鈣蛋白酶抑制劑對(duì)大鼠離體心臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

1、鈣蛋白酶抑制劑對(duì)大鼠離體心臟缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用    【摘要】  目的:研究calpain抑制劑（ALLN）對(duì)大鼠離體心臟缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法:45只雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常灌注組、缺血/再灌注組、ALLN+正常灌注組、ALLN+缺血/再灌注組和二甲亞砜+缺血/再灌注組,分別檢測再灌注15 min時(shí)冠狀動(dòng)脈流出量（CF）和冠脈流出液中乳酸脫氫酶(LDH)漏出量，熒光分光光度計(jì)測定熒光強(qiáng)度來反映calpain活性，免疫印跡法檢測心肌細(xì)胞calpain蛋白表達(dá)量，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)鈣熒光強(qiáng)度和細(xì)胞凋亡率，并計(jì)算凋亡指

2、數(shù)。結(jié)果：同缺血/再灌注組相比，ALLN+缺血/再灌注組CF顯著增高（P<0.01），LDH漏出量、calpain活性和蛋白表達(dá)量、胞內(nèi)鈣熒光強(qiáng)度和細(xì)胞凋亡指數(shù)均顯著降低（P<0.01）。結(jié)論:ALLN對(duì)離體心臟缺血/再灌注損傷有保護(hù)作用,可能與其抑制calpain活性，從而減輕calpain對(duì)細(xì)胞的損傷，減輕了細(xì)胞內(nèi)鈣超載有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】  鈣蛋白酶； 缺血再灌注損傷； 鈣離子； 凋亡    鈣蛋白酶（calpain）是半胱氨酸異源二聚體蛋白酶，廣泛存在于包括心臟在內(nèi)的各種組織細(xì)胞中，在體內(nèi)calpain可被鈣離子激活后對(duì)特定的底物進(jìn)行限

3、制性水解，參與了細(xì)胞增殖、分化、遷移和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等多種生物學(xué)功能1。calpain的異常激活則參與了許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如神經(jīng)退行性病、外傷性腦損傷和脊髓損傷等，而對(duì)其在心臟病理?xiàng)l件下的作用研究不是很多。本試驗(yàn)利用calpain特異性抑制劑，觀察其對(duì)離體大鼠心臟缺血/再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)損傷的影響，旨在探討calpain在I/R損傷中作用及可能的機(jī)制。    1  材料與方法    1.1  材料    1.1.1  主要試劑和儀器

4、60; calpain抑制劑(ALLN)、N-Succinyl-Leu-Tyr-AMC、AMC、calpain單克隆抗體、辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗、FLUO-3/AM FITC (美國Sigma公司)，Western blotting ECL發(fā)光試劑盒（美國Pierce公司），膠原酶型（美國Amresco公司），GAPDH單克隆抗體（上?？党缮锕荆渌噭閲a(chǎn)分析純。FACSAria流式細(xì)胞儀（美國BD公司），Langendorff離體灌流裝置由揚(yáng)州醫(yī)院心血管病研究所提供，熒光分光光度計(jì)（日立，F(xiàn)-4500），電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀及凝膠成像系統(tǒng)均為Bio-Rad公司產(chǎn)品。  

5、;  1.1.2  實(shí)驗(yàn)動(dòng)物  實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為成年雄性SD大鼠，250300 g，由揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物比較中心提供。    1.2  方法    1.2.1  離體大鼠心臟I/R模型的制備和分組  (1)模型制備：SD大鼠,3%戊巴比妥鈉30 mg?kg-1及肝素500 U?kg-1腹腔注射,麻醉后無菌條件下摘取心臟,在4 的Kerbs-Henseleit（K-H）液中迅速行主動(dòng)脈插管并與Langendorff逆灌裝置連接，用以95%O2、5%CO2達(dá)飽和的K-H液行逆行恒溫恒壓灌注，

6、整個(gè)試驗(yàn)過程中溫度控制在(37±0.5)、pH(7.4±0.5),灌注壓90 cmH2O，并于灌注過程中持續(xù)通入95%O2、5%CO2混合氣體。(2)分組：心臟復(fù)跳成功后平衡15 min隨機(jī)分為以下5組，每組9只。正常灌注組（control組）,離體大鼠心臟用K-H液灌注85 min。I/R組,離體大鼠心臟用K-H液先灌注15 min后停止灌注30 min，然后再用K-H液恢復(fù)灌注40 min。ALLN+control組,離體大鼠心臟用含10 mol?L-1ALLN的K-H液先灌注15 min，后用K-H液恢復(fù)灌注70 min。ALLN+I/R組，用含10 mol?L-1

