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文檔簡介

1、一、實驗原理PCR是一種選擇性擴增 DNA RNA的方法，其基本原理是依據(jù)體內(nèi)細胞分裂中的DNA半保留復制機理，以及在體外dNTP分子于不同溫度下雙鏈和單鏈可以互相轉(zhuǎn)變的性質(zhì)，人為地控制體外合成系統(tǒng)的溫度，以促使雙鏈DNA變成單鏈DNA單鏈DNA與人工合成的引物退火，以及在dNTP存在下，耐高溫的 DNA聚合酶使引物沿單鏈模板延伸成為雙鏈DNAPC或應分3步：變性：通過加熱使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，雙鏈解離形成單鏈 DNA 退火：當溫度突然降低時，由于模板分子結(jié)構(gòu)較引物要復雜得多，而且反應體系中引物 DNAS大大多于模板 DNA使引物和其互補的模板在局部形成雜交鏈，而模板DNA雙鏈之間互補的機

2、會較少。延伸：在DN咪合酶和4種dNTP底物及Mg2+存在的條件下，5'-3'的聚合酶催化以引物為起始點的DNAB1延伸反應，以上3步為一個循環(huán)，每一循環(huán)的產(chǎn)物可以作為下一個循環(huán)的模板，數(shù)小時之后，介于兩個引物之間的特異性 DNA段得到了大量復制， 數(shù)量可達2X1067拷貝。變性退火延伸圖反應歷程二、實驗材料1 模板：細菌 DNA 2 TsgDN咪合酶 3 dNTP混合液4 10 倍濃度 PC襟沖液 5 LMgCl2 6 RAPfl 物：S14 S15 S18 S66 S74 S88 S97S103 S110 S115 7提取細菌 DNA勺相關(guān)試劑三、操作步驟1 .細菌染色體D

3、NA的提?。ㄒ娚弦唤M）2 . RAPW應體系的配置試劑濃度加入量順加10倍濃度PC襟沖液樣dNTP混合液各L上游引物L下游引物L細菌DNA2550ngTsgDNAM 合酶L氯化鎂溶液超純水10ul總體積25ul3 ,反應程序：將RAP反應試劑加入EP管中輕混后用100ul石蠟油覆蓋于反應混合液之上，防止樣品在反復加熱-冷卻的過程中蒸發(fā)，蓋好蓋子打開PC或應儀輸入以下反應數(shù)據(jù)94攝氏度預變性5min94攝氏度變性40s40攝氏度退火40s72攝氏度延伸1min將EP管放入儀器開始擴增，循環(huán)35次；72攝氏度延伸10min儀器為 Model MyGene 25 Plus三、注意事項1、PCR反應體系中DNA羊品及各種試劑的用量都極少，必須嚴格注意吸樣量的準確性及全部放入反應體系中。2、為避免污染凡是用在 PC或應中的Tip尖、離心管、蒸儲水都要滅菌；吸每種試劑時都要換新的滅菌Tip尖。3、加試劑時先加消毒三蒸水，最后加DNA莫板和Taq DNA聚合酶。4、置PCR儀進行PC或應前，PCRf要蓋緊，否則使液體蒸發(fā)影響PC阪應。5. 引物條件首先引物與模板的序列要緊

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