豬肉制品中含火雞肉成分之定量檢驗(yàn)

1、食品中動(dòng)物性成分檢驗(yàn)方法豬肉製品中含火雞肉成分之定量檢驗(yàn)101 年 3 月 1 日署授食字第1011900486號(hào)公告訂定1. 適用範(fàn)圍：本檢驗(yàn)方法適用於豬肉製品中含有火雞肉成分之定量檢驗(yàn)。2. 檢驗(yàn)方法 ：檢體經(jīng) DNA 萃取後，以即時(shí)聚合酶鏈反應(yīng) （ real-time polymerase chain reaction, real-time PCR）之方法。2.1.工作環(huán)境：工作平臺(tái)需寬敞、潔淨(jìng)、光線良好。檢體前處理 、檢體 DNA 抽取、real-time-PCR試劑配製及 real-time-PCR 等檢驗(yàn)過(guò)程皆需有區(qū)隔空間，避免交叉污染 。PCR 試劑之配製應(yīng)於無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。2

2、.2.裝置（註 1）即時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)器：Roche LightCycler ? 或同級(jí)品。冷凍乾燥裝置：溫度可達(dá)-40以下，真空度可達(dá)133 mBar 以下，供檢體乾燥用。振盪型粉碎機(jī)：Retsch MM200 或同級(jí)品。真空乾燥裝置：供DNA 乾燥用。高壓滅菌釜。無(wú)菌操作臺(tái)。加熱振盪器：具溫控及振盪功能。微量冷凍離心機(jī)（ Micro refrigerated centrifuge ）：可達(dá) 20000 × g ，並具4溫控功能。離心機(jī)：供各式微量離心管離心用。分光光度計(jì)：具波長(zhǎng)260 nm、 280 nm。冷凍設(shè)備：具冷藏及凍結(jié)（-20°C）功能。旋渦混合器（Vortex

3、 mixer ）。酸鹼度測(cè)定儀（pH meter）。水浴裝置：溫差±1以?xún)?nèi)者。天平：最大稱(chēng)重量為2000 g，靈敏度為0.1 g；最大稱(chēng)重量為100 g，靈敏度為1 mg。註 1： 本方法所使用或提及之產(chǎn)品品牌及型號(hào)不代表為同類(lèi)產(chǎn)品中最好者及之產(chǎn)品品牌及型號(hào)亦不代表為同類(lèi)產(chǎn)品中較差者。；反之，未使用或未提2.3. 試藥DNA 抽取用： RNase A 及乙醇（ 96-100%）均採(cǎi)分子生物分析級(jí)試藥；適用於動(dòng)物DNA 抽取之市售套組。（註 2）Real-time PCR 用2.3.2.1. 定量試驗(yàn)用引子及探針2.3.2.1.1.哺乳類(lèi) 、家禽類(lèi)及魚(yú)類(lèi) （標(biāo)的基因： 12S ribo

4、somal RNA，供作內(nèi)部對(duì)照基因）引子 F： 12SF, 5 - CAAACTGGGATTAGATACCCCACTA -3引子 R： 12SR, 5 - ATCGRTTMTAGAACAGGCTCCTCTAG -3探針 P： 12SP, 5-(FAM)- CACCGCCAAGTCCTTTGRGTTT TARGC -(TAMRA)-3豬： PCR 增幅產(chǎn)物大小154 bp火雞： PCR 增幅產(chǎn)物大小154 bp2.3.2.1.2.火雞（標(biāo)的基因： 12S ribosomal RNA）引子 F： TURF, 5 - CCCTAACCCCTTAAGAAAAGAAT -3引子 R： TURR, 5

5、- GCACAAGATTTACCAACCCTA AA-3探針 P：TURP, 5 -(FAM)- TCTAATGTAGCCCAAGACG CCTTGCTTGT-(TAMRA)-3PCR 增幅產(chǎn)物大小171 bp註 2： 1. 合成之引子與探針，拆封後，以無(wú)菌去離子水稀釋成適當(dāng)濃度，分裝後置於-20貯存?zhèn)溆茫结樞璞芄獗４?。探? 端採(cǎi)用 6-carboxy-fluorescein（ FAM ）標(biāo)記， 3 端採(cǎi)用6-carboxytetramethyl-rhodamine（ TAMRA ）標(biāo)記。2. 內(nèi)部對(duì)照基因引子及探針之序列中，R 為混合鹼基代碼（ A/G ），表示同時(shí)含 A 及 G； M

6、為混合鹼基代碼（ A/C ），表示同時(shí)含 A 及 C。LightCycler ? FastStart DNA Master HybProbe（適用於Roche LightCycler ? ）本試劑內(nèi)含real-time PCR所需去氧核糖核苷三磷酸、聚合酶等 ，且內(nèi)附 25 mM 氯化鎂溶液，使用時(shí)添加引子、探針及待測(cè)檢體DNA 。對(duì)照用物質(zhì)：豬肉及火雞肉。（註 3）2.4.器具及材料吸管（ Pipette）： 10 L、20 L、100 L、200 L及1000 L。吸管尖頭（Pipette tips）： 10 L、20 L、200 L及1000 L。離心管（ Eppendorf tube）

7、： 200 L 、600 L、1.5 mL 及 2 mL 。PCR 玻璃毛細(xì)管：Roche LightCycler 專(zhuān)用。塑膠離心管：50 mL。註 3： 使用之塑膠或玻璃器皿均為無(wú)DNase 污染。2.5.Real-time PCR 溶液 （註 4） 之配製Roche LightCycler ? 試驗(yàn)用5 M引子 F.1.5 L5 M引子 R.1.5 L3.3 M探針 P .1.5LLightCycler ? FastStart DNA Master HybProbe.2.0L25 mM 氯化鎂溶液 .2.4L檢體 DNA 溶液（總量100 ng） .5.0L無(wú)菌去離子水 .6.1 L總體積

