蛋白質(zhì)色譜分離方法(共6頁(yè))

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上蛋白質(zhì)色譜分離方法摘要 蛋白質(zhì)是生命有機(jī)體的主要成分，在生命體生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)階段都起著重要作用。所以分離和檢測(cè)蛋白質(zhì)一直是人們研究的熱點(diǎn)。依據(jù)蛋白質(zhì)的物理、化學(xué)及生物學(xué)特性，已有多種分離手段，如：超濾法、SDS-PAGE、親和層析等，其中，液相色譜分離技術(shù)由于具有重復(fù)性好、分辨率高等優(yōu)勢(shì)在蛋白質(zhì)分離檢測(cè)中得到了廣泛的應(yīng)用。關(guān)鍵詞 高效液相色譜 高效離子交換色譜 反相高效液相色譜 高效凝膠過(guò)濾色譜 高效親和色譜一、引言 蛋白質(zhì)在組織或細(xì)胞中一般都是以復(fù)雜的混合物形式存在，每種類型的細(xì)胞都含有成千種不同的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的分離和提純工作是一項(xiàng)艱巨而繁重的任務(wù)，到目前為止，還

2、沒(méi)有一個(gè)單獨(dú)的或一套現(xiàn)成的方法能把任何一種蛋白質(zhì)完全的從復(fù)雜的混合物中提取出來(lái)，但對(duì)任何一種蛋白質(zhì)都有可能選擇一套適當(dāng)?shù)姆蛛x提純程序來(lái)獲取高純度的制品。 1、蛋白質(zhì)純化的總戰(zhàn)略考慮 蛋白質(zhì)回收要采用簡(jiǎn)便易行的方法盡可能多地將目標(biāo)蛋白從細(xì)胞培養(yǎng)上清液、細(xì)菌破碎液或組織勻漿中提取出來(lái)，收率至少達(dá)到90%以上。然后進(jìn)一步作精純化，這第一步要求去掉大部分雜蛋白，同時(shí)要使樣品的體積得到充分濃縮，一般要求要濃縮幾十到幾百倍，粗提液的體積大大縮小，便于下一步精純化。而 且每一步都要做電泳判斷純化效果。 2、蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)的選擇 要盡可能多地了解目標(biāo)蛋白的結(jié)構(gòu)、氨基酸組成、氨基酸序列，以及蛋白質(zhì) 的空間結(jié)

3、構(gòu)所決定的物理、化學(xué)、生物化學(xué)和物理化學(xué)性質(zhì)等信息，根據(jù)不同蛋白質(zhì)之間的性質(zhì)差異或者改變條件使之具有差異，利用一種或多種性質(zhì)差異，在兼顧收率和純度的情況下，選擇最佳的蛋白質(zhì)提純方法。二、色譜技術(shù)簡(jiǎn)介 1、色譜分離技術(shù)基本概念 色譜分離技術(shù)又稱層析分離技術(shù)或色層分離技術(shù)，是一種分離復(fù)雜混合物中各個(gè)組分的有效方法。它是利用不同物質(zhì)在由固定相和流動(dòng)相構(gòu)成的體系中具有不同的分配系數(shù)，當(dāng)兩相作相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)，這些物質(zhì)隨流動(dòng)相一起運(yùn)動(dòng)，并在兩相間進(jìn)行反復(fù)多次的分配，從而使各物質(zhì)達(dá)到分離。當(dāng)流動(dòng)相中攜帶的混合物流經(jīng)固定相時(shí)，其與固定相發(fā)生相互作用。由于混合物中各組分在性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上的差異，與固定相之間產(chǎn)生的作用力

4、的大小、強(qiáng)弱不同，隨著流動(dòng)相的移動(dòng)，混合物在兩相間經(jīng)過(guò)反復(fù)多次的分配平衡，使得各組分被固定相保留的時(shí)間不同，從而按一定次序由固定相中流出。與適當(dāng)?shù)闹髾z測(cè)方法結(jié)合，實(shí)現(xiàn)混合物中各組分的分離與檢測(cè)。 2、色譜分離技術(shù)的起源 俄國(guó)植物學(xué)家茨維特（Tswett ） 在1903年3月21日華沙舉行的“自然科學(xué)學(xué)會(huì)生物學(xué)分會(huì)會(huì)議”上，發(fā)表了題為“On a New Categeory of Adsorption Phenomena and Their Appilcation to Biochemical Analysis”的文章，提出了應(yīng)用吸附原理分離植物色素的新方法。1907年，茨維特在德國(guó)生物學(xué)會(huì)議上

