生物化學簡明教程第二章蛋白質

1、生物化學簡明教程（第四版）第2章 蛋白質1. 蛋白質：是由許多不同的-氨基酸按一定的序列通過酰胺鍵（肽鍵）縮合而成的，具有較穩(wěn)定的構象和一定生物功能的生物大分子。2.蛋白質的生物學作用：蛋白質是生物體的重要組成成分； 蛋白質具有重要的生物學功能： 1）作為生物催化劑（酶） 2）物質的轉運和儲存 3）運動與支持作用 4）免疫保護作用 5）代謝調節(jié)作用 6）參與細胞間信息傳遞 氧化供能3. 蛋白質是生物體的重要組成成分：分布廣：所有器官、組織都含有蛋白質；細胞的各個部分都含有蛋白質。含量高：蛋白質是細胞內最豐富的有機分子，占人體干重的45，某些組織含量更高，例如脾、肺及橫紋肌等高達80。4. 蛋白

2、質的元素組成：C（5055%）、H（68%）、O（2023%）、N（1518%）、 S（04%）、Others: P、Cu、Fe、Zn、Mn、Se、I等。5. 每1g蛋白質中的氮相當于6.25g蛋白質。6. 凱氏（Kjeldahl）定氮法：蛋白質含量=（總氮含量-無機氮含量）×6.25?？偨Y：從蛋白質水解物中分離出來的氨基酸有二十種，除脯氨酸和羥脯氨酸外，這些天然氨基酸在結構上的共同特點為：(1)與羧基相鄰的-碳原子上都有一個氨基，因而稱為-氨基酸(2)除甘氨酸外,其它所有氨基酸分子中的-碳原子都為不對稱碳原子,所以： A.氨基酸都具有旋光性，左旋（-）或右旋（+） B.每一種氨基酸

3、都具有D-型和L-型兩種立體異構體。目前已知的天然蛋白質中氨基酸都為L-型。2.1 蛋白質的分類2.1.1根據(jù)分子形狀分類1） 球狀蛋白質：（globular protein）外形接近球形或橢圓形，溶解性較好，能形成結晶，大多數(shù)蛋白質屬于這一類。顆星使多種多樣的生物學功能。2） 纖維狀蛋白質(fibrous protein)分子構象類似纖維或細棒。它又可分為可溶性纖維狀蛋白質和不溶性纖維狀蛋白質。大多數(shù)不溶于水。3） 膜蛋白質：一般折疊成近球形，插入生物膜。2.1.2根據(jù)分子組成分類1. 簡單蛋白(simple protein) ：又稱為單純蛋白質；這類蛋白質只含由-氨基酸組成的肽鏈，不含其它

4、成分。（僅由肽鏈組成，不含有其他輔助成分的蛋白質。）（1）清蛋白和球蛋白：（albumin and globulin）廣泛存在于動物組織中。清蛋白易溶于水，球蛋白微溶于水，易溶于稀酸中。（2）谷蛋白(glutelin)和醇溶谷蛋白(prolamin)：植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸、稀堿中，后者可溶于7080乙醇中。（3）精蛋白和組蛋白：堿性蛋白質，存在與細胞核中。（4）硬蛋白：存在于各種軟骨、腱、毛、發(fā)、絲等組織中，分為角蛋白、膠原蛋白、彈性蛋白和絲蛋白。2.結合蛋白(conjugated protein)：由簡單蛋白與其它非蛋白成分結 合而成，其輔助成分通常稱為輔基。（1）核蛋白：由簡單蛋

5、白與核酸結合而成。如細胞核中的核糖核蛋白等。（2）糖蛋白與蛋白聚糖：由簡單蛋白與糖類物質組成。如細胞膜中的糖蛋白等。糖與蛋白質的結合方式：O連接和N連接（3）脂蛋白：由簡單蛋白與脂類結合而成。 如血清a-，b-脂蛋白等。（4）色蛋白：由簡單蛋白與色素結合而成。如血紅素、過氧化氫酶、細胞色素c等。（5）磷蛋白：由簡單蛋白質和磷酸組成。如胃蛋白酶、酪蛋白、角蛋白、彈性蛋白、絲心蛋白等。2.1.3根據(jù)功能分類酶調節(jié)蛋白貯存蛋白轉運蛋白質運動蛋白防御蛋白和毒蛋白受體蛋白支架蛋白結構蛋白異常功能2.2蛋白質的組成單位氨基酸氨基酸 （amino acid) 是蛋白質的基本組成單位。從細菌到人類，所有蛋白質

