人工結(jié)合抗原制備

1、編輯ppt1人工結(jié)合抗原人工結(jié)合抗原制備制備 20130805編輯ppt2 抗原是指能夠刺激機體產(chǎn)生（特異性）免疫應(yīng)答，并能與免疫應(yīng)答產(chǎn)物抗體和致敏淋巴細胞在體內(nèi)外結(jié)合，發(fā)生免疫效應(yīng)（特異性反應(yīng)）的物質(zhì)。 抗原的基本特性：誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的能力，即免疫原性。與免疫應(yīng)答的產(chǎn)物發(fā)生反應(yīng)，即抗原性（免疫反應(yīng)性）。編輯ppt3免疫原具有免疫原性的物質(zhì)免疫原性的免疫原性的化學(xué)基礎(chǔ)化學(xué)基礎(chǔ)化學(xué)組成化學(xué)組成 分子量分子量 化學(xué)結(jié)構(gòu)化學(xué)結(jié)構(gòu) 大分子蛋白、多糖等大分子蛋白、多糖等 10000 具有免疫原性具有免疫原性 ；4000 免疫原免疫原 10000 呈呈弱免疫原性弱免疫原性 ； 4000 一般不具一般不具有免

2、疫原性。有免疫原性。一般而言，分子結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)愈復(fù)雜的物一般而言，分子結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)愈復(fù)雜的物質(zhì)免疫原性愈強質(zhì)免疫原性愈強編輯ppt4人工抗原 人工抗原：用化學(xué)合成法或基因重組法制備含有已知化學(xué)結(jié)構(gòu)決定簇的抗原，稱之為人工抗原。人工結(jié)合抗原：將無免疫原性的簡單化學(xué)基團與蛋白質(zhì)載體偶聯(lián)，或?qū)o免疫原性的有機分子如二硝基苯（DNP）或三硝基苯（TNP）與蛋白質(zhì)載體結(jié)合，形成載體-半抗原結(jié)合物，均屬人工結(jié)合抗原。人工合成抗原：用化學(xué)方法將活化氨基酸聚合，使之成為合成多肽。只由一種氨基酸形成的聚合體稱為同聚多肽，如由左旋賴氨酸形成的共同聚多肽（PLL）?；蚬こ炭乖簩⒕幋a免疫原性氨基酸序列的基因克

3、隆化并與適當(dāng)載體（如細菌?；虿《荆〥NA分子相結(jié)合，然后引入受體細胞中（如原核細胞的大腸桿菌或真核細胞酵母菌及哺乳類動物細胞）使之表達，即能獲得免疫原性之融合蛋白，經(jīng)純化后可做為疫苗，此即基因工程疫苗。編輯ppt5人工結(jié)合抗原半抗原半抗原：能與對應(yīng)抗體結(jié)合出現(xiàn)抗原-抗體反應(yīng) 、又不能單獨激發(fā)人或動物體產(chǎn)生抗體的抗原。它只有反應(yīng)原性，不具免疫原性，又稱不完全抗原。一些比一般半抗原分子量小，但有特異結(jié)構(gòu)的化學(xué)活性基團物質(zhì)（ 如青霉素、磺胺劑等 ） ，稱為簡單半抗原。載體蛋白載體蛋白：制作人工結(jié)合抗原時與半抗原進行偶聯(lián)的具有免疫原性的生物大分子，主要為大分子的蛋白質(zhì)。如：牛血清白蛋白(BSA)。載體

