延遲相嗎啡預(yù)處理對兔心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用(一)

1、延遲相嗎啡預(yù)處理對兔心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用(一)    【摘要】 目的 探討延遲相嗎啡預(yù)處理對兔心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)機(jī)制。方法 30只健康新西蘭雄性大白兔隨機(jī)分成3組：假手術(shù)組(C組)、缺血再灌注組(I/R組)、嗎啡預(yù)處理延遲相組(M組),每組10只。C組僅行左冠脈套線而不阻斷160 min；I/R組行左冠狀動脈前降支阻斷40 min，再灌注120 min；M組靜注嗎啡1.0 mg/kg， 24 h后處理同I/R組。各組分別于阻斷前20 min（T1）、阻斷后20 min（T2）、阻斷后40 min（T3）、再灌注1 h（T4）、再灌注2 h（

2、T5）五個時點取頸內(nèi)動脈血測定血清中白介素（IL）-10和腫瘤壞死因子（TNF）-含量。再灌注結(jié)束后用伊文思藍(lán)和TTC染色法測心梗面積。結(jié)果 與C組比，I/R組與M組IL-10和TNF-含量均升高,具有顯著性差異(P0.05)，但與I/R組比，M組IL-10明顯升高(P0.05),心肌梗死面積減少(P0.05), TNF-明顯降低(P0.05)。結(jié)論 嗎啡預(yù)處理延遲相可通過調(diào)控炎性細(xì)胞因子平衡發(fā)揮心肌保護(hù)作用。 【關(guān)鍵詞】 嗎啡 延遲相預(yù)處 心肌保護(hù) 缺血再灌注損傷 細(xì)胞因子Abstract: OBJECTIVE To investigate the protective effects of

3、 morphine delayed preconditioning on myocardial ischemia reperfusion injury in rabbit. METHODS Thirty New Zealand male white rabbits were randomly assigned to control group（C group）,ischemia reperfusion group（I/R group） and morphine group（M group）. M group was given morphine 1.0 mg/kg, C group and I

4、/R group were given NS 1.0 ml/kg as untreated controls. Twenty-four hours later I/R group and M group underwent 40 min of coronary occlusion followed by 2 h of reperfusion.Blood samples were taken from arterial line at 20 min before occlusion(T1),20 min after occlusion(T2),40 min after occlusion(T3)

5、,1 h after reperfusion(T4) and 2 h after reperfusion(T5) for determination of plasma IL-10 levels and TNF- levels. At the end of the reperfusion, infarct size(IS) and area at risk(AAR) were defined by Evans and TTC staining. RESULTS Morphine significantly(P0.05)reduced infarct size(21.5%±2.4% i

6、n M group) of the left ventricular area at risk as compared with control (37.8%±1.7% in I/R group). M group had a lower levels of TNF- and a higher level of IL-10 than those in I/R group. CONCLUSION Morphine preconditioning induces late cardioprotection against postischemic reperfusion injury p

7、artly by regulating cytokine in rabbit.Key words： Morphine;Delayedpreconditioning;Cardioprotection;Ischemia reperfusion injury;Cytokine嗎啡預(yù)處理具有類似缺血預(yù)處理早期相的心肌保護(hù)作用1-2已經(jīng)得到肯定，而嗎啡預(yù)處理是否具有延遲相心肌保護(hù)效應(yīng)及其作用機(jī)制目前少見報道。白介素（IL）-10和腫瘤壞死因子（TNF）-是心肌缺血再灌注（I/R）病理損傷中發(fā)揮重要作用 的炎性細(xì)胞因子3-4，因此，本研究擬通過觀察嗎啡預(yù)處理延遲相在I/R中對IL-10和TNF-水平的影響

8、，探討其對心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。1 材料與方法1.1 動物分組 健康雄性新西蘭大白兔30只，體重2.02.5 kg（中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院動物部提供），隨機(jī)分成3組：假手術(shù)組(C組)、缺血再灌注組（I/R組）、嗎啡預(yù)處理組(M組),每組10只。C組靜注NS 1.0 ml/kg，24 h后僅行左冠脈套線而不阻斷160 min；I/R組靜注NS 1.0 ml/kg，24 h后行左冠狀動脈前降支阻斷40 min，再灌注120 min；M組靜注嗎啡1.0 mg/kg，24 h后處理同I/R組。所有實驗動物按照“湖南省醫(yī)學(xué)類實驗動物飼養(yǎng)和管理條例”和“國際實驗動物管理條例”進(jìn)行喂養(yǎng)和處理。1.2 儀