6、都由20種標準氨基酸組成。2.2.1氨基酸的結構通式2.2.2氨基酸的分類1. 根據(jù)R基的化學結構，可將氨基酸分為脂肪族氨基酸（疏水性：Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Cys；極性：Arg、Lys、Asp、Glu、Asn、Gln、Ser、Thr）芳香族氨基酸：Phe、Tyr雜環(huán)氨基酸：Trp、His雜環(huán)亞氨基酸：Pro2. 按照R基的極性：非極性R基氨基酸：Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Met、Pro、Trp不帶電荷的極性R基氨基酸：Ser、Thr、Asn、Gln、Tyr、Cys極性帶負電荷的R基氨基酸：Asp、Glu極性帶正電荷的R基氨基酸：His、Lys、

7、Arg3. 20種常見氨基酸的名稱和結構式（見教材P22-24）4. 20種標準氨基酸總結：屬于芳香族氨基酸的是：色氨酸Trp、酪氨酸Tyr、苯丙氨酸Phe屬于亞氨基酸的是：脯氨酸Pro含硫氨基酸包括：半胱氨酸Cys、甲硫氨酸Met分子量最小的氨基酸是:甘氨酸Gly能形成二硫鍵的氨基酸是:半胱氨酸Cys含二羧基一氨基的氨基酸有：谷氨酸Glu、天冬氨酸Asp2.2.3氨基酸的理化性質一般物理性質：1.氨基酸一般有味（無味、甜、苦、鮮等）；一般均溶于水，溶于酸、堿中；不溶于有機溶劑。高熔點（200以上）2.氨基酸的旋光性及立體異構：除甘氨酸外，氨基酸含有一個手性a-碳原子，因此都具有旋光性左旋（-

8、）或右旋（+），比旋光度是氨基酸的重要物理常數(shù)之一，是鑒別各種氨基酸的重要依據(jù)。3.氨基酸的光吸收：構成蛋白質的20種氨基酸在可見光區(qū)都沒有光吸收，但在遠紫外區(qū)(<220nm)均有光吸收。在近紫外區(qū)(220-300nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。酪氨酸的lmax275nm，苯丙氨酸的lmax257nm，色氨酸的lmax280nm。4.兩性電離和等電點： 氨基酸在水溶液中或在晶體狀態(tài)時都以離子形式存在，所謂兩性離子是指在同一個氨基酸分子上帶有能放出質子的NH3+正離子和能接受質子的COO-負離子，因此氨基酸為兩性電解質。5.等電點：調節(jié)氨基酸溶液的pH，使氨基酸分子上的N

9、H3+基和COO-基的解離程度完全相等時，即所帶凈電荷為零，此時氨基酸所處溶液的pH值稱為該氨基酸的等電點（pI）。 （當氨基酸相互連接成蛋白質時，只有其側鏈基團和末端的-氨基，-羧基是可以離子化的。）6.移動定義：在電場中，不向任何一極移動。（此時溶液的PH也叫做氨基酸的等電點。）7. 氨基酸等電點的確定：酸堿滴定（滴定曲線）根據(jù)pK值（該基團在此pH一半解離）計算：等電點等于兩性離子兩側pK值的算術平均數(shù)。pI=或者 pI=注意：對多氨基和多羧基氨基酸的解離原則：結論：中性氨基酸：pK1為羧基的解離常數(shù)，pK2為氨基的解離常數(shù)。pI=(pK1+pK2)/2酸性氨基酸：pK1為羧基的解離常數(shù)

10、，pK2為側鏈羧基的解離常數(shù)。pI=(pK1+pK2)/2堿性氨基酸：pK2為氨基的解離常數(shù)，pK3為側鏈氨基的解離常數(shù)。pI=(pK2+pK3)/28.等電點的應用：pH>pI，aa“-”，aa向正極移動 pH<pI，aa“+”，aa向負極移動 pH=pI，aa“0”，aa不移動溶液的pH偏離pI越遠，氨基酸帶凈電荷越多，在電場中越容易分離。利用不同的氨基酸在同一pH下所帶電荷不同而分離，如用陰離子交換樹脂柱層析分離氨基酸。等電點時,氨基酸溶解度最小，容易聚集沉淀?；瘜W性質：1. 與茚三酮的反應：氨基酸與水合茚三酮共熱，發(fā)生氧化脫氨反應，生成NH3與酮酸。水合茚三酮變?yōu)檫€原型茚三

