微衛(wèi)星體簡(jiǎn)單重復(fù)序列錨定PCR擴(kuò)增技術(shù)(SSR－PCR)及其

1、    微衛(wèi)星體簡(jiǎn)單重復(fù)序列錨定PCR擴(kuò)增技術(shù)(SSRPCR) 及其在寄生蟲基因研究中的應(yīng)用        中分類號(hào)：R38文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B文章編號(hào)：10052534(2000)01003302 寄生蟲基因變異現(xiàn)象是普遍存在的，了解其變異情況有助于寄生蟲的防治控制及疫苗研制。早期的限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)等分子生物學(xué)技術(shù)的運(yùn)用極大地推動(dòng)了寄生蟲遺傳變異研究的深入發(fā)展。由于這些方法復(fù)雜、費(fèi)時(shí)且DNA需求量大，因而未廣泛使用；特異性PCR檢測(cè)DNA多態(tài)性，需預(yù)

2、知靶基因核苷酸序列，設(shè)計(jì)合成特異性擴(kuò)增引物，也限制了其廣泛應(yīng)用；90年代初報(bào)道的隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)(RAPD)，對(duì)DNA差異研究敏感有效，但重復(fù)穩(wěn)定性差。新近出現(xiàn)的基于微衛(wèi)星體DNA的簡(jiǎn)單重復(fù)序列錨定PCR擴(kuò)增技術(shù)(simple sequence repeat-anchored PCR,SSRPCR)，具有簡(jiǎn)便、快速、敏感及較好重復(fù)穩(wěn)定性的特點(diǎn)。本文就SSRPCR有關(guān)原理及應(yīng)用作一簡(jiǎn)要概述。1微衛(wèi)星體DNA及其特點(diǎn)在部分微生物及人和動(dòng)物等基因組中，存在一些由寡核苷酸串聯(lián)、重復(fù)排列而成的DNA序列，稱為“數(shù)量可變的串聯(lián)重復(fù)序列”(variable number of tandem repe

3、at,VNTR)。其中重復(fù)序列為670bp的稱為小衛(wèi)星體DNA(minisatellite DNA)；在基因組的間隔順序和內(nèi)含子等非編碼區(qū)內(nèi)，廣泛存在與小衛(wèi)星體DNA類似的另一類短串聯(lián)重復(fù)序列，由16bp作核心單位，在多串聯(lián)拷貝上重復(fù)而成，稱為微衛(wèi)星體DNA(microsatellite DNA)，或稱簡(jiǎn)單重復(fù)序列(SSR),如GACA、GATA、TCC、CA、CT等。小衛(wèi)星體DNA和微衛(wèi)星體DNA都屬于自私DNA(selfish DNA)，它們的存在是其自主復(fù)制形成的。DNA復(fù)制過程中的“鏈滑”(strand slippage)作用可能是造成微衛(wèi)星體DNA多態(tài)性的主要原因。微衛(wèi)星體DNA與小

4、衛(wèi)星體DNA相比，除重復(fù)單位長(zhǎng)度不同外，微衛(wèi)星體DNA還具有不同特點(diǎn)。微衛(wèi)星體DNA存在于染色體任何部位，重復(fù)次數(shù)達(dá)1060次，總序列長(zhǎng)度從幾十到幾百bp，一般不超過300bp，存在數(shù)目很多，可達(dá)10萬(wàn)個(gè)，重復(fù)單位變異程度低約1104106；而小衛(wèi)星體DNA只存在于染色體近端粒和著絲粒區(qū)，重復(fù)次數(shù)可達(dá)幾百次，總長(zhǎng)度遠(yuǎn)比微衛(wèi)星體DNA長(zhǎng)，可達(dá)30kb，存在數(shù)目有限，有些染色體尚未發(fā)現(xiàn)，重復(fù)單位可發(fā)生單個(gè)堿基的變異。從符合遺傳標(biāo)記的高度多態(tài)，雜合性高，突變率低的標(biāo)準(zhǔn)來看，微衛(wèi)星體DNA比小衛(wèi)星體DNA更優(yōu)越。微衛(wèi)星體在真核生物基因組中富含(CA)n.(GT)n二聚體，而又以CA序列重復(fù)頻率最高。微

5、衛(wèi)星體DNA作為一種新的遺傳標(biāo)記，具有種類多，分布廣，高度多態(tài)，重組率低，容易篩選，并且順序化，呈孟德爾顯性遺傳。微衛(wèi)星體DNA已廣泛應(yīng)用于基因作，法醫(yī)、遺傳疾病及種群研究。與小衛(wèi)星體DNA相比，微衛(wèi)星體DNA長(zhǎng)度較短，更適合于PCR研究基因多態(tài)性差異。2SSRPCR基本原理由于真核生物中富含CA重復(fù)序列，SSRPCR就是針對(duì)高度密集的CA微衛(wèi)星體簡(jiǎn)單重復(fù)序列，設(shè)計(jì)與之互補(bǔ)的重復(fù)CA堿基作單引物擴(kuò)增其重復(fù)片段，從而揭示其多態(tài)性。但是由于重復(fù)CA引物針對(duì)高度重復(fù)的靶位點(diǎn)，容易形成擴(kuò)增條帶的涂布現(xiàn)象(smear)，使擴(kuò)增產(chǎn)物難以辯認(rèn)。在重復(fù)CA引物的3端或5端錨定引物，從而減少引物的作用位點(diǎn)，增加

