黃酮類化合物柚皮苷抑制HaCaT 細胞RANTES產(chǎn)生的研究

1、黃酮類化合物柚皮苷抑制HaCaT 細胞RANTES產(chǎn)生的研究    The peacock has fair feathers, but foul.     【摘要】  目的：分析腫瘤壞死因子(TNF)和干擾素(IFN)是否誘導體外培養(yǎng)角質(zhì)形成細胞株HaCaT產(chǎn)生趨化因子RANTES，了解柚皮苷是否影響TNF和IFN對合成RANTES的誘導作用。方法：TNF和IFN刺激培養(yǎng)的HaCaT細胞，應用定量RTPCR方法測定RANTES的mRNA表達，應用ELISA方法測定上清液中RANTES

2、。結(jié)果：正常培養(yǎng)HaCaT細胞RANTES微弱表達, TNF和IFN刺激使HaCaT細胞RANTES的mRNA表達與分泌量顯著增加。柚皮苷0.5, 0.25 mmol·L1能抑制TNF和IFN誘導的RANTES分泌()。結(jié)論：柚皮苷可抑制TNF和IFN引起的HaCaT細胞分泌RANTES。 Deeds are fruits; words are but leaves.  【關(guān)鍵詞】  柚皮苷；RANTES；HaCaT細胞You never know what you can do till you.  趨

3、化因子(Chemokine)是一類誘導免疫細胞向特定的組織部位浸潤和聚積的具有趨化和細胞活化作用的細胞因子。根據(jù)其成熟蛋白中保守半胱氨酸殘基(C，cysteine)的排列，趨化因子可分為4種類型: CXC型、CC型、C型及CX3C型。受激活調(diào)節(jié)正常T細胞表達和分泌因子(regulated upon activation normal T cell expressed and secreted factor，RANTES)屬于CC家族成員。研究表明，RANTES表達水平的升高與多種炎性疾病有關(guān)。如

4、關(guān)節(jié)炎、特應性皮炎、銀屑病、遲發(fā)性超敏反應、腎小球腎炎、哮喘、炎癥性結(jié)腸炎等。RANTES已經(jīng)作為急慢性炎癥的重要介質(zhì)，其表達水平的升高是炎癥反應的特征之一1，2(醫(yī)藥學/藥學論文 )。One cannot get blood from a stone.      黃酮類化合物具有顯著的抗氧化作用、抗炎、抗內(nèi)毒素作用，其抗氧化作用與細胞內(nèi)某些還原酶如谷胱甘肽還原酶、超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的活性增強有關(guān)3。而柚皮苷增強體內(nèi)還原酶活性不足以解釋其顯著的抗炎、抗內(nèi)毒素作用。為此，研究觀察柚皮苷抑制人皮膚角質(zhì)細胞RANTES產(chǎn)生的作用。Manner

5、s make the man.      1  材料和方法    1.1  藥品和試劑 柚皮苷(純度99%, Sigma 公司)、阿維A ；TNF和INF (美國PEPROTECH Asia)；DMEM 培養(yǎng)基(Gibco)；M TT(3  (4 ,5)  雙甲基 2  噻唑 (2 ,5)

6、  二苯基溴化四氮唑藍，Sigma 公司)；Taq DNA聚合酶（北京博大泰克BioDev生物基因技術(shù)有限責任公司）；引物（上海生物工程有限公司）；人RANTES定量ELISA試劑盒(上海森雄科技實業(yè)有限公司)；人表皮角質(zhì)形成細胞HaCaT細胞株(本室保存)。    1.2MTT比色分析按照文獻方法4，在96 孔培養(yǎng)板中加HACAT 細胞懸液（1.5×104 個細胞/ 孔）培養(yǎng)過夜，依次加入含藥的完全培養(yǎng)基，實驗組分別加入不同濃度的柚皮苷，陽性對照藥采用阿維A，藥物

7、濃度見表1，陰性照組用培養(yǎng)液替代藥物，空白組僅加入不含細胞的培養(yǎng)液，每個濃度做3 個復孔。OD 值測定波長為570 nm。結(jié)果按下式計算藥物對細胞生長的抑制率:細胞生長抑制率% = (1  實驗組OD 值/對照組OD 值)×100 %;以藥物的不同濃度對角質(zhì)細胞生長抑制率作圖可得到劑量反應曲線,從中求出藥物的半數(shù)殺傷濃度IC50。Quality is better than quantity.      1.3  細

8、胞培養(yǎng)上清液RANTES含量測定  將HaCaT細胞接種于24孔板中（5×104/孔），加入含刺激因子（TNF和/或INF）的無血清 DMEM培養(yǎng)基孵育24 h，同時進行實驗組研究：不同濃度的柚皮苷以及陽性對照阿維A；每組各設3個復孔(見表2)。按照試劑盒內(nèi)說明測定上清液中RANTES的含量。    1.4RANTES mRNA 表達測定按上述方法培養(yǎng)并處理細胞，用Trizol法提取細胞總RNA，根據(jù)GenBankNCBI公布的RANTES全長cDNA序列，設計RANTES引物。正義鏈