11、酮。加熱過程中酮酸裂解，放出CO2，自身變?yōu)樯僖粋€碳的醛。水合茚三酮變?yōu)檫€原型茚三酮。NH3與水合茚三酮及還原型茚三酮脫水縮合，生成藍紫色化合物。脯氨酸和羥脯氨酸與茚三酮反應產(chǎn)生黃色物質。反應要點與應用：A.該反應由-NH2與-COOH共同參與B.茚三酮是強氧化劑C.用于氨基酸的定性、定量分析D.該反應非常靈敏，可在570nm測定吸光值E.測定范圍：0.550µg/ml F.脯氨酸和羥脯氨酸與茚三酮直接生成黃色物質（不釋放NH3）2. 與甲醛的反應：氨基酸的甲醛滴定法A.為- NH2的反應B.在常溫，中性條件，甲醛與- NH2很快反應，生成羥甲基衍生物，釋放氫離子。應用：氨基酸定量分

12、析-氨基酸的甲醛滴定法（間接滴定）A.直接滴定，終點pH過高（12），沒有適當指示劑。B.與甲醛反應，滴定終點在9左右，可用酚酞作指示劑。C.釋放一個氫離子，相當于一個氨基（摩爾比1：1）簡單快速，一般用于測定蛋白質的水解或合成的速度.3. 與2,4-二硝基氟苯(DNFB)的反應：A.為- NH2的反應B.氨基酸- NH2的一個H原子，在弱堿性條件下，與DNFB發(fā)生芳環(huán)取代，生成黃色的2,4二硝基苯基氨基酸（DNP氨基酸，穩(wěn)定）應用：鑒定多肽或蛋白質的N-末端氨基酸此反應首先由Sanger應用測定蛋白質中氨基酸的排序，確定了胰島素的一級結構5二甲氨基萘磺酰氯（DNSCl，又稱丹磺酰氯）可以代替

13、DNFB試劑測定蛋白質的N端氨基酸，靈敏度高。4. 與異硫氰酸苯酯（PITC）的反應：重復測定多肽鏈N端氨基酸排列順序，設計出“多肽順序自動分析儀”在弱堿性條件下，氨基酸中的氨基與異硫氰酸苯酯（PITC）反應，生成相應的苯氨基硫甲酰氨基酸（PTC氨基酸）反應特點及應用：為- NH2的反應由Edman于1950年首先提出用于N末端分析，又稱Edman降解法,此法的特點是能夠不斷重復循環(huán)，將肽鏈N-端氨基酸殘基逐一進行標記和解離。5. 與亞硝酸的反應：在標準條件下測定生成氮氣的體積，可計算氨基酸的量，稱為范斯萊克法。 6. 與熒光胺的反應：氨基酸與熒光胺反應生成具有熒光的產(chǎn)物，是- NH2的反應用

14、于氨基酸定量分析根據(jù)熒光強度測定氨基酸含量（ng級）激發(fā)波長x=390nm，發(fā)射波長m=475nm。靈敏度高。7. 與5,5-雙硫基-雙（2-)硝基苯甲酸反應：-SH的反應,測定樣品中游離- SH的含量2.3 肽2.3.1肽的結構1.一個氨基酸的-羧基和另一個氨基酸的-氨基脫水縮合而成的化合物稱為肽。氨基酸之間脫水后形成的鍵稱肽鍵（酰胺鍵）2.多肽（鏈）：多個氨基酸殘基之間以肽鍵連接起來的鏈狀化合物叫多肽或多肽鏈。3.氨基酸殘基：肽鏈中的每個氨基酸單位在形成肽鏈時，釋放一分子水，因此被稱為一個氨基酸“殘基”。4.多肽鏈有方向性：N 末端：多肽鏈中有自由氨基的一端；C 末端：多肽鏈中有自由羧基的

