絡(luò)泰對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

1、絡(luò)泰對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用 【摘要】 目的：觀察絡(luò)泰對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用并探討其可能機(jī)制。方法：將大鼠隨機(jī)分成六組：假手術(shù)組、模型組、絡(luò)泰5 mg/kg組、50 mg/kg組、100 mg/kg組和陽(yáng)性對(duì)照復(fù)方丹參注射液組，應(yīng)用線栓法制備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型（MCAO），觀察缺血2 h再灌注24 h后絡(luò)泰對(duì)大鼠行為、腦梗死面積、腦含水量的影響，用放免法測(cè)定血漿中TXB2(血栓素B)和 6-Keto-PGF1(6-酮-前列腺素F1)的水平。結(jié)果：絡(luò)泰50 mg/kg組、100 mg/kg組能明顯改善MCAO大鼠行為障礙、腦梗死范圍、腦含水量。大鼠血漿的TX

2、B2含量及TXB2/6-Keto-PGF1 (T/P)值較模型組明顯降低(P0.05)，6-Keto-PGF1含量顯著增高(P0.05)。結(jié)論：絡(luò)泰能通過降低血栓素A2（TXA2），升高PGI2，使TXA2/PGI2比值降低，達(dá)到對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。 【關(guān)鍵詞】 絡(luò)泰 局灶性腦缺血 缺血再灌注損傷 TXB2 6-Keto-PGF1 Abstract Objective：To investigate the protective effects and mechanism of Luotai against local cerebral ischemia and reperf

3、usion injury in rats. Methods：Wistar rats were divided into 6 groups randomly. They are treated with Luotai at the dose of 5 mg/kg,50 mg/kg,100 mg/kg,Danshen（100 mg/kg）and normal saline injection respectively. Models of local cerebral ischemia/reperfusion were prepared with middle cerebral artery oc

4、clusion (MCAO). The neurologyic status of each rat, the infarction area of brain tissue and the water content were measured after 2 hour of occlusion followed by 24 hour reperfusion. We observed the effect of Luotai on TXB2 and 6-Keto-PGF1 by radioimmunoassay. Resluts：Luotai (50 mg/kg, 100 mg/kg) ma

5、rkedly improve the neurologyic status and decrease the cerebral infarction, the water content of brain. Luotai(50 mg/kg,100 mg/kg) could increase the generation of 6-Keto-PGF1 and decrease the level of TXB2 and TXB2/6-Keto-PGF1(T/P) in blood plasma.Conclusion：Luotai has protective effect on local ce

6、rebral ischemia/reperfusion injury in rats by increasing the generation of 6-Keto-PGF1,decreasing the level of TXB2 and improving the balance of TXA2/PGI2 in blood plasma. Key words Luotai injection；Local cerebral ischemia；Cerebral ischemia and reperfusion；TXB2；6-Keto-PGF1 絡(luò)泰是三七總皂苷凍干粉針劑。三七總皂苷具有活血祛瘀、

7、通脈活絡(luò)、降壓、抗心律失常等作用。常用于中風(fēng)偏癱、瘀血阻絡(luò)及腦血管疾病后遺癥、胸痹心痛、視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞屬瘀血阻滯證者。本實(shí)驗(yàn)通過線栓大腦中動(dòng)脈法制備大鼠腦局灶缺血再灌注模型，觀察絡(luò)泰對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，通過檢測(cè)血漿中PGI2的穩(wěn)定代謝產(chǎn)物6-Keto-PGF1和TXA2的穩(wěn)定代謝產(chǎn)物TXB2水平，探討其作用機(jī)制，為臨床用藥提供一定的科學(xué)依據(jù)。 1 材料與方法 1.1 動(dòng)物 健康Wistar大鼠，體重(22020) g，雌雄兼用(由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。 1.2 藥品及試劑 絡(luò)泰粉針劑(昆明制藥股份有限公司，批號(hào)：050520)，用絡(luò)泰溶劑溶解，再用生理鹽水稀釋