4、蛋白半抗原偶聯(lián)橋 編輯ppt6半抗原選擇合適的多肽序列，蛋白質(zhì)的抗原決定簇一般由6-12個氨基酸構(gòu)成，呈連續(xù)性或者非連續(xù)性序列?？乖瓫Q定簇大部分為親水性基團，暴露在外側(cè)，抗原決定簇柔韌性比較高。制備性抗原地多肽有效長度一般是10-20個氨基； 334Da 半抗原的分子量 374Da 制備的單克隆抗體具有很高的親和系數(shù)。 300Da 產(chǎn)生具有良好靈敏度和特異性單克隆抗體的可能性下降。確定抗原性區(qū)域確定抗原性區(qū)域親水性親水性、表露性表露性、 柔韌性柔韌性確定多肽的長度確定多肽的長度半抗原半抗原編輯ppt7人工抗原合成常用的載體 載體表面應(yīng)首先應(yīng)具有化學(xué)活性基團。 載體應(yīng)具備一定的容量，可以偶聯(lián)足夠

5、的分子。 載體應(yīng)該是惰性的，不應(yīng)干擾偶聯(lián)分子的功能。 載體應(yīng)具有足夠的穩(wěn)定性，且應(yīng)該是廉價易得的。 牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、鑰孔血藍蛋白(KLH)、人血清白蛋白(HSA)及人工合成的多聚賴氨酸(PLL)等是常用的載體蛋白。載體的特點編輯ppt8蛋白偶聯(lián)方法 一般是由半抗原上的活性基團決定偶聯(lián)合成的方法。 所有的偶聯(lián)方法都應(yīng)該是通過羧基或氨基端殘基將多肽耦聯(lián)到載體蛋白上。緩沖液成分及其純度和離子強度、PH偶聯(lián)劑的有效濃度偶聯(lián)物的濃度偶聯(lián)劑相對量偶聯(lián)物相對比例半抗原的穩(wěn)定性、可溶性、理化特性偶聯(lián)效果通常是在條件溫和的水溶液中將半抗原與載體蛋白共價結(jié)合，不宜在高溫、低溫、強堿、強

6、酸條件下進行。編輯ppt9蛋白偶聯(lián)方法 分子中含有羧基或者可羧化的半抗原的偶聯(lián)混合酸酐法（mixed anhydride method），又稱氯甲酸異丁酯法 正丁胺 -COOH- 中間體+NH3+ 結(jié)合產(chǎn)物 +氯甲酸異丁酯碳二亞胺法(EDC) 半抗原半抗原載體蛋白酰胺鍵酰胺鍵EDC編輯ppt10蛋白偶聯(lián)方法 含有氨基或可還原硝基半抗原的偶聯(lián) 戊二醛法 -N=C （schiff鍵） 重氮化法 （用于活性基團是芳香胺基的半抗原） 芳香胺基+NaNO2 +HCl 重氮鹽編輯ppt11蛋白偶聯(lián)方法 含羥基半抗原的偶聯(lián) 琥珀酸酐法 -OH-+琥珀酸酐 無水吡啶 帶有羧基的中間體 EDC法或混合酸酐法 結(jié)

7、合產(chǎn)物 羰基二咪唑法（CDI） N，N-羰基二咪唑是引入羰基的高活性試劑編輯ppt12方法舉例（EDC法實驗步驟）mTP 5 mgcBSA 2.5 mgTE buffer（pH 8.0） 250 l EDCHCl 79 mg充分溶解于250 l TE buffer（pH 8.0）37 搖床中反應(yīng)搖床中反應(yīng)2 hSephadex柱0.5 ml 溶液在PBS中透析3 d透析產(chǎn)物小劑量分裝，于20 保存?zhèn)溆镁庉媝pt13影響人工抗原質(zhì)量的因素偶聯(lián)比（聯(lián)接到蛋白質(zhì)分子上的半抗原數(shù)目） 連接到蛋白分子上的半抗原數(shù)以5-20為宜，為了取得最佳免疫效果，應(yīng)逐個確定各種載體的最佳結(jié)合比。偶聯(lián)橋 結(jié)構(gòu)簡單，能量低，直鏈，有助于半抗原暴露在外面 最好3-6個直鏈的碳原子結(jié)構(gòu)半抗原的分子空間結(jié)構(gòu) 最好有分支結(jié)構(gòu)， 最好盡可能利用不同位點都合成