替米考星分子印跡聚合物的制備及其固相萃取研究

1、替米考星分子印跡聚合物的制備及其固相萃取研究         11-04-22 15:04:00     編輯：studa20                  作者：鄭亞秋 曹湛 郭宏斌 張青杰 賀利民* 陳清菊 駱飚【摘要】  以泰樂菌素為虛擬模板分子，甲基丙烯酸為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯

2、為交聯(lián)劑，合成了對替米考星具有高選擇性的分子印跡聚合物?？疾炝硕谆柞０?、甲醇、丙酮和氯仿4種致孔劑對合成聚合物性能的影響。通過正交實驗優(yōu)化的聚合配方為：1.0 mmol泰樂菌素，8.0 mmol甲基丙烯酸，20.0 mmol乙二醇二甲基丙烯酸酯，6.0 mL氯仿，20.0 mg偶氮二異丁腈。研究了將該聚合物作為固相萃取填料分離、富集替米考星的萃取條件和萃取性能。當萃取柱依次用甲醇和水（pH 9.0）活化，乙腈溶液上樣，甲醇和氯仿分別洗滌，3 mL氨化甲醇（955，V/V）洗脫時，替米考星在分子印跡固相萃取柱上的回收率達到90%以上，而非分子印跡固相萃取柱的回收率僅為32。 【關(guān)鍵詞】

3、60; 分子印跡聚合物；替米考星；固相萃??；虛擬模板Abstract  Molecularly imprinted polymers(MIPs) with high selectivity to tilmicosin(TIM) were prepared using tylosin(TYL) as dummy template，methacrylic acid(MAA) as monomer，ethylene glycol dimethacrylate(EGDMA) as cross-linker.The effects of 4 porogens including dimethy

4、l formamide，methanol，acetone，and chloroform on the recognition capability of MIPs were investigated.Orthogonal test was used to optimize the preparation of MIPs，and the optimal composition was as follows: 1.0 mmol TYL，8.0 mmol MAA，20.0 mmol EGDMA，6.0 mL chloroform，20.0 mg azobisisobutyronitrile.The

5、solid phase extraction conditions and characteristics of MIPs as adsorptive material for the selective extraction and enrichment of TIM were also studied.The recovery of TIM was above 90% when the following procedure was applied to MIPs cartridge: conditioning with methanol and water(pH 9.0)，loading

6、 with acetonitrile，cleaning with methanol and chloroform respectively，and eluting with 3 mL methanol-ammonia(955，/).The recovery of TIM on non-imprinted polymers cartridge was only 32%.Keywords  Molecularly imprinted polymers； ilmicosin； olid-phase extraction； ummy template1  引言替米考星（Tilmic

7、osin，TIM）是一種由泰樂菌素(Tylosin，TYL)半合成制得的大環(huán)內(nèi)酯類畜禽專用抗生素，具有同其它大環(huán)內(nèi)酯類藥物相似或更強的抗菌活性，目前廣泛用于預(yù)防和治療牛、羊、豬和雞等動物由敏感菌引起的感染性疾病，特別是畜禽呼吸道感染1。考慮動物性食品安全，歐盟、美國和日本等都對該藥制定了較低的最高殘留限量，我國農(nóng)業(yè)部公告第235號也制定了TIM的最高殘留限量牛、羊和豬的脂肪肝、腎中分別為50，1000和1000 g/kg；羊奶中為50 g/kg；雞的肌肉、皮脂、肝和腎中分別為75，75，1000和250 g/kg。提高樣品凈化方法的選擇性一直是痕量分析研究的重要方面，近年來用分子印跡聚合物(M

8、olecularly imprinted Polymers，MIPs)作為填料的固相萃取受到廣泛關(guān)注2。與傳統(tǒng)的固相萃取填料相比，MIPs兼具生物吸附材料的選擇性和常規(guī)填料的理化穩(wěn)定性。但由于模板分子難以完全除去，限制了MIPs在痕量分析中的應(yīng)用，“虛擬模板”的應(yīng)用很好地解決了這一問題7，。本實驗以與TIM結(jié)構(gòu)相似的TYL為虛擬模板分子（圖1），合成的MIPs對TIM具有良好識別性能。將制備的MIPs作為固相萃取填料，對TIM具有很高的選擇性，為生物樣品中替米考星殘留的分離、純化提供了基礎(chǔ)。圖1  替米考星與泰樂菌素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式（略）Fig.1  Chemical stru

9、ctural formula of Tilmicosin(TIM) and Tylosin(TYL)2  實驗部分2.1  儀器與試劑Waters2695-2487型高效液相色譜儀(美國Waters公司)；XL-30型環(huán)境掃描電子顯微鏡(荷蘭菲利浦電子光學(xué)有限公司)；SHA-B型恒溫水浴振蕩器(常州國華電器有限公司)。替米考星標準品（含量98.5%，Dr.Ehrenstorfer公司）；泰樂菌素標準品（含量90%，Sigma-Aldrich公司）；泰樂菌素原料（含量90%，西安亨通光華制藥有限公司），使用前用甲苯重結(jié)晶；甲基丙烯酸(Methacryclic acid，MAA