15、一端。 書寫時規(guī)定將N端放在左邊，C端放在右邊；命名時，從N端開始，除C端氨基酸外其他氨基酸殘基的名稱均將“酸”改為“?！薄?.肽鍵的特點：肽鍵平面由于肽鍵具有部分雙鍵的性質，使參與肽鍵構成的六個原子被束縛在同一平面上，這一平面稱為肽鍵平面或肽單元。6.2.3.2生物活性肽的功能生物活性肽（biological active peptide,BAP）是能夠調節(jié)生物機體的生命活動或具有某些生理活性的寡肽和多肽的總稱。1.谷光甘肽（GSH）分子中具有一個由谷氨酸的-羧基和半胱氨酸的-氨基脫水縮合的-肽鍵。谷胱甘肽的作用：含有自由的巰基，具有很強的還原性，可作為體內重要的還原劑，保護某些蛋白質或酶分

16、子中的巰基免遭氧化，使其處于活性狀態(tài)。2.催產(chǎn)素和升壓素3. 促腎上腺皮質激素（ACTH）39肽，活性部位為第410位的7肽片段：Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly。4. 腦肽腦啡肽具有強烈的鎮(zhèn)痛作用（強于嗎啡），不上癮。Met-腦啡肽 Tyr-Gly-Gly-Phe-MetLeu-腦啡肽 Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-內啡肽（31肽）具有較強的嗎啡樣活性與鎮(zhèn)痛作用。5.胰高血糖素由胰島-細胞分泌（-細胞分泌胰島素），29肽。胰高血糖素調節(jié) 維持血糖濃度。6.胃腸道活性肽2.4蛋白質的結構蛋白質是氨基酸以肽鍵相互連接的線性序列,在蛋白質中，多肽鏈折疊形成特殊的形狀

17、（構象,conformation）。在結構中，這種構象是原子的三維排列，由氨基酸序列決定。2.4.1蛋白質的一級結構（化學結構）1.蛋白質的一級結構指蛋白質多肽鏈中AA的序列，也包括二硫鍵的位置。2.在基因編碼的蛋白質中，這種序列是由mRNA中的核苷酸序列決定的。3.一級結構中包含的共價鍵：主要指肽鍵（peptide bond）和二硫鍵（disulfide bond）2.4.2 蛋白質的空間結構（構象、高級結構）1. 構象是蛋白質分子中所有原子在三維空間的排列分布和肽鏈的走向。2. 研究蛋白質構象的方法：X射線衍射法：研究溶液中蛋白質構象的光譜方法：紫外差光譜，熒光和熒光偏振，圓二色性，核磁共

18、振（NMR）3. 穩(wěn)定蛋白質空間結構的作用力：4. 蛋白質的二級結構：蛋白質分子中某一段肽鏈的局部空間結構，即該段肽鏈主鏈骨架原子的相對空間位置，并不涉及氨基酸殘基側鏈的構象 。主要的化學鍵：氫鍵蛋白質二級結構的主要形式：-螺旋 (-helix )，-折疊 (-pleated sheet )，-轉角 (-turn )，無規(guī)卷曲 ( random coil ) -螺旋 (-helix ) Pauling和Corey于1951年提出是多肽鏈的主鏈原子沿一中心軸盤繞所形成的有規(guī)律的螺旋構象*要點：單鏈，右旋，一圈3.6殘基，上升0.54nm維系力：氫鍵，且全部平行，R基指向外側*結構特征：螺旋的每圈

19、有3.6個氨基酸殘基，每個氨基酸殘基的高度為0.15nm，螺旋間距離為0.54nm，每個殘基沿軸旋轉100°，螺旋直徑0.6nm。每個肽鍵的羰基氧與遠在第四個氨基酸氨基上的氫形成氫鍵，氫鍵的走向平行于螺旋軸，所有肽鍵都能參與鏈內氫鍵的形成。C(NHCCO)3 NOHHR*結構的特點：3.613螺旋(ns)此外還有： 310， 4.416R側鏈基團伸向螺旋的外側。絕大多數(shù)天然蛋白質中的-螺旋幾乎都是右手螺旋*影響-螺旋形成的因素：在多肽鏈中連續(xù)的出現(xiàn)帶同種電荷的極性氨基酸，-螺旋就不穩(wěn)定。（Lys、Glu）在多肽鏈中只要出現(xiàn)pro，-螺旋就被中斷，產(chǎn)生一個彎曲（bend）或結節(jié)。Gly

