粗蛋白影響因素

1、1粗蛋白的測(cè)定：試劑的配制粗蛋白測(cè)定中所用的化學(xué)藥品如濃硫酸、鹽酸、氫氧化鈉、硼酸、硫酸銅、硫酸 鉀（硫酸鈉）、硫酸錢(qián)、蔗糖等均為化學(xué)純?cè)噭?，?biāo)定鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液用的無(wú)水碳 酸鈉為基準(zhǔn)試劑。在配制試劑前一定要用 pH試紙或酸度計(jì)檢測(cè)一下蒸儲(chǔ)水是 否為中性，所用的燒杯、試劑瓶等配液設(shè)備清洗干凈。1.1 鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制配制的鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液盡量為低濃度，一般C（HCl）=0.020.05mol ? L -1。低濃度雖然用量大，但可減少操作誤差和讀數(shù)誤差。配制鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液一定要嚴(yán)格 按照標(biāo)準(zhǔn)操作進(jìn)行，基準(zhǔn)無(wú)水碳酸鈉已定于 270300c灼燒至恒重，稱(chēng)準(zhǔn)至 0.0001g,做46個(gè)平行樣，去掉最高值和最低

2、值后取平均值，同時(shí)還要做 空白試驗(yàn)。鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制量盡量不要太多、使用時(shí)間太長(zhǎng)，防止水分蒸發(fā)和鹽酸揮發(fā)而影響其濃度的準(zhǔn)確性。1.2 其他試劑的配制400g ? L -1氫氧化鈉溶液、20g ? L -1硼酸溶液、混合指示劑（1g ?L -1甲基 紅乙醇溶液與5g ? L -1澳甲酚綠乙醇溶液等體積混合）等主要是在稱(chēng)量時(shí)要 做到快、準(zhǔn)、穩(wěn)，再就是防止使用時(shí)間太長(zhǎng)，特別是混合指示劑不要超過(guò)3個(gè)月。2粗蛋白的測(cè)定：試樣的選取和制備2.1 采樣飼料原料及產(chǎn)品的容積和質(zhì)量往往很大， 因此所采集的樣品必須具有代表性，否 則，即使一系列的分析工作非常精密、準(zhǔn)確，其意義都不大，有時(shí)甚至?xí)贸鲥e(cuò) 誤的結(jié)論，

3、所以應(yīng)采用正確的采樣方法。采樣應(yīng)從具不同代表性的區(qū)域取幾個(gè)樣 點(diǎn)，然后充分混合為整個(gè)飼料的代表樣品， 然后再?gòu)闹蟹殖鲆恍〔糠肿鳛榉治鰳?品。在采樣過(guò)程中應(yīng)做到隨即、客觀(guān)，避免受人為和主觀(guān)因素的影響。還有一點(diǎn) 應(yīng)該注意，就是所采集的樣品必須具有一定數(shù)量。 其采集數(shù)量的多少應(yīng)視飼料原 料和產(chǎn)品水分含量、顆粒大小、均勻程度以及平行樣的數(shù)量而酌情定奪。2.2 分樣所采集的樣品往往較多，而檢測(cè)時(shí)所用試樣往往較少，因此要對(duì)所采集的樣品進(jìn) 行縮分。在多數(shù)飼料公司以及檢測(cè)機(jī)構(gòu)中一般采用方便簡(jiǎn)單的四分法。 有條件的 單位可采用分樣器進(jìn)行分樣。2.3 粉樣 飼料的樣品一般為顆粒狀，所以要對(duì)所分得的試樣進(jìn)行粉碎。粉

4、碎所用的設(shè)備一 般為咖啡磨或植物樣本粉碎機(jī)，試樣粉碎后一般過(guò) 40目篩，且一定要把粉碎后 的試樣及粉碎機(jī)中殘留的部分清掃后充分混合均勻，避免粉碎的試樣分級(jí)而影響 分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。對(duì)于一些不易粉碎的粗飼料如秸稈渣等在粉碎機(jī)中會(huì)剩留極 少難以通過(guò)篩孔，這部分一定不要丟掉，應(yīng)盡力弄碎后一并均勻混入樣品中， 避 免引起分析誤差。2.4 稱(chēng)樣試樣的用量標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定為0.51g ,為保證分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，在分析過(guò)程中 應(yīng)根據(jù)試樣蛋白質(zhì)含量的高低來(lái)決定所稱(chēng)試樣的重量，如濃縮料、魚(yú)粉、玉米蛋白粉、豆粕等高蛋白的試樣可控制在 0.51g之間，玉米、秸稈、苜蓿等低蛋 白、粗飼料試樣可適當(dāng)增加到23g左右，以增加測(cè)