8、后備用。復(fù)方丹參注射液(黃山市天目藥業(yè)有限公司，批號(hào)：050601)。TXB2、6-Keto-PGF1放免測(cè)定試劑盒(北京東亞免疫技術(shù)研究所，批號(hào)：060113)。 1.3 方法 1.3.1 分組：大鼠隨機(jī)分為六組，分別為絡(luò)泰小劑量組(5 mg/kg)，絡(luò)泰中劑量組 (50 mg/kg)，絡(luò)泰大劑量組(100 mg/kg)，復(fù)方丹參組(100 mg/kg)，模型組，假手術(shù)組。絡(luò)泰組、復(fù)方丹參組預(yù)先連續(xù)尾靜脈注射給藥，每天1次，連續(xù)5 d，再灌注6 h、12 h時(shí)再給藥兩次。模型組和假手術(shù)組大鼠注射生理鹽水，給藥時(shí)間及體積同前。 1.3.2 大鼠局灶性腦缺血再灌注模型的建立：參照Longa等的方

9、法并加以改進(jìn)制備左側(cè)大腦中動(dòng)脈阻塞 (middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型。頸正中做約1.5 cm皮膚切口，暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈（common carotid artery，CCA）、頸外動(dòng)脈（external carotid artery，ECA）及頸內(nèi)動(dòng)脈（internal carotid artery，ICA），結(jié)扎ECA，將頭端用石蠟包被的尼龍魚線通過CCA切口處插入ICA，插線長(zhǎng)度自CCA分叉處約18 mm20 mm（根據(jù)動(dòng)物體重而定），然后縫合皮膚，栓線尾端部分固定于皮膚上。于缺血2 h后，抽出尼龍魚線予以再灌注24 h。假手術(shù)組大鼠只分離出

10、CCA、ECA和ICA，不結(jié)扎任何動(dòng)脈及插線。 1.3.3 神經(jīng)行為缺陷評(píng)分：標(biāo)準(zhǔn)0分：無(wú)神經(jīng)功能缺失癥狀；1分：提大鼠尾，見癱瘓側(cè)前肢回收屈曲不能正常伸向地面；2分：推癱瘓側(cè)時(shí)感阻力較對(duì)側(cè)明顯降低；3分：大鼠爬行時(shí)向癱瘓側(cè)旋轉(zhuǎn)；4分：伴有意識(shí)障礙。 1.3.4 腦梗死范圍測(cè)定：在缺血2 h再灌注24 h后，每組取8只動(dòng)物，斷頭取腦，剔除嗅腦、低位腦干及小腦，稱重后置于-20 低溫冰箱快速冷凍30 min后，將腦組織做冠狀切片，厚度約為2 mm。腦片置于1% TTC溶液中，37 避光孵育30 min。待顯色完全后置50甲醛溶液中固定24 h。仔細(xì)分離蒼白區(qū)和非蒼白區(qū)，分別稱重，計(jì)算梗死區(qū)腦質(zhì)量

11、占全腦質(zhì)量的百分比作為梗死范圍。 1.3.5 腦組織含水量的測(cè)定： 參照Hallenbeck法，每組取8只動(dòng)物，切取大腦前極到視交叉處的腦片，分別稱量左腦片濕重；105 烘干至恒重，即干重。按下列公式計(jì)算腦含水量，腦含水量()=腦濕重(g)-腦干重(g)/腦濕重(g)100。 1.3.6. 血漿中6-Keto-PGF1和TXB2的測(cè)定：斷頭取腦同時(shí)取血3 mL于EDTA抗凝離心管中，混勻，4 離心3 500 r/min，15 min，分離血漿，放于-20 保存，而后按放免試劑盒說明，自動(dòng)計(jì)數(shù)器預(yù)先編程，直接測(cè)出樣品濃度。 2 結(jié)果 2.1 對(duì)大鼠行為障礙的影響 局灶性腦缺血2 h再灌注24 h

12、后，除假手術(shù)組外，所有動(dòng)物出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能障礙，模型組尤為明顯，主要表現(xiàn)為跛行和手術(shù)對(duì)側(cè)癱瘓。經(jīng)絡(luò)泰及復(fù)方丹參注射液治療后腦缺血大鼠的行為障礙有不同程度的改善，結(jié)果見表1。 2.2 對(duì)大鼠腦梗死范圍的影響 假手術(shù)組大鼠腦組織呈均勻一致的玫瑰紅色，無(wú)缺血梗死灶，其他各組大鼠大腦皮質(zhì)均出現(xiàn)明顯蒼白色的梗死灶，與模型組相比，復(fù)方丹參注射液及絡(luò)泰50 mg/kg、100 mg/kg劑量組可明顯縮小局灶性腦缺血大鼠的腦梗死面積，結(jié)果見表1。 2.3 對(duì)大鼠腦組織含水量的影響 與假手術(shù)組相比，其他各組病灶側(cè)半球含水量明顯增加，復(fù)方丹參注射液及絡(luò)泰50 mg/kg、100 mg/kg劑量組腦水腫程

