黃酮類化合物柚皮苷抑制HaCaT 細(xì)胞RANTES產(chǎn)生的研究

1、黃酮類化合物柚皮苷抑制HaCaT 細(xì)胞RANTES產(chǎn)生的研究    The peacock has fair feathers, but foul.     【摘要】  目的：分析腫瘤壞死因子(TNF)和干擾素(IFN)是否誘導(dǎo)體外培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT產(chǎn)生趨化因子RANTES，了解柚皮苷是否影響TNF和IFN對合成RANTES的誘導(dǎo)作用。方法：TNF和IFN刺激培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞，應(yīng)用定量RTPCR方法測定RANTES的mRNA表達(dá)，應(yīng)用ELISA方法測定上清液中RANTES

2、。結(jié)果：正常培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞RANTES微弱表達(dá), TNF和IFN刺激使HaCaT細(xì)胞RANTES的mRNA表達(dá)與分泌量顯著增加。柚皮苷0.5, 0.25 mmol·L1能抑制TNF和IFN誘導(dǎo)的RANTES分泌()。結(jié)論：柚皮苷可抑制TNF和IFN引起的HaCaT細(xì)胞分泌RANTES。 Deeds are fruits; words are but leaves.  【關(guān)鍵詞】  柚皮苷；RANTES；HaCaT細(xì)胞You never know what you can do till you.  趨

3、化因子(Chemokine)是一類誘導(dǎo)免疫細(xì)胞向特定的組織部位浸潤和聚積的具有趨化和細(xì)胞活化作用的細(xì)胞因子。根據(jù)其成熟蛋白中保守半胱氨酸殘基(C，cysteine)的排列，趨化因子可分為4種類型: CXC型、CC型、C型及CX3C型。受激活調(diào)節(jié)正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌因子(regulated upon activation normal T cell expressed and secreted factor，RANTES)屬于CC家族成員。研究表明，RANTES表達(dá)水平的升高與多種炎性疾病有關(guān)。如

4、關(guān)節(jié)炎、特應(yīng)性皮炎、銀屑病、遲發(fā)性超敏反應(yīng)、腎小球腎炎、哮喘、炎癥性結(jié)腸炎等。RANTES已經(jīng)作為急慢性炎癥的重要介質(zhì)，其表達(dá)水平的升高是炎癥反應(yīng)的特征之一1，2(醫(yī)藥學(xué)/藥學(xué)論文 )。One cannot get blood from a stone.      黃酮類化合物具有顯著的抗氧化作用、抗炎、抗內(nèi)毒素作用，其抗氧化作用與細(xì)胞內(nèi)某些還原酶如谷胱甘肽還原酶、超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的活性增強(qiáng)有關(guān)3。而柚皮苷增強(qiáng)體內(nèi)還原酶活性不足以解釋其顯著的抗炎、抗內(nèi)毒素作用。為此，研究觀察柚皮苷抑制人皮膚角質(zhì)細(xì)胞RANTES產(chǎn)生的作用。Manner

5、s make the man.      1  材料和方法    1.1  藥品和試劑 柚皮苷(純度99%, Sigma 公司)、阿維A ；TNF和INF (美國PEPROTECH Asia)；DMEM 培養(yǎng)基(Gibco)；M TT(3  (4 ,5)  雙甲基 2  噻唑 (2 ,5)

6、  二苯基溴化四氮唑藍(lán)，Sigma 公司)；Taq DNA聚合酶（北京博大泰克BioDev生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司）；引物（上海生物工程有限公司）；人RANTES定量ELISA試劑盒(上海森雄科技實業(yè)有限公司)；人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT細(xì)胞株(本室保存)。    1.2MTT比色分析按照文獻(xiàn)方法4，在96 孔培養(yǎng)板中加HACAT 細(xì)胞懸液（1.5×104 個細(xì)胞/ 孔）培養(yǎng)過夜，依次加入含藥的完全培養(yǎng)基，實驗組分別加入不同濃度的柚皮苷，陽性對照藥采用阿維A，藥物

7、濃度見表1，陰性照組用培養(yǎng)液替代藥物，空白組僅加入不含細(xì)胞的培養(yǎng)液，每個濃度做3 個復(fù)孔。OD 值測定波長為570 nm。結(jié)果按下式計算藥物對細(xì)胞生長的抑制率:細(xì)胞生長抑制率% = (1  實驗組OD 值/對照組OD 值)×100 %;以藥物的不同濃度對角質(zhì)細(xì)胞生長抑制率作圖可得到劑量反應(yīng)曲線,從中求出藥物的半數(shù)殺傷濃度IC50。Quality is better than quantity.      1.3  細(xì)

8、胞培養(yǎng)上清液RANTES含量測定  將HaCaT細(xì)胞接種于24孔板中（5×104/孔），加入含刺激因子（TNF和/或INF）的無血清 DMEM培養(yǎng)基孵育24 h，同時進(jìn)行實驗組研究：不同濃度的柚皮苷以及陽性對照阿維A；每組各設(shè)3個復(fù)孔(見表2)。按照試劑盒內(nèi)說明測定上清液中RANTES的含量。    1.4RANTES mRNA 表達(dá)測定按上述方法培養(yǎng)并處理細(xì)胞，用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，根據(jù)GenBankNCBI公布的RANTES全長cDNA序列，設(shè)計RANTES引物。正義鏈