9、為5CCAGCAGTCGTCTTT GTCA 3，反義鏈為5ATCTCCAAAGAGTTGATGT 3，擴增片段長度為96 bp。內(nèi)參照HGAPDH的引物正義鏈為5CCTCAAGATCATCAGCAAT3，反義鏈 5CCATCCA CAGTCTTCTGGGT3，擴增片段長度141 bp。首先逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，在應用熒光定量PCR的方法測定RANTES mRNA的表達。反應條件為：94  2min后進行下列循環(huán)，94 20 S，56  20 S，7

10、2  30 S,80  20 S共45個循環(huán)。 HGAPDH復性溫度為54 。結(jié)果判定：判讀Ct值（擴增曲線進入指數(shù)期時的反應循環(huán)數(shù)），mRNA相對定量根據(jù)公式計算：目的基因的相對量=2Ct，Ct = Ct GI(待測樣品)Ct GAPDH(待測樣品) Ct GI (校正樣品)  Ct GAPDH (校正樣品)。    2  結(jié)果Love make

11、s obedience easy.      2.1MTT比色分析結(jié)果顯示（Tab.1）,表皮細胞株HaCaT細胞對阿維A反應敏感，對柚皮苷反應不敏感，各濃度組細胞增殖抑制幾乎不受影響，細胞形態(tài)無明顯變化。    Tab. 1  柚皮苷對表皮細胞株HaCaT細胞增殖的影響（MTT法） 論文教育信息網(wǎng)    2.2RANTES產(chǎn)生的作用     結(jié)果見Tab.2，HaCaT細胞在用TNF聯(lián)合INF刺

12、激48小時后，上清液所含RANTES的濃度明顯增加，HaCaT細胞的形態(tài)產(chǎn)生了明顯的變化，阿維A在 5×10-3  mmol·L-1，柚皮苷0.5、0.25 mmol·L-1預處理30min后可明顯抑制RANTES的產(chǎn)生。注：對照組相比  *P0.01  *P0.0012.3RANTES mRNA的表達實時定量RTPCR產(chǎn)物經(jīng)2瓊脂糖凝膠電泳，RANTES、GAPDH的mRNA基因轉(zhuǎn)錄擴增片段均在相應的分子量位置(Fig. 1)。   

13、 根據(jù)實時熒光定量基因擴增的動力曲線，各組目的基因RANTES以及內(nèi)參GAPDH的mRNA相對量的比值見Fig.2。正常培養(yǎng)HaCaT細胞及經(jīng)TNF+INF、TNF+INF+阿維A、TNF+INF+柚皮苷處理細胞均有RANTES、GAPDH表達；RANTES在細胞因子處理的細胞中顯著表達，細胞因子未處理細胞微弱表達；而經(jīng)阿維A、柚皮苷處理的細胞明顯降低。Fig.1RANTES mRNA經(jīng)RTPCR表達產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖Quality is better than quantity.      3討論  

14、0;   RANTES由多種細胞分泌而來，作用于白細胞，使其趨化至炎癥區(qū)域并將其活化1，2。曾有學者通過體外實驗證實,正常人角質(zhì)形成細胞受到適量的TNF與IFN的聯(lián)合刺激，其分泌至上清液中的RANTES水平明顯增高5 。本實驗中，我們證實了聯(lián)合使用TNF與IFN能誘導人角質(zhì)形成細胞RANTES的明顯增高。The farmers are the founders of civilization and prosperity.      柚皮苷全稱為柚皮素7O新橙皮糖苷，屬二氫黃酮類化合物，是橘紅、骨碎補、枳

15、實、枳殼等中藥的主要有效成分6，具有顯著的抗氧化作用、抗炎、抗內(nèi)毒素作用。本實驗中，通過ELISA直接RANTES的含量，證明了柚皮苷能抑制被TNF與IFN誘導的HaCaT細胞的RANTES的產(chǎn)生。同時分析了編碼RANTES基因的轉(zhuǎn)錄，應用熒光定量PCR技術(shù)，該技術(shù)為實時（RealTime）熒光定量PCR，檢測對象為反應進程中模板DNA拷貝數(shù)的即時變化而非終產(chǎn)物含量。因而能夠通過對Ct值（擴增曲線進入指數(shù)期時的反應循環(huán)數(shù)）的準確判讀，按指數(shù)擴增的規(guī)律計算出初始模板拷貝數(shù)。樣本的Ct值與該樣本起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。同時MTT法測定柚皮苷在1mmol·

16、L-1的情況下幾乎不影響HACAT細胞的活力，說明抑制RANTES的誘導產(chǎn)生不是由于柚皮苷對細胞的潛在毒性而致。推測柚皮苷抑制RANTES基因的轉(zhuǎn)錄以及表達可能通過一定的信號通路，有待進一步研究?！緟⒖嘉墨I】  1 Selvan RS, Butterfield JH, Krangel MS. Expression of multiple chemokine genes by a human mast cell

17、0;leukemiaJ. J Biol Chem. 1994, 269(19):13893-13898.2 Nelson PJ, Ortiz BD, Pattison JM, et al. Identification of a novel regulatory region critical for expression of the RANTE

18、S chemokine in activated T lymphocytesJ. J Immunol. 1996, 157(3): 1139-1148.3 Ganesh Chandra JagetiaT, Tiyyagura Koti Reddy. Modulation of radiationinduced alteration in the antioxidant