7、ALLN的K-H液先灌注15 min，然后停止灌注30 min，接著再用K-H液恢復(fù)灌注40 min。二甲亞砜(DMSO)+I/R組，用含0.3%DMSO的K-H液先灌注15 min，然后停止灌注30 min，接著再用K-H液恢復(fù)灌注40 min。    1.2.2  乳酸脫氫酶(LDH)和冠狀動(dòng)脈流出量(CF)的測定  收集再灌注15 min時(shí)單位時(shí)間內(nèi)的CF，并應(yīng)用日立全自動(dòng)生化分析儀測定冠脈流出液中LDH的漏出量。    1.2.3  心肌勻漿制備  去除心房和右心室，將剩余的心臟組織剪碎

8、后加入10 ml?（g組織）-1勻漿液（10 mmol?L-1 NaHCO3，5 mmol?L-1NaN3，15 mmol?L-1Tris-HCl，pH 6.8），制成勻漿后離心（10 919 ×g，20 min），收集上清，分裝儲(chǔ)存于-70 ，以上操作均在4 進(jìn)行，蛋白濃度采用Bradford法測定。    1.2.4  calpain活性測定  我們以N-Succinyl-Leu-Tyr-AMC（calpain特異性作用底物）與calpain 反應(yīng)釋放出AMC的熒光強(qiáng)度來代表不同樣品中calpain的活性2。取150 l的心肌勻漿

9、液，加入1 ml的反應(yīng)緩沖液（145  mmol?L-1NaCl,100 mmol?L-1Tris-HCl，pH 7.3）37 水浴箱中振蕩10 min,再加入150 l的500 mol?L-1的N-Succinyl-Leu-Tyr-AMC，在37 水浴箱中振蕩60 min 后取1 ml加入比色皿，在熒光分光光度計(jì)上用波長為360 nm的光線激發(fā)后，測定在440 nm處發(fā)射的熒光強(qiáng)度。用已知濃度的AMC作標(biāo)準(zhǔn)曲線，測得的結(jié)果以ngAMC?min-1?(mg蛋白)-1表示。    1.2.5  Western blotting測定calpain蛋

10、白表達(dá)  取40 g 變性蛋白(心肌勻漿液)經(jīng)12SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后將膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上(電壓50 V，2 h)，轉(zhuǎn)膜后5脫脂奶粉4 封閉過夜，洗膜3次，每次10 min，洗膜后與11 000稀釋的calpain單克隆抗體37 結(jié)合2 h，洗膜3次，每次10 min，然后用14 000稀釋的辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗37 結(jié)合2 h，洗膜3次，每次10 min，以上的洗膜均在搖床上進(jìn)行，洗膜所用液體均為PBS+0.05Tween-20。最后用化學(xué)發(fā)光試劑ECL顯色，X光膠片曝光，顯影，定影。用同樣的方法做內(nèi)參GAPDH的Western blotting免疫印跡一抗（13

11、 500）,辣根過氧化酶標(biāo)記二抗（15 000），X光膠片采用Bio-RAD凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描，并用自帶的Quantity One分析軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行定量分析，各組calpain條帶與各自對(duì)應(yīng)的內(nèi)參GAPDH的積分光密度值的比值作為結(jié)果。    1.2.6  心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子及凋亡的測定  再灌注結(jié)束后，每組隨機(jī)取3枚心臟采用酶分解法制備成年大鼠心肌細(xì)胞3，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×106 ml-1，在相差顯微鏡下可見心肌細(xì)胞呈細(xì)長桿狀，邊緣光滑，橫紋清晰。    (1)心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子測定：每組樣品中加入適量的

12、FLUO-3/AM液（終濃度為5 mmol?L-1），混勻后避光37 振蕩30 min，去除負(fù)載液，用D-Hanks液洗滌3次，流式細(xì)胞儀參數(shù)設(shè)置激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長526 nm，每組樣品取10 000個(gè)細(xì)胞，以平均熒光強(qiáng)度代表各組細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度。FLUO-3/AM用DMSO配制，混勻后-20 保存。    (2)凋亡的測定：按照Annexin-FLUOS Staining KIT使用說明，取30 l Annexin-染料加入到1.5 ml的結(jié)合緩沖液中，再加入30 l PI染料，充分混勻。每個(gè)細(xì)胞樣品中加入100 l的混合染料，混勻，避光室溫放置1