5、第一次向人們公開(kāi)展示了采用色譜法提純的植物色素溶液及其色譜圖顯現(xiàn)著彩色環(huán)帶的柱管。他為了分離植物色素，將植物綠葉的石油醚提取液倒入裝有碳酸鈣粉末的玻璃管中，并用石油醚自上而下淋洗，由于不同的色素在碳酸鈣顆粒表面的吸附力不同，隨著淋洗的進(jìn)行，不同色素向下移動(dòng)的速度不同，形成一圈圈不同顏色的色帶，使各色素成分得到了分離。他將這種分離方法命名為色譜法（chromatography）。3、蛋白質(zhì)色譜分離技術(shù)及其進(jìn)展 隨著現(xiàn)代科技的飛速發(fā)展，從天然產(chǎn)物中分離分析蛋白質(zhì)的手段也不斷得到提高，并出現(xiàn)一些新方法，多肽提取分離常用的方法包括化學(xué)萃取法（如醇提、丙酮法）、酶解法、沉淀法、超濾法、逆流分溶法、層析法

6、、電泳法等。蛋白質(zhì)的分離純化則離不開(kāi)色譜分離技術(shù)，色譜技術(shù)包括氣相色譜、液相色譜、紙色譜（紙層析）、薄層色譜（薄層層析）等。對(duì)于蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，蛋白質(zhì)分離只能用液相色譜。液相色譜是指流動(dòng)相為液體（也稱為淋洗液），而按固定相的不同又可分為液固色譜和液液色譜。高效液相色譜（HPLC）是生物技術(shù)中分離純化的重要方法，在多肽、蛋白質(zhì)的分離純化工藝中顯示出優(yōu)異的性能。RP-HPLC特別適用于質(zhì)量不大的蛋白質(zhì)和多肽物質(zhì)的分離純化，主要用于分子量低于5000，尤其是1000以下的非極性小分子多肽的分析和純化，具有十分高的分辨力。此外，離子色譜作為液相色譜的一種，以特制的離子交換樹(shù)脂為固定相，不同pH值的水溶液為

7、流動(dòng)相。蛋白質(zhì)色譜分離介質(zhì)的選擇則要根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)、疏水性、分子量等性質(zhì)選擇。 目前,用于蛋白質(zhì)混合物的高效分離方法主要有二維電泳和高效液相色譜兩種方法。其中因分離度高并具有直觀圖譜而被普遍采用的方法為二維電泳，即2DE方法。2DE與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)已經(jīng)成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究中一個(gè)較為成熟的技術(shù)平臺(tái)，被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究的各個(gè)方面。但由于該技術(shù)所固有的缺陷：(1)在二維凝膠電泳圖譜上,并不是每個(gè)蛋白點(diǎn)所包含的蛋白量都足以用于鑒定蛋白；(2)對(duì)于低豐度蛋白、疏水性蛋白、極堿性蛋白(pI10)、一些極大蛋白(相對(duì)分子質(zhì)量)和極小蛋白(相對(duì)分子質(zhì)量8000)，二維凝膠電泳還不能夠?qū)⑵浜芎玫仫@示出來(lái)

8、，僅僅只有一些可溶的蛋白被用于研究；(3)費(fèi)時(shí)、費(fèi)力,而且不容易自動(dòng)化，因此近幾年對(duì)該方法進(jìn)行了一些改進(jìn)，如對(duì)電泳前生物樣品進(jìn)行預(yù)濃縮和預(yù)分離、分步提取以及對(duì)凝膠的染色過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化，但都未有實(shí)質(zhì)性的進(jìn)展。為了解決這種方法存在的問(wèn)題，另一種高效分離方法，高效液相色譜方法(HPLC)獲得了愈來(lái)愈多的應(yīng)用，特別是各種模式色譜聯(lián)用組成多維色譜分離技術(shù)逐漸被采用，并與質(zhì)譜聯(lián)用以克服二維凝膠電泳存在的缺陷。常見(jiàn)的有高效離子交換色譜、反相高效液相色譜、高效凝膠過(guò)濾色譜、高效親和色譜、高效疏水色譜等技術(shù)。三、色譜技術(shù)應(yīng)用實(shí)例 色譜法已廣泛用于各個(gè)領(lǐng)域，如石油化工、有機(jī)合成、生理生化、醫(yī)藥衛(wèi)生、環(huán)境保護(hù)以及空間

