血管內(nèi)皮祖細胞對共同植入缺血再灌注模型大鼠腦內(nèi)的神

1、44號黑體,3倍行距血管內(nèi)皮祖細胞對共同植入缺血再灌注模型大鼠腦內(nèi)的神經(jīng)干細胞增殖、編號 200909194 刊用形式 論著 凋亡和血管形成的調(diào)節(jié)小五號宋體五號楷體富奇志1，齊志國1,朱曉峰2,謝 鵬3 (400016 重慶，重慶醫(yī)科大學(xué)：第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科1，神經(jīng)科學(xué)中心3；154002 黑龍江 佳木斯，佳木斯大學(xué)神經(jīng)科學(xué)中心2)小五號黑體小五號小標(biāo)宋小五號縮進左右各2個字符提要 目的 研究血管內(nèi)皮祖細胞（endothelial progenitor cells, EPCs）與神經(jīng)干細胞（neuron stem cells, NSCs）構(gòu)建的復(fù)合移植體對移植入缺血再灌注模型大鼠缺血半暗帶的

2、神經(jīng)干細胞增殖、凋亡和血管重建的影響。方法 線栓法建大鼠腦缺血再灌注模型；血管內(nèi)皮祖細胞、層粘連蛋白和神經(jīng)干細胞構(gòu)建的移植復(fù)合體移入模型鼠腦缺血半暗帶；免疫組化觀察Brdu標(biāo)記的移入腦內(nèi)神經(jīng)干細胞和缺血半暗帶血管新生，免疫熒光雙標(biāo)觀察神經(jīng)干細胞的凋亡情況。結(jié)果 移植后各時間點Brdu標(biāo)記的神經(jīng)干細胞數(shù)NSCs+EPCs組明顯高于NSCs組（P<0.05）；NSCs+EPCs組在各時間點的凋亡率明顯低于NSCs組（P<0.05）；各時間點NSCs+EPCs組血管新生數(shù)量明顯多于EPCs組、缺血對照組和NSCs組（P<0.05）。結(jié)論 血管內(nèi)皮祖細胞可以促進移植入缺血再灌注模型大

3、鼠缺血半暗帶的神經(jīng)干細胞增殖，減少其凋亡；2種細胞共移植可以促進缺血半暗帶的血管新生。小五號黑體關(guān)鍵詞 神經(jīng)干細胞；毛細血管內(nèi)皮祖細胞；缺血再灌注中圖法分類號 R322.81;R329.28;R743.31 文獻標(biāo)識碼 A4號加黑，單倍行距五號Endothelial progenitor cells combined implantation improves proliferation and suppresses apoptosis of neural stem cells and angiogenesis of MCAO/R rats 小五號Fu Qizhi1, Qi Zhiguo1,

4、Zhu Xiaofeng2, Xie Peng3 (1Department of Neurology, First Affiliated Hospital, 3Neuroscience Center, Chongqing Medical University, Chongqing, 400016; 2Neuroscience Center, Jiamusi University, Jiamusi, Heilongjiang Province, 154002, China)Tahoma字體以小五號縮進左右各2個字符英文提要內(nèi)容5號字體加粗Abstract Objective To investi

5、gate the effect of endothelial progenitor cells (EPCs) which complexed with neuron stem cells (NSCs) after transplanted into ischemia and reperfusion (I/R) rat model on the proliferation and apoptosis of the NSCs and vasal construction. Methods Totally 150 SD adult male rats were randomly and equall

6、y divided into 5 groups, sham operation group, I/R group, I/R+NSCs group, I/R+EPCs group, and I/R+NSCs+EPCs group. The rats were further divided into 5 subgroups according to the time points of 3, 7, 14, 30 and 60 d after transplantation. I/R rat model was established by reversiblyligating middle ce

7、rebral artery occlusion. NSCs were derived from the hippocampus of SD rats born in 24 h and identified with Nestin staining. EPCs were obtained from the artery blood of SD rats and verified with immunocytochemical stainings of CD31, CD34 and KDR after culture. The complex of NSCs and EPCs was produc

8、ed with aid of laminin. Then the complex were transplanted into the ischemia penumbra of corresponding model rat brain. The proliferation and apoptosis of NSCs, and the fomation of new vessels were observed through immunohistochemistry and double-labeled immunofluorescence staining. Results The prol