5、定結(jié)果的準(zhǔn)確性。還應(yīng)注 意一點(diǎn)，在稱(chēng)量時(shí)盡量用電子分析天平，準(zhǔn)確到 0.0001g且無(wú)損地放入凱氏燒 瓶或者消化管中。3粗蛋白的測(cè)定：消化3.1 催化劑及其用量在環(huán)境污染小、價(jià)格便宜、催化效果好的前提下，目前催化劑多為硫酸銅和無(wú)水 硫酸鉀（或無(wú)水硫酸鈉）。其添加量不同公司差異較大，其中硫酸銅：無(wú)水硫酸 鉀（或無(wú)水硫酸鈉）主要有1 ： 9、1 ： 10、1 ： 15和1 ： 17等，國(guó)標(biāo)為0.4g硫 酸銅和6g無(wú)水硫酸鉀（或無(wú)水硫酸鈉），比例為1 ： 12。若添加量加大，消化液 易結(jié)塊不易轉(zhuǎn)移；添加量減少，消化時(shí)間加長(zhǎng)或者消化不完全。 建議大家按國(guó)標(biāo) 執(zhí)行為好。亦可根據(jù)自己的經(jīng)驗(yàn)以及試樣的多少、

6、消化的難易程度、蛋白含量的多少自行調(diào)整。3.2 硫酸的用量 濃硫酸的用量應(yīng)視試樣的重量、含水量及其所含蛋白高低而適當(dāng)調(diào)整。 對(duì)于體積 大重量輕的粗飼料、高蛋白飼料或者含水量較高的試樣、 淀粉含量多的精料，應(yīng) 適當(dāng)加大濃硫酸的用量，多為15mL左右。這是由于此類(lèi)樣品，濃硫酸在對(duì)其脫 水和碳化是消耗量加大，當(dāng)加入的濃硫酸量不足或者剛剛夠試樣脫水和碳化時(shí)就 會(huì)出現(xiàn)燒干現(xiàn)象。反之則需加入10mL左右。若通風(fēng)柜的排風(fēng)量較大時(shí)應(yīng)適當(dāng)多 加濃硫酸2mL左右，以防止?jié)饬蛩岬恼舭l(fā)而使其濃度降低，試樣消化不完全從 而導(dǎo)致所測(cè)得的數(shù)值偏低。3.3 消化溫度剛開(kāi)始時(shí)以低溫（200300C ）加熱，待試樣焦化泡沫消失后

7、，逐步緩慢提高 溫度（360410c ）。起初低溫加熱是為防止試樣起泡沫，而溢出燒瓶外或碳化 后的顆粒粘附于燒瓶壁，導(dǎo)致消化不完全，所測(cè)結(jié)果偏低。對(duì)于富含脂肪或者在 消化過(guò)程中易發(fā)泡的樣品，可在消化前滴加少量消泡劑，如辛醇、液體石蠟等。3.4 消化時(shí)間消化時(shí)間也是許多文獻(xiàn)一直在探討的問(wèn)題，也有許多快速消化法的研究。具消化時(shí)間的標(biāo)準(zhǔn)為消化呈透明藍(lán)綠色后，再加熱消化15min。根據(jù)蘇軍等研究表明，消化液澄清后再繼續(xù)消化30min為宜。此試驗(yàn)只是針對(duì)于蛋白含量低于蠶蛹的 樣品，而對(duì)于蛋白含量高于蠶蛹的樣品，如進(jìn)口魚(yú)粉、血粉、羽毛粉等并未進(jìn)行 試驗(yàn)性研究。因此我個(gè)人認(rèn)為，可根據(jù)試樣的重量、蛋白含量的多