20、的R基太小，難以形成-螺旋所需的兩面角，所以和Pro一樣也是螺旋的最大破壞者。肽鏈中連續(xù)出現(xiàn)帶龐大側鏈的氨基酸如Ile，由于空間位阻，也難以形成-螺旋。-折疊結構（-pleated sheet）-折疊或-折疊片，也稱-結構或-構象。-折疊是由兩條或多條幾乎完全伸展的多肽鏈平行排列，通過鏈間的氫鍵進行交聯(lián)而形成的，或一條肽鏈內的不同肽段間靠氫鍵而形成的。肽鏈的主鏈呈鋸齒狀折疊構象。-折疊結構幾乎所有肽鍵都參與鏈間氫鍵的形成，氫鍵與鏈的長軸接近垂直。氨基酸側鏈伸展在折疊片的上面和下面。-折疊有兩種類型：一種為平行式，另一種為反平行式平行式：N端在同一端。氨基酸殘基的長度0.325nm反平行式：N端

21、不在同一端。氨基酸殘基的長度0.347nm絲心蛋白的構象：絲心蛋白的性能：絲心蛋白具有抗張強度高，質地柔軟的特性。具有0.7nm的周期。絲心蛋白(fibroin)是蠶絲和蜘蛛絲的一種蛋白質。構象：絲心蛋白是典型的反平行折疊片，多肽鏈取鋸齒狀折疊構象。側鏈交替地分布在折疊片的兩側。反平行折疊片以平行的方式堆積成多層結構。鏈間主要氫鍵連接，層間主要靠范德華力維系。-轉角（-turn）肽鏈回折180度,在-轉角部分，由四個氨基酸殘基組成;(常見氨基酸：Pro,Gly)以主鏈間氫鍵維持穩(wěn)定。彎曲處的第一個氨基酸殘基的-C=O 和第四個殘基的N-H 之間形成氫鍵，形成一個不很穩(wěn)定的環(huán)狀結構。這類結構主要

22、存在于球狀蛋白分子中。凸起（-bugle）在某些反平行的片層中，有一股折疊中有一個殘基的肽鍵沒有參與和相鄰的折疊間的氫鍵，致使這一部位有所凸起，這一現(xiàn)象被稱為凸起是一種小片的非重復性結構，能單獨存在，但大多數(shù)經(jīng)常作為反平行折疊片中的一種不規(guī)則情況而存在。凸起可認為是折疊股中額外插入的一個殘基，它使得在兩個正常氫鍵之間、在凸起折疊股上是兩個殘基，而另一側的正常股上是一個殘基。無規(guī)卷曲或自由回轉(random coil)指無規(guī)律的松散肽鏈結構在一般球蛋白分子中，往往含有大量的無規(guī)則卷曲，它使蛋白質肽鏈從整體上形成球狀構象。沒有一定規(guī)律的松散肽鏈結構。常常是酶的活性部位。5.超二級結構和結構域超二級

23、結構(super-secondary structures) :是指若干相鄰的二級結構中的構象單元彼此相互作用，形成有規(guī)則的，在空間上能辨認的二級結構組合體。是蛋白質二級結構至三級結構層次的一種過渡態(tài)構象層次。超二級結構的基本類型：，模體：在許多蛋白質分子中，可發(fā)現(xiàn)二個或三個具有二級結構的肽段，在空間上相互接近，形成一個特殊的空間構象，被稱為模體(motif)。結構域：是球狀蛋白質的折疊單位。多肽鏈在超二級結構的基礎上進一步繞曲折疊成緊密的近似球形的結構，具有部分生物功能。對于較大的蛋白質分子或亞基，多肽鏈往往由兩個以上結構域締合而成三級結構。類型： -螺旋域；-折疊域；+域； /域；無規(guī)則卷