13、5 min。用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率。結(jié)果判定Annexin-PI-為正常細(xì)胞，Annexin-+PI-為凋亡細(xì)胞，Annexin-+ PI+ 為壞死細(xì)胞。每組樣品取10 000個(gè)細(xì)胞，計(jì)算Annexin-+PI-細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比作為凋亡指數(shù)。    1.3  統(tǒng)計(jì)方法    數(shù)據(jù)以x-±s表示，應(yīng)用SPSS115統(tǒng)計(jì)軟件分析處理，并采用單因素方差檢驗(yàn)(ANOVA)分析組間差異的顯著性。若差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，進(jìn)一步進(jìn)行兩兩比較(SNK法)，P<005表示兩組間具有顯著差異。  &

14、#160; 2  結(jié)    果    2.1  各組間再灌注15 min時(shí)CF和LDH比較    與control組相比，I/R組和DMSO+I/R組的CF顯著降低(P<0.01)，LDH顯著升高(P<0.01)；ALLN+I/R組與I/R組比CF顯著升高(P<0.01)，LDH顯著降低(P<0.01)，與control組比，差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；此外，DMSO+I/R組與I/R組，ALLN+control組與control組之間CF、LDH

15、差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。見表1。表1  各組再灌注15 min時(shí)CF和LDH比較    2.2  各組間calpain活性比較    I/R組calpain活性為0.365 5±0.001 7，明顯高于control組的0.136 0±0.002 2(P<0.01）、ALLN+control 組的0.121 4±0.001 4(P<0.01)、ALLN+I/R組的0.154 7±0.003 0(P<0.01),而與DMSO+I/R組的0.362 8&

16、#177;0.002 1之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而control組與ALLN+control組、ALLN+I/R組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見表2。表2  各組calpain活性及calpain蛋白表達(dá)的比較     2.3  各組間calpain蛋白表達(dá)比較    I/R組calpain/GAPDH（2.34±0.20）明顯高于control組（0.73±0.13）、ALLN+control組（0.64±0.07）和ALLN+I/R組

17、（1.19±0.14)，均為P<0.01;ALLN+I/R組雖顯著低于I/R組，但與control組仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）;control組與ALLN+control組、I/R組與DMSO+I/R組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），見表2。蛋白印跡結(jié)果見圖1。    1. control組；2. ALLN+control組;    3. ALLN+I/R組；4. I/R組;    5. DMSO+I/R組    圖1  各組大鼠心肌c

18、alpain和    內(nèi)參GAPDH蛋白印跡    Fig 1  The protein blot of calpain and    GAPDH in all groups    2.4  各組間細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度比較    I/R組與DMSO+I/R組明顯高于其他各組（P<0.01），但它們兩組之間無明顯差異（P0.05）;ALLN+I/R組雖顯著低于I/R組，但與control組比較仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01

19、）;control組與ALLN+control組之間無明顯差異（P0.05）。見圖2。    2.5  各組間細(xì)胞凋亡指數(shù)的比較    與I/R組相比，control組、ALLN+control組和ALLN+I/R組的細(xì)胞凋亡指數(shù)均顯著降低（P<0.01）;DMSO+I/R組與I/R組相比無明顯差異（P0.05）; ALLN+I/R組雖顯著低于I/R組，但與control組相比仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）;control與ALLN+control組之間無顯著差異（P0.05）。見圖3。  &

20、#160; 3  討    論    心肌I/R損傷一直是臨床和基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn),其發(fā)生機(jī)制可能與再灌注期自由基生成過多、鈣超載、微血管損傷和能量生成不足等有關(guān)，其中鈣超載可通過以下機(jī)制引起心肌細(xì)胞功能障礙：(1)導(dǎo)致線粒體功能障礙。(2)引起心律失常。(3)使肌原纖維攣縮、斷裂。(4)激活許多鈣依賴的酶系統(tǒng)，如磷脂酶，可促進(jìn)膜磷脂水解，造成細(xì)胞膜及細(xì)胞器質(zhì)膜受損，此外還可激活calpain,后者是半胱氨酸異源二聚體蛋白酶，其家族包括具有組織特異性的n-calpain和非組織特異性的-calpain 和m-calpain。 其