8、少以及消化的 難易程度而適當(dāng)調(diào)整消化液澄清后的消化時(shí)間。對(duì)于所稱(chēng)試樣質(zhì)量較多、蛋白含量高于蠶蛹或者難消化的試樣，消化液澄清后繼續(xù)消化的時(shí)間可控制在45m in2h不等，具體時(shí)間化驗(yàn)工作者可根據(jù)自己的工作經(jīng)驗(yàn)而自行定奪。3.5 消化液的轉(zhuǎn)移及定容消化結(jié)束后，把凱氏燒瓶從電爐上取下，放在小鐵筐內(nèi)冷卻。此時(shí)一定要注意安 全，帶稍厚手套防止?fàn)C傷。冷卻至室溫后加入蒸儲(chǔ)水1020m L,在等冷卻至室溫后轉(zhuǎn)移到100m L容量瓶?jī)?nèi)。再轉(zhuǎn)移是為減少損失誤差，應(yīng)在容量瓶口上加 上漏斗，且要用少量蒸儲(chǔ)水多次洗滌燒瓶和漏斗 （即采用少量多次原則），否則 會(huì)因偶然誤差而導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果偏低。轉(zhuǎn)移完成后不要立即定容，應(yīng)冷卻

9、至室溫后 再定容。若未冷卻而定容，待冷卻后，體積縮小，從而使吸取的試樣分解液的量 偏大，測(cè)定結(jié)果將偏高。若消化完畢冷卻后，消化液不能當(dāng)天定容需隔夜保存時(shí)， 應(yīng)先將凱氏燒瓶?jī)?nèi)加入少量的蒸儲(chǔ)水， 防止消化液結(jié)晶，再把凱氏燒瓶口用塑料 布包好，防止吸收空氣中的氨而影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。消化液若結(jié)晶不易轉(zhuǎn)移時(shí)， 可將凱氏燒瓶放在電爐上加熱一下，待結(jié)晶融化后再轉(zhuǎn)移。4粗蛋白的測(cè)定：蒸儲(chǔ)4.1 蒸汽發(fā)生器內(nèi)水的體積及酸堿性蒸汽發(fā)生器內(nèi)的水的體積應(yīng)控制在其容積的 2/3左右，并控制液面高度。水的 體積過(guò)大易在沸騰后從蒸汽發(fā)生器中玻璃管中溢出燙傷工作人員；過(guò)少易產(chǎn)生的氣體壓力不足或蒸干蒸汽發(fā)生器發(fā)生事故。水加入的

10、同時(shí)一同加入幾滴硫酸和幾 滴混合指示劑，且保持水一直呈紫紅色，以防止水中含有氨態(tài)的氮溢出而影響測(cè) 定值。4.2 蒸儲(chǔ)裝置的氣密性在蒸儲(chǔ)操作開(kāi)始前一定要檢查一下蒸儲(chǔ)裝置的氣密性。各導(dǎo)管的接口及用久的橡 皮管應(yīng)重點(diǎn)檢查。添加消化液和堿液的玻杯口要擰緊、 液封，防止產(chǎn)生的氨氣逸 出。在檢查氣密性的同時(shí)還應(yīng)打開(kāi)冷凝水開(kāi)關(guān)且要保持一定的流速， 否則冷卻不 完全。這是很容易忽視的問(wèn)題，特別是初學(xué)者。4.3 試樣分解液的移取要準(zhǔn)確 在移取試樣分解液前先把容量瓶搖勻，把10mL移液管用所要取的試樣分解液潤(rùn)洗23次后，再進(jìn)行移取。移取時(shí)移液管應(yīng)垂直于地面，視線(xiàn)與移液管刻度 線(xiàn)平行。吸取完試樣液后把移液管放到反應(yīng)