13、度較模型組明顯降低，結(jié)果見表1。表1 絡(luò)泰對(duì)局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠行為缺陷程度、腦梗死范圍、腦組織含水量的影響與模型組相比，*P0.05，* P0.01 2.4. 血漿中6-Keto-PGF1和TXB2的水平 與假手術(shù)組相比，腦缺血再灌注模型組大鼠血漿中TXB2及TXB2/6-Keto-PGF1(T/P)值明顯升高。與模型組比較，絡(luò)泰50 mg/kg、100 mg/kg劑量組和復(fù)方丹參注射液組TXB2及T/P值均明顯降低，而6-Keto-PGF1則明顯高于模型對(duì)照組。表2 絡(luò)泰對(duì)局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠血漿TXB2和6-Keto-PGF1水平及T/P比值的影響與假手術(shù)組相比，# P0.0

14、5，# P0.01；與模型組相比，* P0.05，* P0.01 3 討論 在急性腦血管病中，缺血性腦血管疾病占5070，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)發(fā)病后48 h內(nèi)，絕大多數(shù)病人的缺血皮質(zhì)已發(fā)生了再灌注。眾所周知，腦缺血后的再灌注是神經(jīng)功能恢復(fù)的基本條件，也是腦組織損傷加重的重要因素。三七乃活血化瘀之良藥，研究證實(shí)其有抗自由基、降低血黏度、抗血小板聚集、擴(kuò)張血管、降低血脂、改善微循環(huán)和抑制血栓形成及抗炎等作用。本研究應(yīng)用線栓法制備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型來(lái)觀察絡(luò)泰對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，結(jié)果絡(luò)泰能明顯降低腦水腫、縮小梗死面積和改善運(yùn)動(dòng)功能，顯示出良好的腦缺血保護(hù)作用。這與文獻(xiàn)報(bào)道三七皂苷能減輕鈣超載、

15、腦水腫、超微結(jié)構(gòu)的損傷，促進(jìn)再灌注時(shí)的神經(jīng)修復(fù)和降低缺血再灌注期間死亡率等結(jié)果相一致45。 目前，腦缺血再灌注損傷的病理生理是一個(gè)多環(huán)節(jié)、多因素、多途徑損傷的酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)，其中血栓素與前列腺素系統(tǒng)失衡是其發(fā)生的機(jī)制之一。PGI2和TXA2均為花生四烯酸的代謝產(chǎn)物，在正常情況下，PGI2和TXA2保持著動(dòng)態(tài)平衡以維持對(duì)血管及供血的調(diào)節(jié)，而病理狀態(tài)下花生四烯酸代謝異常，導(dǎo)致PGI2和TXA2的比例失調(diào)，血小板合成TXA2增多，血管內(nèi)皮細(xì)胞生成PGI2受抑制，血小板呈現(xiàn)高凝狀態(tài)，微血管收縮性增強(qiáng)等，導(dǎo)致低灌流，加重缺血組織的損傷。由于PGI2和TXA2性質(zhì)不穩(wěn)定難以直接測(cè)定，故測(cè)定PGI2的穩(wěn)定代謝

16、產(chǎn)物6-Keto-PGF1和TXA2的穩(wěn)定謝產(chǎn)物TXB2作為判斷PGI2和TXA2水平的指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)表明大鼠缺血/再灌注后大鼠血漿中TXB2及T/P值明顯升高(P0.01)，而絡(luò)泰中高劑量組能抑制腦缺血再灌注模型大鼠血漿中TXB2的生成，同時(shí)增加6-Keto-PGF1在血漿中的含量，使T/P比值降低，故我們認(rèn)為絡(luò)泰有良好的腦缺血保護(hù)作用，降低TXA2合成，升高PGI2，降低T/P比值是其對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用機(jī)制之一?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et alReversible middle cerebral artery occlusion without cranie