9、iferation of NSCs was increased, apoptosis cells were decreased and the new vessels were raised in the complex transplantation when compared with single NSCs or EPCs transplantation groups. Conclusion The complex of NSCs and EPCs transplantation improves the proliferation of NSCs, suppresses cell ap

10、optosis and promotes the formation of new vessels.加粗Key words neural stem cells; endothelial progenitor cells; ischemic and reperfusion小六號Supported by the National Basic Research Program (973 Program, 2009CB008300). Corresponding author: Xie Peng, Tel: 86-23-68485490, E-mail: xiepeng58_小六號,宋體基金項目 國家

11、重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（973計劃，2009CB008300）小六號黑號通信作者 謝 鵬，電話：(023)68485490，E-mail: xiepeng58前言五號宋體缺血性腦血管病是人類腦血管疾病中高致死致殘率的疾病之一。缺血性腦血管病包括兩大病理損害，即神經(jīng)元的缺損和局部血循環(huán)結(jié)構(gòu)的破壞。近年來，神經(jīng)再生和神經(jīng)干細胞(neural stem cells，NSCs)的發(fā)現(xiàn)為干細胞移植療法修復(fù)腦梗死病灶提供了依據(jù)1。但NSCs移植后成活率和神經(jīng)元轉(zhuǎn)化率低嚴重制約了NSCs移植在臨床上的應(yīng)用2。1997年，血管內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells, EPCs)分離

12、培養(yǎng)成功，并發(fā)現(xiàn)可以移植EPCs可以促進血管重建。研究發(fā)現(xiàn)，成人海馬與脈管系統(tǒng)相連的稠密叢中存在正在分裂的細胞，表明神經(jīng)再生的發(fā)生在血管生成的環(huán)境中，腦內(nèi)血管再生和神經(jīng)再生有緊密聯(lián)系。本實驗研究血管內(nèi)皮祖細胞和神經(jīng)干細胞中間填充神經(jīng)間黏附因子形成微細胞團移入缺血再灌注大鼠缺血半暗帶，觀察神經(jīng)干細胞的增殖和凋亡情況及缺血半暗區(qū)血管形成情況，為二者聯(lián)合移植治療缺血性腦血管病提供實驗依據(jù)。五號黑體,2倍行距五號楷體,1.5倍行距1 材料與方法1.1 主要試劑和儀器正文分兩欄成年雄性SD大鼠150只，實驗動物包括兩組第一組新生24 h內(nèi)SD大鼠60只和雄性SD大鼠20只（用于NSCs、EPCs原代細胞

13、培養(yǎng)）成年雄性SD大鼠培養(yǎng)，以上動物均（由重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，符合國家級動物標(biāo)準)，后者體質(zhì)量250350 g，隨機分為假手術(shù)組、缺血對照組、缺血后神經(jīng)干細胞移植組（NSCs組）、缺血后血管內(nèi)皮祖細胞移植組（EPCs組）、缺血神經(jīng)干細胞加血管內(nèi)皮祖細胞移植組（NSCs+EPCs組），各組又根椐移植后不同時間點分為3、7、14、30、60 d 5個亞組，每個時間點6只。1.2 藥品及試劑M-199培養(yǎng)基、胎牛血清、纖維連接蛋白（FN）、VEGF、bFGF、兔抗大鼠CD31單克隆抗體、兔抗大鼠CD34單克隆抗體、兔抗大鼠KDR單克隆抗體、羊抗兔(二抗)免疫組化染色試劑盒、濃縮型DAB試劑

14、盒(以上購自美國Sigma公司)；5溴脫氧尿苷（BrdU）、小鼠抗巢蛋白（Nestin）單克隆抗體、表皮生長因子（EGF）、兔抗大鼠VEGF單克隆抗體、小鼠抗大鼠caspase IgG、小鼠抗大鼠Brdu IgG單克隆抗體、抗小鼠免疫組化試劑盒（購自晶美生物工程公司）；層粘連蛋白（LN）（購自美國Invitrogen公司）；DMEM/F12干粉培養(yǎng)基(購自美國Gibico BRL公司)、SABCCY3試劑盒、B27(購自美國 Boster公司)。1.3 大鼠神經(jīng)干細胞的培養(yǎng)及鑒定在無菌條件，取新生24 h內(nèi)SD大鼠的海馬組織，剪碎后反復(fù)吹打，200目細胞篩網(wǎng)過濾后，離心5 min，棄上清，加入