11、室內(nèi)自然流入反應(yīng)室， 切忌把移液管 放到小玻杯內(nèi)及用吸耳球吹移液管。 最后再用少量蒸儲(chǔ)水沖洗一下小玻杯， 并把棒狀玻塞塞緊。4.4 氫氧化鈉溶液的加入量在蒸儲(chǔ)過(guò)程中，反應(yīng)室內(nèi)溶液應(yīng)保持堿性，堿的加入量一般為 10m L左右，若 在消化時(shí)所加入的硫酸偏多，40%氫氧化鈉溶液的量也要隨之增加，這樣才能保 證除用于和硫酸及硫酸銅反應(yīng)外，還有足以使氨根轉(zhuǎn)化為氨的堿量。加入的堿先 放入小玻杯內(nèi)，慢慢轉(zhuǎn)動(dòng)棒狀玻塞，使堿緩慢流到反應(yīng)室內(nèi)，然后再將小玻杯內(nèi) 加入蒸儲(chǔ)水液封，切忌把棒狀玻塞提起加堿一特別是初學(xué)者， 這樣會(huì)造成反應(yīng)后 生成的氨從玻口逸出，導(dǎo)致所測(cè)蛋白含量偏低。4.5 蒸儲(chǔ)速度與氣流 蒸儲(chǔ)時(shí)產(chǎn)生的氣

12、流一定要均勻，切忌熱力不穩(wěn)、中途中斷或蒸汽不足，否則反應(yīng) 室內(nèi)溫度會(huì)降低，易產(chǎn)生倒吸；氣流過(guò)快硼酸吸收不完全。蒸儲(chǔ)的速度除與氣流 有關(guān)外還與冷卻水的流速及電路的溫度有關(guān)。蒸儲(chǔ)速度快，反應(yīng)液易被蒸汽帶出 而使測(cè)定結(jié)果偏高；蒸儲(chǔ)速度慢，氨沒(méi)有被完全蒸儲(chǔ)出來(lái)而結(jié)果偏低。 那么以什 么樣的蒸儲(chǔ)速度為宜呢？據(jù)賈艷玲和冷柏忠(2000)實(shí)踐證明：蒸儲(chǔ)速度一般應(yīng) 控制在每分鐘蒸儲(chǔ)出液體在57mL之間。4.6 蒸儲(chǔ)時(shí)間蒸儲(chǔ)時(shí)間多為5m i n ,加入試樣分解液及氫氧化鈉后蒸儲(chǔ) 4m i n ,使冷凝管末 端離開(kāi)硼酸液面后再蒸儲(chǔ)1m i n。但是標(biāo)準(zhǔn)中并未規(guī)定從何時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，據(jù)謝 文飛(2003)的試驗(yàn)證明，在

13、蒸儲(chǔ)完4mi n鐘后再多蒸儲(chǔ)12mi n對(duì)結(jié)果沒(méi) 有什么影響，所以可以從硼酸剛剛出現(xiàn)綠色時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)蒸儲(chǔ)4min(硼酸出現(xiàn)綠色說(shuō)明反映已經(jīng)開(kāi)始)。最終在4min后是否蒸儲(chǔ)完全可用pH試紙進(jìn)行檢測(cè)。在 蒸儲(chǔ)時(shí)還應(yīng)注意硼酸的吸收溫度。 硼酸是極弱的酸，只起吸收氨的作用，但要注 意硼酸吸收液溫度不應(yīng)超過(guò)40C,否則氨的吸收減弱導(dǎo)致結(jié)果偏低。4.7 反應(yīng)室的冷卻與洗滌 首先在蒸儲(chǔ)完畢，將冷凝管末端用蒸儲(chǔ)水沖洗后，再將錐形瓶移開(kāi)進(jìn)行滴定。清 洗反應(yīng)室時(shí)嚴(yán)禁將蒸儲(chǔ)瓶?jī)蓚?cè)的閥門(mén)同時(shí)關(guān)閉， 以免發(fā)生爆炸。反應(yīng)室清洗一定 要徹底，一是防止殘留液影響下次測(cè)定結(jié)果的正確性； 二是給反應(yīng)室降溫。如果 反應(yīng)室溫度很高，再

