容器。每次換容器后都應(yīng)補(bǔ)充二氧化硫，使酒中保持

28、游離二氧化硫在30-50mg/L。密封貯存。貯存約1年。添滿（大規(guī)模生產(chǎn)稱為添桶）：每次換容器盡量使容器滿載酒液。（10）下膠皂土下膠方法：將皂土用6080的溫開水浸泡，每天攪拌數(shù)次，制成6%的懸浮液，每升加6的亞硫酸溶液1.6ml(相當(dāng)于添加二氧化硫100mg/L),備用。按每升葡萄酒加0.41g/L(本實(shí)驗(yàn)加0.8g/L)加含有6%皂土的懸浮液，邊加邊攪拌后靜置57d酒液徹底澄清后，虹吸分離沉淀物并過濾。（11）過濾原酒一般酒精含量為大于10%，含酸量0.50.7g/100ml，揮發(fā)酸含量在0.05g/100ml以下，含糖量在0.4g/100ml以下。（12）冷凍（生產(chǎn)上通常利用冬季溫度降至-46維持715d后將酒與含酒石酸氫鹽的酒泥分離，除去酒石）五、紅葡萄酒釀造工藝1.工藝流程成熟的紅葡萄分選去梗破碎加二氧化硫發(fā)酵壓榨調(diào)整酒精含量后發(fā)酵換容器貯存換容器貯存陳釀下膠過濾冷凍過濾灌裝干紅葡萄酒2.操作步驟干紅葡萄酒的釀造工藝與干白葡萄酒的釀造工藝相似。不同的是，葡萄破碎后不壓榨，將皮肉汁混合發(fā)酵，以浸提果皮上的色素，不同的操作如下：（1）發(fā)酵發(fā)酵溫度可達(dá)33，生產(chǎn)中控制在2830之間，主發(fā)酵期一般為35d。紅葡萄酒發(fā)酵分以下3個(gè)階段：發(fā)酵初期：主要為酵母繁殖