15、完全神經(jīng)干細胞培養(yǎng)液（DMEM/F12，2B27，20 g/L, EGF）1 ml，用吸管輕輕吹打成細胞懸液，調(diào)整細胞密度為 5×108/L，加入25 cm培養(yǎng)瓶中，放入適量完全培養(yǎng)液，在37 、體積分數(shù)為0.05的CO2條件靜置培養(yǎng)7 d，每隔2天換液1次，7 d后傳代，傳3代后備用。采用免疫組織化學(xué)法Nestin染色鑒定神經(jīng)干細胞。1.4 EPCs的體外分離、培養(yǎng)和鑒定 參照Wang等3方法，抽取SD大鼠動脈血1015 ml，室溫下400 r/min離心30 min，吸出第2層的單核細胞層，然后用PBS清洗，細胞吹打成懸液后計數(shù)，將單核細胞以(13)×105的密度，分別

16、接種于鋪有FN的塑料培養(yǎng)皿中，加入培養(yǎng)液，放入37 ，5%CO2，濕度100%細胞培養(yǎng)箱，每4天換液1次。對培養(yǎng)的第4、7、10、14天的細胞，用甲醇固定2次，每次20 min，胎牛血清工作液封閉非特異性抗原30 min，分別加入鼠抗人CD31、CD34及兔抗人KDR單克隆抗體（150），37 孵育2 h，滴加生物素標(biāo)記二抗，37 孵育20 min，滴加辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液，DAB顯色。封片后上鏡觀察。1.5 EPCs和NSCs共移植復(fù)合體構(gòu)建 將傳代的EPCs用2.5 g/L胰酶消化20 min，輕輕吹打成單細胞，以3×107/L的密度接種在培養(yǎng)瓶中，12 h貼壁后吸出EPC

17、s培養(yǎng)液，涂以一層細胞外基質(zhì)（層粘連蛋白）后接種經(jīng)1.25 g/L胰酶消化20 min后吹打成單細胞的NSCs（以Brdu標(biāo)記），密度為6×108/L，加入NSCs完全培養(yǎng)液。培養(yǎng)36 h，經(jīng)鏡下觀察NSCs完全貼壁后吸出培養(yǎng)液，涂以一薄層細胞外基質(zhì)，再接種以上相同密度的EPCs，加入神經(jīng)干細胞完全培養(yǎng)液。70 ml培養(yǎng)瓶分別接種兩種細胞4 ml，共培養(yǎng)1224 h，鏡下觀察最后接種的EPCs貼壁，并由消化后的圓形變?yōu)闄E圓或不規(guī)形。用細胞刮刀將細胞從瓶壁上依次刮起，適力吹打成13個EPCs與518個NSCs相互包繞的細胞團，用150目細胞篩網(wǎng)過濾，取濾液再用500目細胞篩網(wǎng)過濾，取篩

18、網(wǎng)上細胞團即為共移植復(fù)合體。然后用免疫熒光方法進行鑒定。1.6 大腦中動脈缺血/再灌注動物模型的制備 除假手術(shù)組外，各組均采用Longa等4線栓法建立局灶性腦缺血再灌注動物模型。手術(shù)結(jié)束麻醉清醒后，神經(jīng)缺損評分標(biāo)準觀察大鼠神經(jīng)癥狀，選擇行走時身體向偏癱側(cè)轉(zhuǎn)圈作為移植對象。假手術(shù)組只麻醉，頸部皮膚切口，即縫合、不作其他處理。1.7 EPCs、NSCs及共移植復(fù)合體的移植 體溶解于磷酸鹽緩沖液中，細胞濃度調(diào)整為2×1010/L。EPCs組、NSCs組和NSCs+EPCs組分別移植3種細胞懸液10 l在立體定位儀下，經(jīng)微量注射器進行移植，移植速度為0.5 l/min，在缺血側(cè)缺血半暗帶區(qū)(