14、加之加入的氫氧化鈉與硫酸反應(yīng)放出的大量熱， 易產(chǎn)生爆沸， 將反應(yīng)液沖入冷凝管，造成實(shí)驗(yàn)失敗。另外反應(yīng)室溫度高，反應(yīng)劇烈，有部分氨 硼酸吸收不完全而逸出，測(cè)得的結(jié)果將偏低。一般反應(yīng)室溫度降至不燙手即可。4.8 錐形瓶的預(yù)處理 錐形瓶往往用洗衣粉洗滌，再用自來(lái)水、蒸儲(chǔ)水沖洗。洗衣粉不易徹底沖洗干凈， 導(dǎo)致錐形瓶?jī)?nèi)壁環(huán)境偏于堿性；另外各地自來(lái)水的 p H不同，所制的蒸儲(chǔ)水p H有時(shí)也會(huì)偏離中性，這樣都會(huì)導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果出現(xiàn)偏差。建議把錐形瓶進(jìn)行預(yù)處理 后再使用，其方法為：沖洗干凈的錐形瓶加入20mL蒸儲(chǔ)水、2滴混合指示劑，再用0.02mol ?L -1的鹽酸溶液或者0.02m o l ? L -1的氫氧

15、化鈉溶液滴定至 剛好由藍(lán)色變?yōu)榛壹t色，然后倒掉該液體后，再加硼酸吸收液2535m L和混合指示劑23滴。若加入指示劑后硼酸為藍(lán)色，則說(shuō)明硼酸中混入堿性物 質(zhì)或蒸儲(chǔ)水偏堿性，需重新配制硼酸溶液。錐形瓶的預(yù)處理雖然比較繁瑣，但是 可減少由于錐形瓶本身環(huán)境的pH偏離中性對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。4.9 滴定 滴定是整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程的最后一步，至關(guān)重要，否則整個(gè)實(shí)驗(yàn)將前功盡棄。滴定前 把鹽酸標(biāo)液瓶搖勻后，把酸式滴定管潤(rùn)洗 23次后加入鹽酸標(biāo)液排除氣泡， 記下刻度值，開(kāi)始滴定。滴定時(shí)一定要控制好滴定速度， 待接收液由淺綠色逐漸 變成無(wú)色時(shí)要放慢滴定速度，逐滴加入鹽酸標(biāo)液，接收液變成淺紅色時(shí)為滴定終 點(diǎn)，切勿滴過(guò)量。

16、5粗蛋白的測(cè)定：空白測(cè)定5.1 試劑空白測(cè)定另取凱氏燒瓶或者消化管一個(gè)，加入硫酸銅、無(wú)水硫酸鉀 （或無(wú)水硫酸鈉）、濃 硫酸，其中每個(gè)藥品的加入量與試樣消化時(shí)的加入量相同， 加熱消化至溶液呈透 明的藍(lán)綠色。其后的操作步驟完全相同。這樣可以校正試劑不純所發(fā)生的誤差。5.2 試樣空白測(cè)定 稱(chēng)取0.5g分析純蔗糖代替試樣，以后各種試劑的用量及操作步驟完全相同。其 標(biāo)準(zhǔn)為，空白測(cè)定消耗0.1m o l ? L -1鹽酸標(biāo)液體積不超過(guò)0.2mL;消耗0.02mol ?L-1鹽酸標(biāo)液體積不超過(guò)0.3mL。以上兩個(gè)空白測(cè)定并不需要每次都要做，隔 一段時(shí)間操作一次即可，但是在更換藥品試劑、標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)一定要做空白實(shí)驗(yàn)測(cè) 定。若空白值超標(biāo)，一般是由于所用試劑級(jí)別不夠或不純、蒸儲(chǔ)水不純、玻璃器 皿清洗不干凈等原因造成。6粗蛋白的測(cè)定：蒸儲(chǔ)裝置及操作準(zhǔn)確性檢測(cè)在進(jìn)行樣品檢測(cè)的同時(shí)，精確稱(chēng)取 0.2000g分析純的硫酸錢(qián)代替試樣，直接定 容100m L后進(jìn)行蒸儲(chǔ)、滴定，測(cè)得硫酸錢(qián)含氮量為21.19% 0.2%,以校正蒸儲(chǔ)裝置的氣密性和加堿、蒸儲(chǔ)和滴定各步驟是否正確。7粗蛋白的測(cè)定：計(jì)算時(shí)換算系數(shù)的處理我們?cè)谟?jì)算蛋白含量時(shí)多乘以平均系數(shù) 6.25 ,對(duì)于粗蛋白質(zhì)中含氮量尚未確定 的可以乘以平均系數(shù)，對(duì)于已經(jīng)確定的則不妥，以豆粕