21、中-calpain 和m-calpain分布廣泛且生化和催化特性十分相似，但兩者激活表現(xiàn)半最高活性所需鈣離子濃度不同，前者需120 mol?L-1,后者需250750 mol?L-1。calpain活性主要受calpain-激活蛋白，calpain-抑制蛋白（calpastatin）、鈣離子、PKA的磷酸化以及亞硝基化調(diào)節(jié)4-5。    本試驗(yàn)中我們利用離體心臟Langendorff灌流模型，測量了再灌注15 min時(shí)的CF和冠脈流出液中LDH的漏出量，并利用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞內(nèi)鈣水平和細(xì)胞的凋亡程度，從而綜合評(píng)價(jià)心臟損傷程度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，I/R組較control組

22、損傷明顯，證實(shí)我們離體大鼠心臟I/R模型構(gòu)建成功，若在I/R前預(yù)先使用10 mol?L-1的ALLN可明顯減輕I/R所致的損傷，但與control組仍有差異，這些提示ALLN通過抑制calpain活性，一定程度上減輕了I/R所致的細(xì)胞壞死和凋亡，這與國外一些研究是相符的。Barta等6試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)心肌纖維組成蛋白和骨架蛋白均可被calpain降解，其中相對(duì)分子質(zhì)量為284 000的胞襯蛋白(fodrin)和相對(duì)分子質(zhì)量為3 000 0003 300 000的肌聯(lián)蛋白（connectin）對(duì)calpain最敏感，所有這些蛋白的水解都將損傷心臟功能，而ALLN可減輕這種損傷。Chen等7通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)了

23、Ca2+i的增加可以激活calpain，后者水解Bid形成tBid(截短的Bid)，促使了BAX/BAK易位和寡聚化，促使細(xì)胞色素c的釋放，而ALLN可以阻止Bid活化所造成的細(xì)胞凋亡。    為進(jìn)一步研究calpain在I/R中的作用，我們利用calpain特異性熒光底物以及免疫印跡法分析了各組calpain活性和蛋白表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)calpain活性在I/R組明顯高于control組，而預(yù)先使用ALLN可使calpain活性明顯降低，但令人驚奇的是，該組細(xì)胞內(nèi)鈣水平較I/R組也顯著降低，此前Armstrong等8試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),激活的calpain可以蛋白水解肌漿

24、網(wǎng)膜骨架上的-fodrin，從而增加肌漿網(wǎng)的脆性，這些在再灌注的前幾分鐘持續(xù)惡化，使肌漿網(wǎng)對(duì)心肌細(xì)胞內(nèi)鈣的處理能力趨于崩潰，最終導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載的發(fā)生。由于心肌肌漿網(wǎng)是控制心肌細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)9及我們的試驗(yàn)結(jié)果，我們提出以下假設(shè)：在I/R損傷中，細(xì)胞內(nèi)calpain激活后發(fā)揮其蛋白酶的功能，損害肌漿網(wǎng)的功能，造成細(xì)胞內(nèi)鈣轉(zhuǎn)運(yùn)的失調(diào)，加重鈣超載，而增加的鈣離子又可以進(jìn)一步激活calpain，從而形成一惡性循環(huán)，而ALLN可以打斷這種循環(huán)，一定程度緩和了鈣超載，從而保護(hù)了細(xì)胞，這方面我們將在下一步試驗(yàn)中繼續(xù)研究。    關(guān)于calpain蛋白表達(dá)情

25、況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)calpain蛋白量與活性相一致，這提示在I/R損傷中calpain蛋白表達(dá)是增加的。此外為排除溶劑DMSO對(duì)試驗(yàn)的影響，我們?cè)黾覦MSO+I/R組，其各項(xiàng)指標(biāo)與I/R組相比無明顯差異。    綜上所述，我們認(rèn)為10 mol?L-1ALLN可一定程度緩和I/R引起的細(xì)胞壞死和凋亡，作用機(jī)制可能與其抑制calpain活性，從而減輕calpain對(duì)細(xì)胞的損傷，維持了細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)有關(guān)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1SAEZ M E,RAMIREZ-LORCA R,MORON F J,et al.The therapeutic potential of th

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