8、.20.0 L註 4： Real-time PCR 溶液應(yīng)置於冰浴中配製。估算一般real-time PCR 溶液之配製總量時(shí)，需超過(guò)所需量的10%。（註 5）2.6.標(biāo)準(zhǔn)曲線之製作取豬肉及火雞肉對(duì)照用物質(zhì)，冷凍乾燥並以粉碎機(jī)研磨成細(xì)粉後，配製豬肉中含火雞肉 50、 25、10、5 及 1%（ w/w ）5 種火雞肉濃度之對(duì)照用物質(zhì)，再抽取其 DNA ，分裝並置於 -20 °C 冷凍保存，供作標(biāo)準(zhǔn)曲線之製作。取節(jié)所抽取之 5 種火雞肉濃度對(duì)照用物質(zhì)之 DNA 溶液，以?xún)?nèi)部對(duì)照基因引子與探針，及以火雞特異性基因引子與探針?lè)謩e進(jìn)行 real-time PCR 反應(yīng)，分別求得各火雞肉濃度對(duì)

9、照用物質(zhì)之內(nèi)部對(duì)照基因 Ct 值（ threshold cycle value）與火雞特異性基因 Ct 值，並求取各別 Ct 值之平均值，將各濃度對(duì)照用物質(zhì)之火雞特異性基因 Ct 值平均值減去內(nèi)部對(duì)照基因 Ct 值平均值後所得之?dāng)?shù)值 Ct 為縱軸，以 5 種火雞肉對(duì)照用物質(zhì)濃度之對(duì)數(shù)值為橫軸，進(jìn)行線性回歸分析並製作標(biāo)準(zhǔn)曲線。註 5： 各濃度對(duì)照用物質(zhì)需進(jìn)行三重複試驗(yàn)，分析結(jié)果出現(xiàn)偏離現(xiàn)象時(shí)，應(yīng)將偏離之?dāng)?shù)據(jù)捨棄，以各濃度之代表數(shù)據(jù)列入標(biāo)準(zhǔn)曲線之線性回歸分析。2.7.檢體 DNA 之製備檢體之處理乾燥檢體直接以粉碎機(jī)研磨成細(xì)粉。溼狀檢體經(jīng)冷凍乾燥處理後，再以粉碎機(jī)研磨成細(xì)粉。檢體需貯存於乾燥及冷藏

10、或冷凍環(huán)境中。DNA 之抽取採(cǎi)用適用於動(dòng)物DNA抽取之市售套組，依套組操作說(shuō)明步驟抽取DNA。抽取之DNA溶液收集至已滅菌之1.5 mL離心管，作為檢體DNA原液。依節(jié)測(cè)定DNA濃度後，置於-20冷凍保存。DNA 濃度測(cè)定及純度判斷檢體 DNA 原液於使用前自冷凍庫(kù)中取出，於室溫下進(jìn)行溶解。取適量之檢體DNA 原液以無(wú)菌去離子水做適當(dāng)倍數(shù)之稀釋?zhuān)謩e測(cè)定260 nm 及 280 nm 之吸光值（ O.D.）。以波長(zhǎng)260 nm 吸光值乘 50 ng/ L及稀釋倍數(shù)，即為檢體DNA 原液濃度。DNA 溶液純度則以O(shè).D.260/O.D.280 比值作判斷，其比值應(yīng)介於1.7 2.0。2.8. 定

11、量試驗(yàn)（註 6）Real-time PCR Roche LightCycler ? 操作步驟以無(wú)菌去離子水適當(dāng)稀釋檢體DNA 原液、引子及探針備用。取real-time PCR 反應(yīng)管，並依照節(jié)配製 real-time PCR 溶液，依序加入LightCycler ? FastStart DNAMaster HybProbe、25 mM 氯化鎂溶液 、稀釋過(guò)之引子及探針，混合均勻後 ，分裝15L於 PCR 玻璃毛細(xì)管中 ，各別加入檢體 DNA 溶液 5 L，再將毛細(xì)管置於離心機(jī)中，以 830 × g瞬間離心，移入 real-time PCR 反應(yīng)器，依下列條件進(jìn)行反應(yīng)。同時(shí)另製作標(biāo)準(zhǔn)

12、曲線、正反應(yīng)及負(fù)反應(yīng)對(duì)照組（註 7）。步驟溫度時(shí)間1.最初變性95°C10 min2.變性95°C5 sec3.黏接60°C25 sec4.延展72°C8 sec步驟 2 至步驟4，共進(jìn)行 45 個(gè)循環(huán)反應(yīng)。5.冷卻35°C45 sec註 6： 檢體 DNA 之抽取與製備，其純度將直接影響real-time PCR 測(cè)試結(jié)果，檢體DNA 溶液可先進(jìn)行內(nèi)部對(duì)照基因real-time PCR 測(cè)試，以確定是否含有DNA 及其純度。註 7： 正反應(yīng)對(duì)照組係指有添加對(duì)照用物質(zhì)DNA 之反應(yīng)，而負(fù)反應(yīng)對(duì)照組係指無(wú)添加對(duì)照用物質(zhì) DNA 之反應(yīng)。計(jì)算豬肉製品經(jīng)real-time PCR 分析後，分別計(jì)算火雞特異性基因之Ct 值與內(nèi)部對(duì)照基因之Ct 值，並求取各別Ct 值之平均值，依下列計(jì)算式，求出豬肉製品中火雞肉成分之含量（ %）。豬肉製品中火雞肉成分含量（%） Ct：火雞特異性基因之Ct 值平均值減去內(nèi)部對(duì)照基因之Ct