6、特異性，克服涂布現(xiàn)象。這種簡(jiǎn)單重復(fù)序列錨定引物PCR擴(kuò)增技術(shù)(SSRPCR)，就是在嚴(yán)格條件下，用(CA)8RY作為引物，即在3端或5端錨定一分子嘌呤和分子嘧啶的8個(gè)CA重復(fù)序列引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物在丙烯酰胺凝膠中電泳，染色觀察結(jié)果。SSRPCR不是檢測(cè)靶微衛(wèi)星體序列的長(zhǎng)度變異，而是檢測(cè)CA重復(fù)區(qū)域間有無堿基插入，缺失及突變等多態(tài)性變異。SSRPCR反應(yīng)條件基本同一般PCR，只是引物為單引物(CA)8RY。一般循環(huán)溫度為94變性30秒，退火溫度為5245秒，延伸溫度為7260秒。產(chǎn)物用6%丙烯酰胺凝膠電泳，銀染觀察結(jié)果。3SSRPCR的方法學(xué)評(píng)價(jià)SSRPCR技術(shù)除了具有一般PCR的簡(jiǎn)

7、便、安全和快速的優(yōu)點(diǎn)外，還具有DNA用量少，敏感及重復(fù)穩(wěn)定性好的特點(diǎn)。10pg10ng之間的模板DNA，1.625.6pmoles引物濃度，擴(kuò)增的產(chǎn)物結(jié)果相同；不同時(shí)間，不同廠家的Taq DNA聚合酶及擴(kuò)增儀，不同的循環(huán)溫度，SSRPCR結(jié)果的重復(fù)性仍較好。同DNA指紋技術(shù)相比，SSRPCR不但操作簡(jiǎn)便，而且DNA用量少。與RAPD方法比較，SSRPCR有兩個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)：一是只需一個(gè)引物就可對(duì)不同種株進(jìn)行多態(tài)分析，而RAPD則需對(duì)多個(gè)引物進(jìn)行篩選；另一是SSRPCR在高嚴(yán)謹(jǐn)度的擴(kuò)增條件下反應(yīng)，從而避免引物競(jìng)爭(zhēng)引起的低重復(fù)性及假擴(kuò)增條帶。相反、RAPD在退火溫度較低的低嚴(yán)謹(jǐn)度的擴(kuò)增條件下，容易出現(xiàn)

8、假擴(kuò)增條帶及低重復(fù)性。另外，影響RAPD結(jié)果的Taq酶、循環(huán)儀、時(shí)間溫度及模板引物濃度等因素，對(duì)SSRPCR結(jié)果影響較小。SSRPCR用于基因差異分析優(yōu)于DNA指紋技術(shù)和RAPD方法。4SSRPCR在基因研究中的應(yīng)用SSRPCR是基于微衛(wèi)星體簡(jiǎn)單重復(fù)序列的新技術(shù)，該技術(shù)用于人、動(dòng)、植物及寄生蟲的研究是近年開始的?，F(xiàn)就該技術(shù)最近的應(yīng)用情況舉例說明。Zietkiewicz等首先用錨定的微衛(wèi)星體簡(jiǎn)單重復(fù)序列作引物進(jìn)行SSRPCR擴(kuò)增。同時(shí)對(duì)不同的哺乳動(dòng)物，鳥、爬行類、魚及植物等真核生物進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)生易于分辯的條帶4060條，片段長(zhǎng)度在2002000bp之間。大豆等植物擴(kuò)增條帶數(shù)少于哺乳動(dòng)物，這和基因

9、庫(kù)中植物微衛(wèi)星體CA重復(fù)序列不如哺乳動(dòng)物豐富相符。而細(xì)菌只產(chǎn)生1條獨(dú)帶。對(duì)同一物種的不同個(gè)體進(jìn)行擴(kuò)增也產(chǎn)生較好效果。Oliveira等用(CA)8RY引物對(duì)16株枯氏錐蟲基因組進(jìn)行SSRPCR分析，結(jié)果顯示3000bp以下可見的高度多態(tài)性條帶26.8±3.3個(gè)。將擴(kuò)增結(jié)果與RAPD和DNA指紋技術(shù)進(jìn)行比較，SSRPCR平均共享片段為23%，RAPD為25%，DAN指紋技術(shù)為12%。用表型象拓?fù)鋵W(xué)分析這三種方法也獲得相同的結(jié)果。用SSRPCR對(duì)兩株曼氏血吸蟲及3株巴西利什曼原蟲進(jìn)行多態(tài)分析，均獲得復(fù)雜條帶。利什曼原蟲之間顯示高度多態(tài)性，而曼氏血吸蟲蟲株之間顯示較小的多態(tài)性，這和RAPD和DNA指紋技術(shù)相類似。Gomes等從巴西慢性錐蟲病患者分離30株枯氏錐蟲，用RAPD和SSRPCR同時(shí)進(jìn)行遺傳學(xué)分析。RAPD平均共享度S為71%，而SSRPCR為59%。根據(jù)基因距離差異系數(shù)D=1-S，按UPGMA聚類分析法，利用MEGA軟件構(gòu)建表型分類樹。結(jié)果兩種方法所建表型樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)差異較小。5結(jié)語(yǔ)SSRPCR技術(shù)具有簡(jiǎn)便、快速及重復(fù)穩(wěn)定性好的