10、， 分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心）；乙二醇二甲基丙烯酸酯(Ethylene glycol dimethacrylate，EGDMA， 98，Sigma-Aldrich公司)，使用前用活性炭吸附除去阻聚劑；偶氮二異丁腈(Azobisisobutyronitrile，AIBN ， 化學(xué)純，天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心），使用前用甲醇重結(jié)晶；甲醇、乙腈、二甲基甲酰胺、丙酮、氯仿和乙酸銨均為色譜純；其它試劑均為分析純；實驗用水為去離子水。2.2  MIPs的制備2.2.1  不同致孔劑的MIPs的制備  分別將1.0 mmol TYL溶解于6 mL二甲基甲酰胺、甲

11、醇、丙酮和氯仿中，加入4.0 mmol MAA，超聲混合5 min，4 預(yù)聚合4 h。然后加入20.0 mmol EGDMA和40.0 mg AIBN，超聲5 min，于冰浴上吹高純氮氣5 min，密封，60 水浴聚合24 h，得到塊狀聚合物。將聚合物研磨、過篩(粒度為3875 m)，用丙酮反復(fù)沉降以除去細小顆粒。然后裝入15 mm×200 mm玻璃層析柱，用甲醇-乙酸（91，V/V）溶液200 mL洗滌去除模板，流速控制在1 mLmin以內(nèi)，再用100 mL甲醇洗去乙酸，真空干燥12 h，備用。非印跡聚合物(Non-imprinted polymers，NIPs)除不加模板分子外，

12、其它步驟同上。2.2.2  正交實驗設(shè)計  以氯仿為致孔劑，固定模板分子TYL為1.0 mmol，考察MAA用量(A)、EGDMA用量(B)、氯仿用量(C)和AIBN用量(D)4個因素，進行L9(34)正交實驗。通過固相萃取加標回收實驗，分析各因素對聚合物性能的影響，獲得最優(yōu)合成配方。2.3  固相萃取實驗2.3.1  分子印跡固相萃取柱的制備及萃取條件優(yōu)化    稱取150 mg MIPs于體積為3 mL帶有濾板的聚丙烯空柱中，制成分子印跡固相萃取(Molecularly imprinted solid phase Ext

13、raction，MISPE)柱?？疾觳煌幕罨⑸蠘?、淋洗和洗脫條件下MISPE柱對TIM的保留能力。TIM的上樣濃度為10.0 mg/L， 上樣2 mL，收集洗脫液，吹干后溶解于2 mL甲醇中，用HPLC測定。同時用NIPs制備非印跡固相萃?。∟on-imprinted solid phase extraction，NISPE）柱做對照實驗。2.3.2   MISPE的選擇性實驗  將TIM和TYL溶于乙腈，制備濃度為10.0 mg/L的混合標準溶液，上樣2 mL，分別收集MISPE柱的洗滌和洗脫組分，吹干后溶解于2 mL甲醇中，用HPLC測定。2.4 

14、; 色譜條件色譜柱：Agilent Extend-C8柱(250 mm×4.6 mm，5 m)；流速：1 mLmin；柱溫：30 ；進樣量： 10 L； 檢測波長： 287 nm； 流動相： 0.1 molL乙酸銨溶液(A)-乙腈(B)， 梯度洗脫程序為： 0 min， 20%B； 2.5 min， 48%B； 4.5 min， 48%B； 4.6 min， 20%B。3  結(jié)果與討論3.1  聚合條件的優(yōu)化3.1.1  致孔劑的選擇  用掃描電鏡對4種致孔劑合成的聚合物進行結(jié)構(gòu)表征。從放大8000倍的聚合物表觀形態(tài)圖（圖2）可以看出，以甲醇為

15、致孔劑的聚合物結(jié)構(gòu)松散；以丙酮和氯仿為致孔劑的聚合物結(jié)構(gòu)比較致密，有大量孔穴；以二甲基甲酰胺為致孔劑的聚合物結(jié)構(gòu)致密，表面光滑。     11-04-22 15:04:00     編輯：studa20圖2  不同致孔劑制備的分子印跡聚合物的掃描電鏡圖（×8000）（略）Fig.2  Scanning electron micrographs of molecularly imprinted polymers(MIPs) prepared by different porogens（&

16、#215;8000）a.二甲基甲酰胺(Dimethyl formamide，DMF)； b.甲醇(Methanol)； c.丙酮(Acetone)； d.氯仿(Chloroform)。由回收率結(jié)果（表1）可以看出，以丙酮和氯仿為致孔劑的MIPs吸附保留性能好，但以丙酮為致孔劑的NIPs回收率也達到78，非特異性吸附較強。因此，本實驗確定以氯仿為致孔劑。董文國等9通過1H-NMR實驗表明：不同致孔劑中合成的聚合物識別能力的差異源于其在不同溶劑環(huán)境中形成氫鍵的能力有差別，用弱極性氯仿制備的MIPs的游離羧基和TIM可能形成較強的氫鍵。表1  不同致孔劑聚合物的TIM固相萃取回收率(n=3