24、曲+-回折域；無規(guī)則卷曲+ -螺旋結構域等6. 蛋白質的三級結構多肽鏈在二級結構、超二級結構和結構域的基礎上，主鏈構象和側鏈構象相互作用，沿三維空間多方向卷曲，進一步盤曲折疊形成特定的球狀分子結構。是多肽鏈上的所有原子（包括主鏈和側鏈）在三維空間的分布。主要的化學鍵：疏水鍵、離子鍵、氫鍵和 Van der Waals力等。三級結構的特征：含多種二級結構單元，如螺旋、折疊等；有明顯的折疊層次；是緊密的球狀或橢球狀實體；分子表面有一空穴(活性部位)；疏水側鏈埋藏在分子內部，親水側鏈暴露在分子表面。主要由疏水作用力維持實例：肌紅蛋白肌紅蛋白的結構與功能：功能：哺乳動物肌肉中儲存氧并運輸氧的蛋白。肌紅

25、蛋白的結構特點：a. 一條多肽鏈，153個氨基酸殘基，一個血紅素輔基，分子量17800道爾頓。b. 肌紅蛋白的整個分子具有外圓中空的不對稱結構，肽鏈共折疊成8段長度不等的-螺旋體（A-H），最長的有23個氨基酸殘基，最短的有7個氨基酸殘基。拐彎處多由Pro、Ser、Ile、Thr等組成。c.具有極性側鏈的氨基酸殘基分布于分子表面，而帶非極性側鏈的氨基酸殘基多分布于分子內部，使肌紅蛋白成為可溶性蛋白。輔基血紅素：Fe原子被稱為原卟啉IX（9）的有機分子固定的，共稱血紅素（Heme），使血液呈紅色。Fe有六個配位鍵，其中四個與卟啉的吡咯環(huán)的N原子相連。Fe2+稱亞鐵血紅素，F(xiàn)e3+為高鐵血紅素，只

26、有Fe2+的蛋白才能結合氧。7. 蛋白質的四級結構：四級結構是指由兩個或兩個以上具有三級結構的多肽鏈按一定方式聚合而成的特定構象的蛋白質分子。其中每條多肽鏈稱為亞基(subunit)。通常亞基只有一條多肽鏈，但有的亞基由兩條或多條多肽鏈組成，亞基單獨存在時無生物學活性。當亞基聚合成為具有完整四級結構的蛋白質后，才有功能。亞基之間的結合力主要是疏水作用，其次是氫鍵和離子鍵。一般來說具有四級結構的蛋白屬于寡聚蛋白。例如：血紅蛋白。四級締合在結構和功能上的優(yōu)越性：a.降低比表面積，增加蛋白質的穩(wěn)定性。b.豐富蛋白質的結構，以行使更復雜的功能。c.提高基因編碼的效率和經(jīng)濟性。d.使酶的催化基團匯集，提

27、高催化效率。e.形成一定的幾何形狀，如細菌鞭毛。f.適當降低溶液滲透壓。g.具有協(xié)同效應和別構效應，實現(xiàn)對酶活性的調節(jié)?？偨Y：蛋白質的一級結構是它的氨基酸序列蛋白質的二級結構是由氫鍵導致的肽鏈卷曲與折疊蛋白質的三級結構是多肽鏈自然形成的三維結構蛋白質的四級結構是亞基的空間排列一個天然蛋白質在一定條件下，往往只有一種或很少幾種構象。用一個蛋白質中各個原子范德華體積的總和，除以蛋白質所占體積即得裝配密度，一般0.730.77由兩條或兩條以上的肽鏈組成，亞基的種類和數(shù)目都不一定相同。2.5 蛋白質結構與功能的關系蛋白質分子具有多樣的生物學功能，需要一定的化學結構，還需要一定的空間構象。2.5.1 蛋

28、白質一級結構與功能的關系1.種屬差異：蛋白質一級結構的種屬差異十分明顯，但相同部分氨基酸對蛋白質的功能起決定作用。根據(jù)蛋白質結構上的差異，可以斷定它們在親緣關系上的遠近。舉例胰島素，細胞色素C一級結構相似的多肽或蛋白質，其空間構象以及功能也相似。 2.分子?。悍肿硬〉母拍睿河捎谶z傳基因的突變導致蛋白質分子結構的改變或某種蛋白質缺乏引起的疾病。例如：鐮刀性貧血病結論：蛋白質的一級結構決定它的空間結構，而特定的空間結構是蛋白質具有生物活性的保證。2.5.2蛋白質構象與功能的關系1.別構效應：又稱變構效應，是指寡聚蛋白與配基結合，改變蛋白質構象，導致蛋白質生物活性改變的現(xiàn)象。例：血紅蛋白的別構效應2