9、器設(shè)備 DH150呼吸機(jī)（浙江醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)儀器廠）；MD100-2電子分析天平（上海天平儀器廠）；全自動生化分析儀（美國BECKMAN公司）；內(nèi)切式勻漿機(jī)（中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院儀器廠）；5415R型高速低溫臺式離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；721分光光度儀（上海第三分析儀器廠）；恒溫水浴箱（上海儀器廠）；-70冰箱（日本松下）；壓力換能器（惠普公司）；450nm酶標(biāo)儀（日本BIO-RAD Model 550型）。1.3 試劑 伊文思藍(lán)、氯化硝基四氮唑蘭、戊巴比妥鈉（均為Sigma公司），IL-10和TNF-的ELISA試劑盒（深圳晶美生物公司）。1.4 I/R模型制備 以戊巴比妥鈉30m

10、g/kg耳靜脈麻醉后固定,氣管切開插管,行純氧機(jī)械通氣,潮氣量15ml/kg,呼吸頻率35次/min。連接皮下電極監(jiān)測標(biāo)準(zhǔn)導(dǎo)聯(lián)心電圖, 并在左頸內(nèi)動脈穿刺置管持續(xù)監(jiān)測動脈壓變化。左前第4 肋間開胸,切開心包,于左冠狀動脈中部用絲線結(jié)扎阻斷血流造成心肌缺血, 以缺血心室壁出現(xiàn)發(fā)紺、運(yùn)動減弱, 同時伴有心電圖ST 段抬高為阻斷成功。1.5 測定指標(biāo)1.5.1 IL-10和TNF- 各組分別于阻斷前20 min（T1）、阻斷后20 min（T2）、阻斷后40 min（T3）、再灌注1 h（T4）、再灌注2 h（T5）五個時點取頸內(nèi)動脈血測定IL-10和TNF-(夾心ELISA法)的水平。1.5.2

11、心肌梗死面積 再灌注2 h后再次阻斷冠狀動脈,自頸內(nèi)動脈逆向注入2伊文思藍(lán)2 ml進(jìn)行心肌染色,以區(qū)分缺血(無藍(lán)色)和非缺血組織(藍(lán)色)，迅速取出心臟，將其水平切成約2 mm的薄片,將心肌薄片以濾紙吸干, 剪除右室和非缺血組織后分別測質(zhì)量，然后將缺血心肌片用0.5TTC磷酸緩沖液(pH=7.4)孵育(37)15 min以確定梗死組織,再將壞死區(qū)(灰白色)和非壞死區(qū)(深紅色)分離測質(zhì)量，缺血和梗死面積以其占左室質(zhì)量的百分比表示并計算缺血和梗死心肌面積。1.5.3 心肌組織超微結(jié)構(gòu) 再灌注結(jié)束后，分別取各組心尖區(qū)心肌組織1 mm3備透射電鏡下超微結(jié)構(gòu)檢查。1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 用SPSS 13.0統(tǒng)

12、計學(xué)軟件行重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，P0.05為有顯著性統(tǒng)計學(xué)差異。2 結(jié) 果2.1 血清IL-10和TNF-濃度變化 與C組比較，I/R組和M組在心肌缺血再灌注后血清IL-10濃度均顯著上升(P0.05)；但與I/R組比較，M組濃度明顯增高（P0.05）。與C組比較，I/R組和M組在缺血再灌注后血清TNF-濃度均顯著上升(P0.05)；但與I/R組比較，M組濃度明顯下降（P0.05）。見表1。2.2 心肌梗死及缺血面積變化 心肌缺血面積I/R組和M組間無明顯差異（P>0.05）。與I/R組比，M組心肌梗死面積顯著降低（P0.05）。

13、見表2。2.3 心肌超微結(jié)構(gòu)變化 電鏡下的變化：C組心肌細(xì)胞完整，排列整齊，線粒體形態(tài)正常，糖原豐富；I/R組心肌細(xì)胞水腫，心肌纖維排列模糊，排列紊亂，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜腫脹，空泡化；M組心肌細(xì)胞水腫，心肌纖維排列較紊亂，心肌纖維模糊，線粒體輕度腫脹，糖原減少。見圖1、2、3。表1 各組不同時間點的血清IL-10和TNF-濃度的變化 表2 各級心肌梗死面積及缺血面積（ 注：*與I/R組比，P0.053 討 論缺血再灌注損傷的機(jī)制之一是過度的炎性反應(yīng)，其中TNF-是主要的促炎性因子，參與機(jī)體的炎性反應(yīng)和免疫反應(yīng)全過程，是心肌缺血再灌注損傷連鎖反應(yīng)中的關(guān)鍵性介質(zhì)，其產(chǎn)生快，可以觸發(fā)其它的細(xì)胞因子的產(chǎn)