9、探索，是多組分混合物首選的分離分析方法。以中國(guó)藥典2005版為例，一部收載中藥1146個(gè)品種，用薄層色譜進(jìn)行鑒別或含量測(cè)定的有1523項(xiàng)，用高效液相色譜進(jìn)行定量分析的有479種518項(xiàng)，用氣相色譜進(jìn)行檢測(cè)的有47種。二部收載的有1967個(gè)品種，采用高效液相色譜法的品種有848種?，F(xiàn)在色譜法已形成一門專門的科學(xué)。 1、離子交換色譜法分離蛋白質(zhì)( High- performance Ion Exchange Chromatography, HPIEC) 高效離子交換色譜（HPIEC）是根據(jù)蛋白質(zhì)分子在一定pH值和離子強(qiáng)度條件下所帶電荷的差異進(jìn)行分離的方法。由于HPIEC是一個(gè)吸附性的梯度洗脫過(guò)程，

10、所以具有很好的負(fù)載力。近年來(lái)已成為分離檢測(cè)蛋白質(zhì)的重要方法，而選擇聚合物離子交換劑作為離子交換色譜填料，具有穩(wěn)定性好、離子交換容量大、對(duì)蛋白質(zhì)的分離有選擇性等特點(diǎn)。但同時(shí)，由于離子交換樹(shù)脂固定床的床層壓力會(huì)隨著分離過(guò)程的進(jìn)程而不斷加大，需要重新填充，會(huì)造成固定床填充過(guò)程操作麻煩，對(duì)密封性要求較高。不過(guò)，規(guī)?；蛛x純化蛋白質(zhì)過(guò)程，使用這種方法，還是具有一定優(yōu)勢(shì)的。 2、反相高效液相色譜法分離蛋白質(zhì)( Reverse- Phase High - performance Liquid Chromatography, RP-HPLC) 在各種模式的HPLC中，RP-HPLC應(yīng)用最為廣泛，是由非極性固定

11、相和極性流動(dòng)相所組成的液相色譜體系。它與由極性固定相和弱極性流動(dòng)相所組成的液相色譜體系（正相色譜）相反。RP-HPLC的典型的固定相是十八烷基鍵合硅膠，典型的流動(dòng)相是甲醇和乙腈。三氟乙酸(TFA) 作為離子對(duì)試劑,是反相色譜中最常用的添加劑。蛋白質(zhì)分子因其疏水性的不同使其在兩相中的分配不同而得以分離。RP-HPLC是當(dāng)今液相色譜的最主要的分離模式，幾乎可用于所有能溶于極性或弱極性溶劑中的有機(jī)物的分離。近十幾年來(lái)，RP-HPLC以其具有分辨率和回收率高、重復(fù)性好和操作簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)的分離分析。如嚴(yán)作廷等通過(guò) HPLC對(duì)奶牛子宮內(nèi)膜洗脫樣品進(jìn)行分離，純化出一個(gè)新的抗菌肽分子。 3、高效

12、凝膠過(guò)濾色譜法分離蛋白質(zhì)（High Performance Gel FiltrationChromatography,GFC） 凝膠色譜法又叫凝膠色譜技術(shù)，是六十年代初發(fā)展起來(lái)的一種快速而又簡(jiǎn)單的分離分析技術(shù)，由于設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便，不需要有機(jī)溶劑，對(duì)高分子物質(zhì)有很高的分離效果。凝膠過(guò)濾色譜（GFC）一般用于分離水溶性的大分子，如多糖類化合物。凝膠的代表是葡萄糖系列，洗脫溶劑主要是水。相對(duì)于吸附性液相色譜技術(shù)而言,GFC的分辨力和樣品負(fù)載力都很低。但是GFC是一種溫和的技術(shù),所以可用來(lái)平衡柱及分離樣品的緩沖液范圍較廣，范例也不少。GFC還特別適合于蛋白質(zhì)分子量的研究,例如可快速分離出人血清白蛋

13、白HAS的降解產(chǎn)物， 結(jié)合特定的檢測(cè)器即可測(cè)定其單體和二聚體的分子量。4、高效親和色譜法分離蛋白質(zhì)( High- performance Affinity Chromatography ,HPAFC) 親和色譜法是指將相互間具有高度特異親和性的二種物質(zhì)之一作為固定相，利用與固定相不同程度的親和性，使成分與雜質(zhì)分離的色譜法。例如利用酶與基質(zhì)（或抑制劑）、抗原與抗體，激素與受體、外源凝集素與多糖類及核酸的堿基對(duì)等之間的專一的相互作用，使相互作用物質(zhì)之一方與不溶性擔(dān)體形成共價(jià)結(jié)合化合物，用來(lái)作為層析用固定相，將另一方從復(fù)雜的混合物中選擇可逆地截獲，達(dá)到純化的目的。由于疫苗、糖蛋白和抗體等蛋白質(zhì)具有高

