豬偽狂犬病的PCR診斷ppt課件

1、實(shí)驗(yàn)七實(shí)驗(yàn)七 豬偽狂犬病豬偽狂犬病PCRPCR診斷診斷實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、了解PCR反響的原理、方法及操作步驟；2、掌握豬偽狂犬病毒PCR檢測(cè)的方法；實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：1、講述PCR反響的原理、方法及操作步驟，2、豬偽狂犬病毒PCR檢測(cè)。什么是什么是PCR？ 聚合酶鏈?zhǔn)椒错懢酆厦告準(zhǔn)椒错慞olymerase Chain Reaction，簡(jiǎn)稱簡(jiǎn)稱PCR又稱無細(xì)胞分子克隆或特異性又稱無細(xì)胞分子克隆或特異性DNA序列序列體外引物定向酶促擴(kuò)增技術(shù)。體外引物定向酶促擴(kuò)增技術(shù)。一、PCR反響的原理、方法及操作步驟PCR原理原理 PCR PCR是一種選擇性擴(kuò)增是一種選擇性擴(kuò)增DNADNA或或RNARNA的方法，其根本原

2、理是根的方法，其根本原理是根據(jù)體內(nèi)細(xì)胞分裂中的據(jù)體內(nèi)細(xì)胞分裂中的DNADNA半保管復(fù)制機(jī)理，以及在體外半保管復(fù)制機(jī)理，以及在體外DNADNA分子于不同溫度下雙鏈和單鏈可以相互轉(zhuǎn)變的性質(zhì)，人為分子于不同溫度下雙鏈和單鏈可以相互轉(zhuǎn)變的性質(zhì)，人為地控制體外合成系統(tǒng)的溫度，以促使雙鏈地控制體外合成系統(tǒng)的溫度，以促使雙鏈DNADNA變成單鏈；變成單鏈；單鏈單鏈DNADNA與人工合成的引物退火，以及在與人工合成的引物退火，以及在dNTPdNTP存在下，耐存在下，耐高溫的高溫的DNADNA聚合酶使引物沿單鏈模板延伸成為雙鏈聚合酶使引物沿單鏈模板延伸成為雙鏈DNADNA。高。高溫變性，低溫退火，適溫延伸等步反

3、響循環(huán)進(jìn)展，使目溫變性，低溫退火，適溫延伸等步反響循環(huán)進(jìn)展，使目的的DNADNA得以迅速擴(kuò)增。得以迅速擴(kuò)增。PCR原理原理 PCRPCR技術(shù)在模板技術(shù)在模板DNADNA、dNTPdNTP、Mg2+Mg2+、適宜、適宜BufferBuffer等條件下，用耐熱的等條件下，用耐熱的TaqTaq聚合酶替代聚合酶替代DNADNA聚合酶，用合成的聚合酶，用合成的DNADNA引物替代引物替代RNARNA引物，經(jīng)過引物，經(jīng)過DNADNA變性、引物與模板結(jié)合復(fù)性和延伸變性、引物與模板結(jié)合復(fù)性和延伸3 3個(gè)個(gè)步驟的反復(fù)循環(huán)步驟的反復(fù)循環(huán) 25253030次過程，使目的次過程，使目的DNADNA呈指數(shù)擴(kuò)增呈指數(shù)擴(kuò)增

4、 。反響程序反響程序 變性：變性：93-94 2min93-94 2min 變性：變性：93-94 30s93-94 30s 復(fù)性：復(fù)性：55-65 30s55-65 30s 延伸：延伸：72 30s72 30s 延伸：延伸：72 2min72 2min3535個(gè)循環(huán)個(gè)循環(huán)PCRPCR原理原理Sample denaturatationPrimer annealingPrimer extensionPCR productPCR product規(guī)范的規(guī)范的PCRPCR反響體系反響體系 10擴(kuò)增緩沖液擴(kuò)增緩沖液 10ul 4種種dNTP混合物混合物 各各200umol/L 引物引物 10100pmo

5、l 模板模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加雙或三蒸水至加雙或三蒸水至 100ul酶及其濃度酶及其濃度 目前有兩種目前有兩種 Taq DNA Taq DNA 聚合酶供應(yīng)聚合酶供應(yīng) 天然酶：從棲熱水生桿菌中提純天然酶：從棲熱水生桿菌中提純 基因工程酶：大腸菌合成基因工程酶：大腸菌合成 一個(gè)典型的一個(gè)典型的 PCRPCR反響約需酶量反響約需酶量 2.5U2.5U指總反響指總反響體積為體積為100 ul100 ul時(shí)時(shí) 濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過低那么合成濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過低那么合成產(chǎn)物量減少產(chǎn)物量減少引物引物 引物

6、是引物是PCRPCR特異性反響的關(guān)鍵特異性反響的關(guān)鍵 PCR PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNADNA互補(bǔ)的程度互補(bǔ)的程度 實(shí)際上，只需知道任何一段模板實(shí)際上，只需知道任何一段模板DNADNA序列，就能按其設(shè)序列，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，用計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，用 PCRPCR就可將模板就可將模板DNADNA在在體外大量擴(kuò)增體外大量擴(kuò)增引物在線設(shè)計(jì)引物在線設(shè)計(jì) /cgi-bin/ primer/primer3_cgiPCRPCR產(chǎn)物分析產(chǎn)物分析 凝膠電泳分析法凝膠電泳分析法 可用瓊脂糖可用瓊脂糖AgroseAgrose或聚丙烯酰胺或聚丙烯酰胺PAGEPAGE凝膠電凝膠電泳檢測(cè)泳檢測(cè)PCRPCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小。擴(kuò)增產(chǎn)物的大小。 同時(shí)應(yīng)以規(guī)范同時(shí)應(yīng)以規(guī)范DNADNA分子量作平行對(duì)照，凝膠中參與溴化分子量作平行對(duì)照，凝膠中參與溴化乙錠，電泳后，紫外檢測(cè)儀下察看結(jié)果并拍照。乙錠，電