29、. 蛋白質構象改變與疾?。旱鞍踪|構象疾?。喝舻鞍踪|的折疊發(fā)生錯誤，盡管其一級結構不變，但蛋白質的構象發(fā)生改變，仍可影響其功能，嚴重時可導致疾病發(fā)生。蛋白質構象改變導致疾病的機理：有些蛋白質錯誤折疊后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉樣纖維沉淀，產(chǎn)生毒性而致病，表現(xiàn)為蛋白質淀粉樣纖維沉淀的病理改變。這類疾病包括：人紋狀體脊髓變性病、老年癡呆癥、亨停頓舞蹈病、瘋牛病等。2.6 蛋白質的性質與分離、分析技術2.6.1 蛋白質的性質1. 蛋白質相對分子量：在10 0001 000 000之間。測定分子量的主要方法有滲透壓法、超離心法、凝膠過濾法、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。2. 蛋白質的兩性電離及等電點：蛋

30、白質的等電點( isoelectric point, pI)調節(jié)溶液的pH，使蛋白質所帶的正、負電荷相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，在電場中既不向陽極移動，也不向陰極移動，此時溶液的pH稱為蛋白質的等電點。3. 蛋白質的變性(denaturation)：概念：在某些物理和化學因素作用下，其特定的空間構象被破壞，也即有序的空間結構變成無序的空間結構，從而導致其理化性質改變和生物活性的喪失。變性的本質：破壞非共價鍵和二硫鍵，不改變蛋白質的一級結構。造成變性的因素：如加熱、乙醇等有機溶劑、強酸、強堿、重金屬離子及生物堿試劑等 。 復性(renaturation)：若蛋白質變性程度較輕，去除變性因素

31、后，蛋白質仍可恢復或部分恢復其原有的構象和功能，稱為復性。變性蛋白質的特點：失去生物活性 ，溶解度減小，粘度加大，結晶能力減弱，容易被酶水解消化。變性的分類：a.可逆變性：例如，把經(jīng)過短時間煮沸的胰蛋白酶冷卻，可以恢復天然胰蛋白酶的性質(如結晶性、活性等)。b.不可逆變性：例如，煮熟的雞蛋變性應用：變性在醫(yī)學上有很重要意義。臨床上常用高溫、紫外線、酒精等物理或化學方法使細菌或病毒的蛋白質變性而失去致病及繁殖能力。在實踐中，也有許多為提高某些生物制品的活性，要防止蛋白質的變性，如制取抗血清、疫苗等。4. 蛋白質的凝固作用(protein coagulation)：蛋白質變性后的絮狀物加熱可變成比

32、較堅固的凝塊，此凝塊不易再溶于強酸和強堿中。5. 蛋白質的膠體性質：蛋白質分子的顆粒直徑已達1100nm，處于膠體顆粒的范圍。布朗運動、丁道爾現(xiàn)象、電泳現(xiàn)象，不能透過半透膜，具有吸附能力蛋白質溶液穩(wěn)定的原因：表面形成水膜（水化層）；帶相同電荷。透析：由于蛋白質分子體積很大,不能透過半透膜,而小分子物質能透過半透膜,這樣可把蛋白質分子與小分子物質分開,這個過程叫透析.6. 蛋白質的沉淀反應：中性鹽沉淀反應 ：加鹽使蛋白質沉淀析出-鹽析 稀鹽可使蛋白質表面同性電荷增加，增加蛋白質分子間的排斥, 同時與水分子間的作用增強,而增加溶解性鹽溶作用；高鹽破壞水膜、中和電荷, 蛋白質聚集沉淀鹽析, 不同蛋白

33、質鹽析的鹽濃度不同, 故用不同鹽濃度分級沉淀蛋白質, 分離的蛋白質不變性。分段鹽析：調節(jié)鹽濃度，可使混合蛋白質溶液中的幾種蛋白質分段析出。如：血清球蛋白（50%(NH4)2SO4飽和度），清蛋白（飽和(NH4)2SO4)。有機溶劑沉淀反應：用與水互溶的乙醇、丙酮等奪取水膜, 等電點時加入更易沉淀, 不同蛋白質所需溶劑濃度不同-分級沉淀, 但易引起變性，與有機溶劑濃度、作用時間和沉淀溫度有關條件：低溫（04。C），PH=PI重金屬鹽沉淀反應： 蛋白質在pHpI時為負離子, 可與Cu2+/Hg2+/ Ag+/Pb2+等結合為不溶性蛋白鹽而沉淀加某些酸類的沉淀反應：蛋白質在pH<pI時帶正電荷