19、前囟后0.5 mm，矢狀縫右旁開3.5 mm)，垂直進針，在進針5.0 min后緩慢推入細胞懸液，留針10 min后緩慢拔針。1.8 神經(jīng)干細胞增殖和凋亡的檢測 Brdu陽性細胞免疫組化檢測：切片常規(guī)脫蠟至水，微波修復(fù)，加入小鼠抗大鼠Brdu一抗（1100）4 過夜，PBS沖洗；生物素化山羊抗小鼠IgG 25 孵育，PBS沖洗，DAB顯色，復(fù)染，鏡下計數(shù)Brdu陽性細胞數(shù)。免疫熒光雙標(biāo)染色：石蠟切片，按常規(guī)下行入水，加Brdu （1100）抗體與Caspase3（1200）的組合抗體，4 過夜，以含0.1% Triton X-100的PBS沖洗3次，加入CY3和FITC的二抗（CY3標(biāo)記Brd

20、u，F(xiàn)ITC標(biāo)記Caspase-3），37 孵育45 min， 0.05 mol碳酸緩沖液甘油封固。熒光顯微鏡下拍照，計數(shù)陽性細胞數(shù)。顯微鏡高倍視野(×400)下，在缺血側(cè)皮質(zhì)隨機選取5個不重復(fù)視野統(tǒng)計陽性細胞的平均數(shù)。凋亡率=NSCs雙陽性熒光細胞/Brdu陽性熒光細胞×100%1.10 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 10.0軟件進行統(tǒng)計處理，數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較行方差分析及q檢驗。2 結(jié)果2.1 EPCs、NSCs和共移植復(fù)合體鏡下所見及鑒定結(jié)果 海馬NSCs原代分離后在12 h內(nèi)單NSC相互聚集成云霧狀，4 d時即可見大量細胞球，由幾十個到上百個懸浮生長的圓

21、球形細胞組成，相差鏡下該細胞球立體感強，周邊光滑，但球中央可見細胞碎片摻雜。經(jīng)傳代后雜質(zhì)減少以至消失，克隆后經(jīng)Nestin免疫熒光鑒定，陽性細胞球呈細胞。新鮮分離的外周血單核細胞呈圓形，體積小浮在培養(yǎng)液中。34 d可見細胞開始增大貼壁，細胞數(shù)增加，細胞呈梭形；710 d出現(xiàn)多個細胞團并呈典型線樣排列。培養(yǎng)第4、7、10天時EPCs CD31、CD34及KDR免疫組化染色細胞呈陽性，1014 d細胞免疫熒光染色CD31、CD34及KDR表達在95%以上。顯微鏡下可見共移植體細胞團不規(guī)則，NSCs被EPCs包繞或相互粘貼，平均每個共移植體復(fù)合細胞數(shù)815個，其中EPCs平均2.8個。免疫熒光可見紅

22、色EPCs包被綠色NSCs，或相互粘貼（圖1）。一般單張照片高為5 cm，兩張排單欄，多張圖片,看版而排（可排通欄）圖表題目文字字體, 六號,中文黑體圖1免疫熒光觀察神經(jīng)干細胞和血管內(nèi)皮組細胞構(gòu)建的共移植復(fù)合體 （熒光顯微鏡 ×200）2.2 NSCs增殖情況假手術(shù)組、缺血對照組和EPCs組各時間點未見Brdu陽性細胞；NSCs組和NSCs+EPCs組3、7 d Brdu陽性細胞主要集中在針跡部位；14 d Brdu陽性細胞數(shù)最多，散在分布，部分與周圍組織整合；30、60 d陽性細胞數(shù)有所下降，細胞與周圍組織充分整合；各時間點Brdu陽性細胞數(shù)NSCs+EPCs組明顯高于NSCs組（

23、P<0.05）（表1、圖2）。表1 NSCs組和NSCs+EPCs組移植后不同時間點神經(jīng)干細胞的增殖數(shù)比較 （個，n=6，±s）組別表格內(nèi)容：一般為三線表小六號，宋體3 d7 d14 d30 d60 dNSCs組20.96±3.5828.74±3.2539.28±5.5222.65±3.7810.25±2.63NSCs+EPCs組38.64±4.33b45.38±4.97a圖表注釋：六號，楷體58.32±6.04a30.56±5.42a19.35±1.68ba：P<0.05