17、)（略）Table 1  Solid-phase extraction recoveries of tilmicosin(TIM) by polymers prepared in different porogens(n=3)MISPE：分子印跡固相萃?。∕olecularly imprinted solid-phase extraction）；NISPE：非印跡固相萃?。∟on-imprinted solid-phase extraction）；SD：標準偏差（Standard deviation）。3.1.2  正交實驗結(jié)果分析  采用極差法（R值）分析正交實

18、驗數(shù)據(jù)，結(jié)果見表2。從對回收率指標影響考慮，在4個考察因素中，影響最大的為交聯(lián)劑用量(B)，最優(yōu)合成配方為A3B1C2D1。按此組合制備的MIPs固相萃取回收率達到97%。但該聚合物質(zhì)地軟，在固相萃取過程中流速慢，重復(fù)使用時，結(jié)果不穩(wěn)定，非特異性吸附強。這可能因為交聯(lián)劑用量少，聚合物在洗脫模板分子后，無法保持孔穴原來的形狀和大小，使結(jié)合位點發(fā)生變化。因此考慮適當增加交聯(lián)劑用量，使聚合物的剛性增強。固定其它物質(zhì)的量，增加EGDMA用量。結(jié)果如圖3所示，當EGDMA用量為20.0 mmol時，所制得的聚合物剛性適中，特異性強，回收率較高，具有良好的重復(fù)性。因此，綜合考慮MISPE的回收率、穩(wěn)定性、

19、特異性等因素，本實驗最終確定MIPs的合成配方為：1.0 mmol TYL，8.0 mmol MAA，20.0 mmol EGDMA，6.0 mL氯仿，20.0 mg AIBN。 圖3  交聯(lián)劑用量對聚合物吸附性能的影響（略）Fig.3  Effect of amounts of cross-linker on the adsorption properties of polymers prepared表2  正交實驗的結(jié)果及分析（略）Table 2  Results and analysis of orthogonally designed

20、test3.2  MISPE的優(yōu)化3.2.1  活化溶劑的選擇  依次用甲醇和不同pH值的水（5.0，7.0和9.0）活化MISPE柱，并用NISPE柱作對照。結(jié)果表明，MISPE柱的回收率均在90以上。但只有用pH 9.0的水活化的特異性強，NISPE柱的回收率僅為32。這可能是因為弱堿性條件下有利于聚合物與目標分子之間形成氫鍵，從而增強了識別的特異性。3.2.2  上樣溶劑的選擇  分別用種有機溶劑（二甲基甲酰胺、乙腈、丙酮及氯仿）和純水作為TIM的溶解介質(zhì)上樣。結(jié)果如表3所示，以乙腈、丙酮和氯仿為溶劑時，MISPE的回收率都達到90以上；

21、 而NISPE回收率在40以下，回收率和特異性都較好?？紤]到通常用乙腈提取實際樣品中的TIM，故本實驗選擇乙腈為上樣溶劑。表3  不同上樣溶劑的TIM回收率(n=3)（略）Table 3  Recoveries of TIM in different loading solvents(n=3)3.2.3  洗滌溶劑的選擇    分別測定了甲醇、乙腈及氯仿作為淋洗溶劑時的TIM回收率，結(jié)果如表4。氯仿洗滌可獲得滿意的回收率且能除去大部分非特異性吸附?？紤]到MISPE應(yīng)用到實際樣品中，氯仿的凈化效果不如甲醇，甲醇洗滌可以除去大部分雜質(zhì)，且

22、不影響回收率。因此，本實驗采用甲醇和氯仿兩次洗滌，既保證了MISPE的凈化效果，又不會影響MISPE的選擇性。表4  不同洗滌溶劑的TIM回收率(n=3)（略）Table 4  Recoveries of TIM in different washing solvents(n=3)圖4  TYL和TIM典型色譜圖（略）Fig.4  Typical chromatograms of TYL and TIMa.TYL和TIM標準溶液(Standard solution of TYL and TIM) 10.0 mg/L；b.氯仿洗滌部分(Washing step with chloroform)；c.氨化甲醇洗脫部分(luting step with methanol-ammonia) 955，V/V。3.2.4  洗脫液的選擇  實驗了3 mL不同比例的氨水-甲醇溶液（982，973，964，955，946，928，V/V）作為洗脫液的洗脫效果。結(jié)果表明，955，946及928（V/v）的氨化甲醇溶液均可以有效洗脫MISPE吸附的替米考星，回收率達到90以上。但氨水的比例過大會影響洗脫液吹干，本實驗選擇3 mL氨化甲醇（955，V/V）為洗脫液。3.3