熒光定量聚合酶鏈反應檢測EB病毒感染

1、熒光定量聚合酶鏈反應檢測EB病毒感染        【摘要】     目的 建立檢測EBV感染的新方法并觀察EBV與鼻咽癌的關系。方法 鼻咽部活檢組織和石蠟包埋標本66例,采用熒光定量聚合酶鏈反應(FQ|PCR)和原位雜交(ISH)兩種方法檢測EBV,其檢測結(jié)果與病理診斷對照。結(jié)果 FQ|PCR檢測EBV|DNA陰性52例,其中51例為炎性病變,另1例為腺癌;EBV|DNA陽性14例,其中13例為鱗狀細胞癌,另1例雖為炎癥,但部分上皮細胞呈不典型增生。ISH檢測EB

2、V陰性49例,其中47例為炎性病變,2例為癌。EBV陽性17例,其中12例為癌,5例為炎性病變。FQ|PCR和ISH檢測EBV結(jié)果,經(jīng)卡方檢測差異無顯著性(P>0.05)。結(jié)論 EBV感染與鼻咽癌有高度相關性。FQ|PCR檢測EBV具有方法簡單、快速、定量準確等優(yōu)點。     【關鍵詞】  EB病毒;聚合酶鏈反應;熒光光度測定法;鼻咽癌        Fluorescence quantitative PCR detected Infection of Epstein|

3、Barr virus    ZOU Xian|jing,LUO Kai,LIU Yin,et al    Jingmen First Renmin  Hospital,Hubei 448000,China    Abstract: Objective  To establish a novel method for detecting infection of Epstein|Barr Virus(EBV)and to observe relation between EBV and

4、nasopharyngeal carcinoma.Method  Real time fluorescence quantitative PCR(FQ|PCR) and in situ hybridization(ISH) method were used to detect infection of EBV in 66 cases specimens of nasopharyngeal biopsy and embeded in paraffin,the results were compared with pathologic diagnosis.Results  FQ

5、|PCR detected EBV|DNA negative 52 cases,51 cases was inflammatory disease,1 cases was adenocarcinoma; EBV|DNA positive 14 cases,13 cases was squamous cell carcinoma,1 case was inflammation,but epithelium atypical hyperplasia.ISH detected EBV|DNA negative 49 cases,47 cases was inflammatory disease,2

6、cases was carcinoma;EBV|DNA positive 17 cases,12 cases was carcinoma,5 cases was inflammation.EBV|DNA was detected by FQ|PCR and ISH,but results was not significantly different(P>0.05). Conclusion  Infection of EBV was frequently associated with nasopharyngeal carcinoma.Real time FQ|PCR is a

7、 simple,rapid and accurate method for detecting EBV.    Key words: Epstein|Earr virus;Polymerase chain reaction;Fluorophotometry;Nasopharyngeal carcinome    Epstein|Barr病毒(EBV)感染與伯基特淋巴瘤、何杰金氏病等多種腫瘤發(fā)生有關,尤其與鼻咽癌關系密切1,目前檢測EBV感染主要是測定血清EBV抗體,我們采用熒光定量聚合酶鏈反應(FQ|PCR)技術,檢測鼻咽部活檢組織中

8、EBV感染狀況,以探討EBV與鼻咽癌關系,報告如下:    1  材料與方法    1.1  標本來源    收集1998年11月1999年12月,我院鼻咽部活檢組織標本41例,隨機抽取前2年鼻咽部活檢組織蠟塊25例。標本經(jīng)10福爾馬林液固定12小時后取材,切下2mm3組織12塊,放入試管內(nèi),剩余組織做常規(guī)病理檢驗。石蠟包埋標本切5um厚切片58張放入1.5ml帶蓋試管內(nèi)。    1.2  儀器及試劑來源    儀器

9、為美國PE7700型自動熒光PCR儀。FQ|PCR|EBV試劑盒為廣州中山醫(yī)科大學達安基因診斷中心產(chǎn)品。EBV原位雜交試劑盒系購自武漢博士德公司產(chǎn)品。    1.3  方法    所有標本均用FQ|PCR和原位雜交(ISH)兩種方法檢測EBV。采用FQ|PCR檢測EBV時,組織經(jīng)漂洗、碾碎或經(jīng)脫蠟、漂洗后,按常規(guī)堿裂解法提取EBV|DNA。各反應管放入PE7700自動熒光檢測儀,按下列條件擴增:935min預變性,然后按9345s55120s共做40個循環(huán),反應結(jié)束后,電腦自動分析計算出定量結(jié)果。原位雜交按說明書操作。