14、生,引起細(xì)胞因子的級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致促炎性反應(yīng)5。I/R期間，TNF-釋放增加，可激活多形核白細(xì)胞（PMN），增加細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)和血管黏附分子(VCAM-1)在缺血區(qū)的聚集和表達(dá)，促進(jìn)中性粒細(xì)胞聚集和釋放蛋白水解酶，使細(xì)胞膜損傷和細(xì)胞自溶，導(dǎo)致心肌損傷6。本研究中，嗎啡延遲相預(yù)處理后，心肌TNF-的表達(dá)和產(chǎn)生顯著降低，提示嗎啡預(yù)處理延遲相對心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用與其抑制TNF-產(chǎn)生，減輕炎性反應(yīng)有關(guān)。IL-10 是經(jīng)典的抗炎性細(xì)胞因子，可抑制許多促炎性因子(如TNF-、IL-1、IL-6等)的合成，并上調(diào)其它抗炎性因子的生成7。研究發(fā)現(xiàn)，IL-10在心肌缺血損傷中有重要的

15、保護(hù)作用，在I/R期間，IL-10 mRNA及其蛋白表達(dá)顯著上調(diào)8，如果IL-10表達(dá)缺失，則炎性反應(yīng)加重，表現(xiàn)為PMN浸潤增強(qiáng)，ICAM-1和TNF-的聚集和表達(dá)增加，心肌梗死面積擴(kuò)大，損傷加重9。本研究中，嗎啡延遲相預(yù)處理后，心肌IL-10的表達(dá)和產(chǎn)生顯著上調(diào)，提示嗎啡預(yù)處理延遲相對心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用與其上調(diào)IL-10產(chǎn)生和抑制炎性反應(yīng)有關(guān)。心肌超微結(jié)構(gòu)的變化是反應(yīng)心肌受損傷程度的有效指標(biāo)10，在本研究中心肌超微結(jié)構(gòu)的變化，提示嗎啡延遲預(yù)處理可有效減輕心肌損傷程度，與其抑制過度的炎性反應(yīng)有關(guān)。心肌梗死面積的變化被認(rèn)為是評價心肌預(yù)處理效果的“金指標(biāo)”11，在本研究中，I/R組和M組

16、間的缺血面積無顯著性差異，表明LAD阻斷效果肯定、各組LAD阻斷部位基本一致。I/R組的心肌梗死面積為37.8%，而給予嗎啡預(yù)處理24 h后的M組心肌梗死面積為19.7%，與I/R組相比，M組心肌梗死面積減少48%，以上結(jié)果提示嗎啡預(yù)處理24 h后能顯著減少缺血再灌注損傷后的心肌梗死面積，與其抑制缺血再灌注誘發(fā)的心肌炎性反應(yīng)密切相關(guān)。有研究認(rèn)為12-13，I/R通過活化核因子NF-kappaB蛋白表達(dá)，誘發(fā)TNF-、IL-1、IL-6等促炎性因子過度表達(dá)，引發(fā)炎性反應(yīng)造成心肌損傷，而下調(diào)NF-kappaB蛋白表達(dá)，則可抑制TNF-、IL-1、IL-6等促炎癥因子過度表達(dá)，并上調(diào)IL-10表達(dá)，

17、減小心肌梗死面積，提示嗎啡可能通過下調(diào)NF-kappaB蛋白表達(dá)，抑制炎性反應(yīng)，減輕心肌損傷，這有待進(jìn)一步研究?？傊?，本研究表明，嗎啡預(yù)處理延遲相通過下調(diào)I/R病理過程中促炎性因子TNF-的產(chǎn)生，同時上調(diào)抗炎性因子IL-10的產(chǎn)生，從而抑制I/R病理過程中的炎性反應(yīng)，這可能是嗎啡預(yù)處理延遲相對心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)機(jī)制之一。【參考文獻(xiàn)】1 Okubo S,Tanabe Y,Takeda K,et al.Ischemic preconditioning and morphine attenuate myocardial apoptosis and infarction after ischem

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