34、, 可與苦味酸 、磷鎢酸、鞣酸、三氯醋酸、磺基水楊酸等結合沉淀?？辔端?、鉬酸、鎢酸、三氯乙酸、單寧酸、能沉淀生物堿，稱生物堿試劑。可逆沉淀(1)在溫和條件下，通過改變溶液的pH或電荷狀況，使蛋白質從膠體溶液中沉淀分離。(2) 在沉淀過程中，結構和性質都沒有發(fā)生變化，在適當?shù)臈l件下，可以重新溶解形成溶液，所以這種沉淀又稱為非變性沉淀。(3)可逆沉淀是分離和純化蛋白質的基本方法，如等電點沉淀法、鹽析法和有機溶劑沉淀法等。不可逆沉淀(1)在強烈沉淀條件下，不僅破壞了蛋白質膠體溶液的穩(wěn)定性，而且也破壞了蛋白質的結構和性質，產(chǎn)生的蛋白質沉淀不可能再重新溶解于水。(2)由于沉淀過程發(fā)生了蛋白質的結構和性質

35、的變化，所以又稱為變性沉淀。(3)如加熱沉淀、強酸、堿沉淀、重金屬鹽沉淀和生物堿沉淀等都屬于不可逆沉淀。8. 蛋白質含量的測定：考馬斯亮藍G-250法，紫外吸收法，凱氏定氮法，其它方法。9. 蛋白質的紫外吸收：由于蛋白質分子中含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波長處有特征性吸收峰。蛋白質的OD280與其濃度呈正比關系，因此可作蛋白質定量測定。2.6.2蛋白質的分離和分析技術1.根據(jù)蛋白質溶解度不同進行分離鹽析(salt precipitation)是將硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋白質溶液，使蛋白質表面電荷被中和以及水化膜被破壞，導致蛋白質沉淀。使用丙酮沉淀時，必須在04低溫下進行

36、，丙酮用量一般10倍于蛋白質溶液體積。蛋白質被丙酮沉淀后，應立即分離。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。2. 根據(jù)蛋白質分子大小進行分離透析及超濾法：a.透析(dialysis):利用透析袋把大分子蛋白質與小分子化合物分開的方法。b.超濾法:應用正壓或離心力使蛋白質溶液透過有一定截留分子量的超濾膜，達到濃縮蛋白質溶液的目的。層析法凝膠過濾(gel filtration)又稱分子篩層析，利用各蛋白質分子大小不同分離。離子交換層析：利用各蛋白質的電荷量及性質不同進行分離。3. 根據(jù)蛋白質帶電性質進行分離蛋白質在高于或低于其pI的溶液中為帶電的顆粒，在電場中能向正極或負極移動。這種通過蛋白質在電場中泳動

37、而達到分離各種蛋白質的技術, 稱為電泳(elctrophoresis) 。根據(jù)支撐物的不同，可分為薄膜電泳、凝膠電泳等。 *SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，常用于蛋白質分子量的測定。*等電聚焦電泳，通過蛋白質等電點的差異而分離蛋白質的電泳方法。*雙向凝膠電泳是蛋白質組學研究的重要技術。4. 根據(jù)配體特異性進行分離親和層析法:親和層析利用待分離物質和它的特異性配體間具有特異的親和力，從而達到分離的目的。2.6.3蛋白質分子中氨基酸序列的測定1.測定蛋白質分子中氨基酸序列的測定要求：a、樣品必須是均一的，純度應在97%以上；b、知道蛋白質的分子質量，其誤差允許在10%左右。2.基本原理：(1)測定末端氨基酸數(shù)目，確定蛋白質分子是由幾條肽鏈構成的；(2)拆分蛋白質分子的多肽鏈，斷開多肽鏈內二硫鍵并分離出每條肽鏈。(3)將肽鏈完全水解，測定每條多肽鏈的氨基酸組成(4