10、60;   1.4  對照    FQ|PCR和ISH檢測EBV時均做陽性和陰性對照。    2  結(jié)果    2.1  FQ|PCR檢測EBV結(jié)果    66例標本經(jīng)病理診斷為炎性病變52例(1例伴部分上皮細胞輕度不典型增生),鼻咽癌14例(鱗狀細胞癌13例,腺癌1例)。FQ|PCR檢測EBV|DNA陰性標本52例,其中51例為炎性病變,另1例為腺癌。FQ|PCR檢測EBV|DNA陽性標本14例其中13例為鱗狀細胞癌,另1例

11、雖為炎癥,但部分上皮細胞呈輕度不典型增生。提示EBV感染與鼻咽癌有高度相關性。同時,我們還觀察到EBV|DNA拷貝數(shù)高低與癌細胞分化程度無相關性。    2.2  ISH檢測EBV結(jié)果    EBV陰性49例,其中47例為炎性病變,2例為癌。EBV陽性17例其中12例為癌,5例為炎性病變。FQ|PCR和ISH檢測EBV結(jié)果,經(jīng)卡方檢測差異無顯著性(2=0.379,P>0.05)。    2.3  活檢組織標本與石蠟包埋標本檢測EBV結(jié)果    FQ|

12、PCR檢測EBV|DNA陽性14例,其中活檢組織標本10例,石蠟包埋標本4例。活檢組織標本EBV|DNA平均拷貝數(shù)為4×104,其變動范圍為3.1×1038.9×107。石蠟包埋標本EBV|DNA平均拷貝數(shù)為2.5×103,變動范圍為5.5×1021.8×104,活檢組織標本EBV|DNA平均拷貝數(shù)高于石蠟包埋標本。因樣本例數(shù)少未做統(tǒng)計學處理。    3  討論    FQ|PCR是近幾年發(fā)展起來的新的核酸檢測技術2|4,該技術在常規(guī)PCR基礎上,加入了一條用熒光基

13、團標記的特異性探針。探針一端標記熒光報告基團，另一端標記熒光抑制基團，探針完整時，抑制基團吸收或抑制了報告基團的熒光.當有特異性PCR發(fā)生時，探針與引物同時結(jié)合于模板鏈上，引物延伸時，探針被Taq酶的5'3'活性作用切斷,這時抑制基團的作用消失,報告基團的熒光信號增強,被切斷的熒光探針的量與被擴增的目的基因量呈一一對應關系。因此,熒光信號強度伴隨著PCR產(chǎn)物的增長而增長。FQ|PCR在PCR反應過程中,實時檢測反應體系中熒光信號的變化,待反應結(jié)束后,自動計算出起始DNA的拷貝數(shù)。    我們采用FQ|PCR和ISH方法對比檢測EBV感染的結(jié)果雖無統(tǒng)

14、計學意義,但參照病理診斷，顯然FQ|PCR檢測EBV結(jié)果更可靠。FQ|PCR方法簡便,快速,3h內(nèi)即可出檢測結(jié)果。同時它采用實時動態(tài)檢測技術，自動計算檢測結(jié)果，定量準確,不受觀察者主觀因素影響。ISH檢測EBV則有費時、費力、不能定量,判讀結(jié)果時還易受觀察者主觀因素影響等缺點。    本組FQ|PCR檢測EBV52例陰性病例中,僅1例為腺癌,14例陽性病例中,13例為鱗狀上皮癌,1例慢性炎伴部分上皮不典型增生。根據(jù)這些結(jié)果看,鼻咽鱗狀上皮癌和EBV關系密切,似乎表明在上皮增生階段EBV參與其作用。有趣的是本組一例腺癌和EBV感染沒有明顯關系。根據(jù)本組2種方法檢測E

15、BV感染的結(jié)果比較來看,我們體會到FQ|PCR檢測EBV具有方法簡單、快速、定量準確等優(yōu)點。它既可用于臨床病理檢驗日常工作中,更適合于做大批量防癌普查和用石蠟包埋標本做回顧性研究。    【參考文獻】  1 Joseph S,Pagano MD.The Epstein|Barr virus and nasopharyngeal carcinomaJ.Cancer,1994,74（9）:2397|2398.    2 Gibson EM, Heid CA, Williams PM.A novel method for real time quantitative RT|PCRJ.Genome Res,1996,6(8):995 |1001.    3 Heid CA, Stevens J, Livak KJ, et al. Real time quantitative PCRJ.Genome Res,1996,6(8):986|994.   &