14、度的專一性結(jié)合特性，而HPAFC可以從復(fù)雜的混合物中直接分離到目標(biāo)蛋白質(zhì),因此可以使用HPAFC來(lái)分離純化。HPAFC也是蛋白質(zhì)檢測(cè)中最專一的分離技術(shù)。通過(guò)HPAFC可以分離純化酶、抗體、抗原、結(jié)合蛋白、受體蛋白、輔助蛋白等，也可以分離變性蛋白、化學(xué)改性蛋白等，可見(jiàn)HPAFC在蛋白質(zhì)化學(xué)中起著重要作用。如楊祖英等采用高效親和色譜柱（Pharmacia HI- Trap Protein G柱），在 pH值為2.5的鹽酸條件下洗脫IgG進(jìn)行測(cè)定。 5、高效液相色譜法與其他分離方法的聯(lián)用 蛋白多肽的種類很多而且大多具有相似性，使用單一的分離純化手段已經(jīng)不能達(dá)到理想的分離純化效果，HPLC具有不能大規(guī)

15、模制備、費(fèi)時(shí)等缺點(diǎn)，因此與其他分離方法的聯(lián)用具有巨大的優(yōu)點(diǎn)。其中的一個(gè)方法是根據(jù)電荷和疏水性差異,對(duì)蛋白質(zhì)混合物酶解所得的復(fù)雜多肽混合物進(jìn)行離子交換色譜分離后,對(duì)收集的餾分再進(jìn)行反相液相色譜分離,并通過(guò) MS/MS對(duì)多肽進(jìn)行序列分析,最后在計(jì)算機(jī)上利用一種數(shù)學(xué)算法對(duì)所獲得的序列與從基因組翻譯的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比較,確定出多肽所對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)。目前已有的較為成功的范例有高效液相色譜質(zhì)譜(HPLC-MS) 、高效液相色譜毛細(xì)管電泳(HPLC-CE) 、高效液相色譜等速電泳(HPLC-ITP)、高效液相色譜電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜(HPLC-ICP- AES) 。HPLC與其他方法的聯(lián)用，彌補(bǔ)了各自

16、的不足，在蛋白多肽的分離方面有著廣闊的前景。四、前景展望 色譜法分離效率高，選擇性好，在分離純化生物大分子的過(guò)程中是不可缺少的方法。HPLC可將不同的蛋白質(zhì)分離并檢測(cè)，憑借自身獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)在多肽及蛋白質(zhì)的分離分析中越來(lái)越得到人們的認(rèn)可，不但有很高的靈敏度且實(shí)現(xiàn)了分析自動(dòng)化，對(duì)蛋白質(zhì)化學(xué)領(lǐng)域的研究提供了強(qiáng)有力的手段。蛋白質(zhì)的分離純化技術(shù)無(wú)論在分子生物學(xué)領(lǐng)域，還是在生物化學(xué)領(lǐng)域都占有很重要的地位，而單靠一種色譜技術(shù)已經(jīng)不能完全滿足生產(chǎn)和實(shí)驗(yàn)的需要，蛋白質(zhì)的分離純化技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)日益轉(zhuǎn)向多種技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用。還有近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的分離純化蛋白質(zhì)的新色譜技術(shù)，如蛋白質(zhì)色譜、Nano-LC等，都會(huì)在蛋白質(zhì)分離

17、純化中發(fā)揮重要作用。因此，利用色譜法分離檢測(cè)蛋白質(zhì)的研究還將繼續(xù)，以推動(dòng)蛋白質(zhì)化學(xué)的研究。參考文獻(xiàn)盧佩章, 戴朝政, 色譜理論基礎(chǔ), 科學(xué)出版社 1989.韓香，顧軍高效液相色譜法在合成多肽分離與純化中的應(yīng)用J.天津藥學(xué)，2003，15（16）：42-44.SANZ-NEBOT V，BENAVENTEF，TORO I，et alOptimization of HPLC conditions for the separation of complex crude mixtures produced in the synthesis of therapeutic peptide hormonesJ.Chromatographia，2001，53（1）：167-173.Lilley K S, Razzaq A, Dupree P . Current Opinion Chem acl Biology , 2002 , 6(1) : 46.嚴(yán)作廷，米寶明，宗瑞謙，等.奶牛子宮內(nèi)膜黏液抗菌肽的分離純化J.中國(guó)奶牛，2010（7）：6