24、， b：P<0.01，與NSCs組比較3 討論討論：5 號宋體神經(jīng)干細胞的移植在缺血性腦血管疾病治療中的作用已經(jīng)明確，但植入缺血區(qū)的神經(jīng)干細胞分發(fā)生依賴于bax基因啟動的凋亡和“失巢”凋亡。其原因單純將神經(jīng)干細胞植入缺血半暗區(qū)，神經(jīng)干細胞不具備足夠的神經(jīng)因子分泌能力使細胞營養(yǎng)供應(yīng)不足和細胞間微信號調(diào)節(jié)中斷而引發(fā)了相關(guān)基因表達。這使神經(jīng)干細胞在缺血性腦血管疾病的應(yīng)用受到限制的主要因素。Asahara等5首次從人外周血中分離EPCs，并可分化為成熟內(nèi)皮細胞的特殊血細胞，具有歸巢能力、分泌功能和參與出生后血管再生等特性。Rehman等6研究發(fā)現(xiàn)EPCs能夠分泌多種細胞因子，如血管內(nèi)皮生長因子、

25、粒細胞克隆刺激因子、粒巨細胞克隆刺激因子等。其分化成熟后也可以分泌一些可溶性細胞因子，如胰島素樣生長因子（insulinlike gowth factor 1，IGF-1）、白細胞干擾素、血小板衍生生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子、粒細胞克隆刺激因子等7。在EPCs及其分化成熟細胞分泌的一些因子中，如胰島素樣生長因子、血管內(nèi)皮生長因子等能促進神經(jīng)干細胞的增殖抑制其凋亡8,9。層黏連蛋白是一種神經(jīng)細胞外基質(zhì)，其對神經(jīng)干細胞有保護作用減少其凋亡，還模擬類神經(jīng)生長因子的營養(yǎng)神經(jīng)的作用，促進神經(jīng)干細胞增殖，并通過模擬體內(nèi)環(huán)境解決失巢凋亡的發(fā)生10。本實驗結(jié)果顯示，在早期將EPCs、層粘連蛋白和NSCs復(fù)合體移入

26、大鼠缺血半暗帶后，神經(jīng)干細胞增殖較單純神經(jīng)干細胞移植增多且凋亡減少，這與EPCs的旁分泌和其與層黏連蛋白共同構(gòu)成神經(jīng)干細胞生存的微環(huán)境有關(guān)。后期由于移入的內(nèi)皮祖細胞加快了腦缺血區(qū)血管重建的發(fā)生，進一步改善了移入腦內(nèi)神經(jīng)干細胞的生存條件。本實驗也發(fā)現(xiàn)在復(fù)合體移植1個月后腦缺血半暗區(qū)仍有移入的神經(jīng)干細胞增生，且凋亡細胞明顯少于單純神經(jīng)干細胞移植組。血管新生和神經(jīng)再生是通過相同的因子進行調(diào)控協(xié)同和信號的相互聯(lián)系，這些因子主要括包括堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growthfactor，bFGF)、血管內(nèi)皮生長因子、IGF-1和轉(zhuǎn)化生長因子Q等，內(nèi)皮細胞分泌的已知可作用于神

27、經(jīng)元的有絲分裂原和分化存活的因子有bFGF、IGF-l、血管內(nèi)皮生長因子、血小板源性生長因子和腦源性生長因子(brainderived neurotrophicf-actor，BDNF)。在血管新生中產(chǎn)生的神經(jīng)因子對神經(jīng)干細胞保護作用的同時，神經(jīng)干細胞分泌的因子如BDNF、膠質(zhì)源性生長因子和神經(jīng)因子等11,12，也可以促進新生血管的形成。本實驗發(fā)現(xiàn)EPCs、層黏連蛋白和神經(jīng)干細胞復(fù)合體移入缺血半暗帶后血管新生的度明顯高于單純EPCs移植。這也說明血管新生和神經(jīng)發(fā)生具有協(xié)同作用。6號宋體段落：懸進縮進（與首行文字對齊）參考文獻：1Taupin P. Strokeinduced neurogene

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