9、為5CCAGCAGTCGTCTTT GTCA 3，反義鏈為5ATCTCCAAAGAGTTGATGT 3，擴(kuò)增片段長度為96 bp。內(nèi)參照HGAPDH的引物正義鏈為5CCTCAAGATCATCAGCAAT3，反義鏈 5CCATCCA CAGTCTTCTGGGT3，擴(kuò)增片段長度141 bp。首先逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，在應(yīng)用熒光定量PCR的方法測定RANTES mRNA的表達(dá)。反應(yīng)條件為：94  2min后進(jìn)行下列循環(huán)，94 20 S，56  20 S，7

10、2  30 S,80  20 S共45個循環(huán)。 HGAPDH復(fù)性溫度為54 。結(jié)果判定：判讀Ct值（擴(kuò)增曲線進(jìn)入指數(shù)期時的反應(yīng)循環(huán)數(shù)），mRNA相對定量根據(jù)公式計算：目的基因的相對量=2Ct，Ct = Ct GI(待測樣品)Ct GAPDH(待測樣品) Ct GI (校正樣品)  Ct GAPDH (校正樣品)。    2  結(jié)果Love make

11、s obedience easy.      2.1MTT比色分析結(jié)果顯示（Tab.1）,表皮細(xì)胞株HaCaT細(xì)胞對阿維A反應(yīng)敏感，對柚皮苷反應(yīng)不敏感，各濃度組細(xì)胞增殖抑制幾乎不受影響，細(xì)胞形態(tài)無明顯變化。    Tab. 1  柚皮苷對表皮細(xì)胞株HaCaT細(xì)胞增殖的影響（MTT法） 論文教育信息網(wǎng)    2.2RANTES產(chǎn)生的作用     結(jié)果見Tab.2，HaCaT細(xì)胞在用TNF聯(lián)合INF刺

12、激48小時后，上清液所含RANTES的濃度明顯增加，HaCaT細(xì)胞的形態(tài)產(chǎn)生了明顯的變化，阿維A在 5×10-3  mmol·L-1，柚皮苷0.5、0.25 mmol·L-1預(yù)處理30min后可明顯抑制RANTES的產(chǎn)生。注：對照組相比  *P0.01  *P0.0012.3RANTES mRNA的表達(dá)實時定量RTPCR產(chǎn)物經(jīng)2瓊脂糖凝膠電泳，RANTES、GAPDH的mRNA基因轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增片段均在相應(yīng)的分子量位置(Fig. 1)。   

13、 根據(jù)實時熒光定量基因擴(kuò)增的動力曲線，各組目的基因RANTES以及內(nèi)參GAPDH的mRNA相對量的比值見Fig.2。正常培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞及經(jīng)TNF+INF、TNF+INF+阿維A、TNF+INF+柚皮苷處理細(xì)胞均有RANTES、GAPDH表達(dá)；RANTES在細(xì)胞因子處理的細(xì)胞中顯著表達(dá)，細(xì)胞因子未處理細(xì)胞微弱表達(dá)；而經(jīng)阿維A、柚皮苷處理的細(xì)胞明顯降低。Fig.1RANTES mRNA經(jīng)RTPCR表達(dá)產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖Quality is better than quantity.      3討論  

14、0;   RANTES由多種細(xì)胞分泌而來，作用于白細(xì)胞，使其趨化至炎癥區(qū)域并將其活化1，2。曾有學(xué)者通過體外實驗證實,正常人角質(zhì)形成細(xì)胞受到適量的TNF與IFN的聯(lián)合刺激，其分泌至上清液中的RANTES水平明顯增高5 。本實驗中，我們證實了聯(lián)合使用TNF與IFN能誘導(dǎo)人角質(zhì)形成細(xì)胞RANTES的明顯增高。The farmers are the founders of civilization and prosperity.      柚皮苷全稱為柚皮素7O新橙皮糖苷，屬二氫黃酮類化合物，是橘紅、骨碎補(bǔ)、枳

15、實、枳殼等中藥的主要有效成分6，具有顯著的抗氧化作用、抗炎、抗內(nèi)毒素作用。本實驗中，通過ELISA直接RANTES的含量，證明了柚皮苷能抑制被TNF與IFN誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞的RANTES的產(chǎn)生。同時分析了編碼RANTES基因的轉(zhuǎn)錄，應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)，該技術(shù)為實時（RealTime）熒光定量PCR，檢測對象為反應(yīng)進(jìn)程中模板DNA拷貝數(shù)的即時變化而非終產(chǎn)物含量。因而能夠通過對Ct值（擴(kuò)增曲線進(jìn)入指數(shù)期時的反應(yīng)循環(huán)數(shù)）的準(zhǔn)確判讀，按指數(shù)擴(kuò)增的規(guī)律計算出初始模板拷貝數(shù)。樣本的Ct值與該樣本起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。同時MTT法測定柚皮苷在1mmol·

16、L-1的情況下幾乎不影響HACAT細(xì)胞的活力，說明抑制RANTES的誘導(dǎo)產(chǎn)生不是由于柚皮苷對細(xì)胞的潛在毒性而致。推測柚皮苷抑制RANTES基因的轉(zhuǎn)錄以及表達(dá)可能通過一定的信號通路，有待進(jìn)一步研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 Selvan RS, Butterfield JH, Krangel MS. Expression of multiple chemokine genes by a human mast cell

17、0;leukemiaJ. J Biol Chem. 1994, 269(19):13893-13898.2 Nelson PJ, Ortiz BD, Pattison JM, et al. Identification of a novel regulatory region critical for expression of the RANTE

18、S chemokine in activated T lymphocytesJ. J Immunol. 1996, 157(3): 1139-1148.3 Ganesh Chandra JagetiaT, Tiyyagura Koti Reddy. Modulation of radiationinduced alteration in the antioxidant