納米稀土熒光材料與時間分辨熒光免疫分析硅膠包裹納米鋱熒

1、納米稀土熒光材料與時間分辨熒光免疫分析作者：葉志強,譚明乾指導教師：袁景利,王桂蘭一室101 組摘要： 在油包水型的微乳液中，合成了三種形狀規(guī)則、 尺寸均勻的硅膠基質納米稀土熒光材料。與前驅體相比， 新型熒光納米微粒具有更強的熒光強度和抗光漂白性能。 將納米微粒表面修飾并標記鏈酶親和素 SA（或抗體）后應用于時間分辨熒光免疫分析，建立了人血清中前列腺特異抗原（ PSA）、甲胎蛋白（ AFP）和乙肝表面抗原（ HBsAg）的高靈敏度檢測方法。關鍵詞：熒光納米微粒；稀土配合物；生物標記；時間分辨熒光免疫分析。時間分辨熒光生物分析技術是基于稀土熒光化合物特殊熒光性質而建立起來的一種高靈敏度分析方法，

2、現已廣泛應用于免疫測定、DNA雜交測定和熒光顯微鏡成像測定等生化檢測的領域1。該技術利用具有熒光壽命長、 Stokes 位移大和半峰寬窄等特點的稀土熒光配合物作為標記物，不僅適用于多標記分析， 而且可完全消除各種散亂光和短壽命熒光對測定的干擾，從而實現超高靈敏度分析。 基于這些優(yōu)點，時間分辨熒光生物分析技術在近20 年來取得了重大的發(fā)展，在臨床醫(yī)學與生命科學的實踐與研究中發(fā)揮著重要的作用。近年來，納米尺度發(fā)光材料在生化分析領域中的作用受到了越來越多的關注。量子點2、膠體金3、核殼型熒光探針4 等納米顆粒作為標記物已經開始應用于生化檢測領域。但是由于納米尺度的發(fā)光粒子的瑞利、拉曼和丁達爾散射產生

3、的背景光對測定的嚴重干擾, 影響了檢測結果的靈敏度、精密度和準確度，無法實現高靈敏的定量分析。在我們的研究中， 綜合稀土熒光標記物和納米技術的優(yōu)勢，合成了三種具有長壽命熒光的納米稀土熒光微粒 5-7 。新型納米熒光微粒用于時間分辨熒光生物分子分析，不僅可從根本上徹底消除各種散亂光和短壽命熒光對測定的干擾， 提高分析方法的靈敏度 , 而且由于熒光配合物被包覆在硅膠的骨架結構中,基本隔絕了外部環(huán)境對配合物的影響，極大地增強了熒光材料的光穩(wěn)定性。實驗部分1. 摻雜型納米熒光微粒的制備將160mgN,N,N1,N 1-2,6-bis(3-aminomethyl-1-pyrazolyl)-phenyl-

4、pyridinetetrakis(acetate)-Tb3+（ BPTA-Tb3+）溶于 1.1 ml的水后和 200 l的四乙氧基硅（ TEOS）攪拌下加入到100 ml 的圓底燒瓶中，然后再分別加入2.37 g Triton X-100、 1.87 g 正己醇和 7.25 g環(huán)己烷，制成 W/O型微乳液，在劇烈攪拌下向其中加入含有2.37 g TritonX-100、1.87 g 正己醇、 7.25g 環(huán)己烷及 200 l 濃氨水的另一種微乳液。室溫攪拌反應24 小時后，加入 50 ml 丙酮結束反應。將反應液離心后除去上清液，沉淀部分用乙醇和二次蒸餾水各洗三次，真空干燥后得到白色硅膠包裹

5、BPTA-Tb3+納米熒光微粒。2. 摻雜型納米熒光微粒用于測定人血清樣品中的PSA將含抗人 PSA單克隆抗體（ 10g/ml ）的 pH 值為 9.6 的 0.1 mol/L的碳酸鈉緩沖溶液50 l分注于 96 微孔板的各孔中， 4o小時包被后，將PSA標準溶液（用5% BSA-0.9% NaCl-0.1% NaN 3 的C, 24pH 值 7.8 的 0.05 mol/L Tris-HCl溶液制備）或血清樣品45 l 注入上述包被后的微孔板中。370C，1 小時反應后，用含有0.05% Tween 20的 pH值 7.8的 0.05 mol/L Tris-HCl緩沖溶液（緩沖溶液1）洗兩次

6、，再用pH 值 7.8的 0.05 mol/L Tris-HCl緩沖溶液（緩沖溶液2）洗一次，然后加入45 l生物素標記的抗PSA抗體溶液， 37 0C，1 小時反應后，用緩沖溶液1 洗兩次，緩沖溶液 2 洗一次，再加入45 l納米微粒標記的SA溶液， 37 0C，1 小時反應后，用緩沖溶液1 洗 4 次，然后進行固相時間分辨熒光測定。3. 共聚合型納米熒光微粒的制備將 160 mg BPTA-Tb 3+ 溶于 1.1 ml的水后和200 l 的 TEOS攪拌下加入到100 ml 的圓底燒瓶中，然后再分別加入2.37 g Triton X-100、 1.87 g正辛醇及7.25 g環(huán)己烷，制成

7、W/O型微乳液，在劇烈攪拌下向其中加入含有2.37 g Triton X-100、 1.87 g正辛醇、 7.25 g環(huán)己烷及200 l 濃氨水的另一種微乳液。室溫攪拌反應5 小時后，加入6 l 的 3-2-(2-aminoethylamino)ethylaminopropyl-trimethoxysilane（AEPS），繼續(xù)攪拌19 小時后，加入50 ml 丙酮結束反應。將反應液離心后除去上清液，沉淀部分用乙醇和二次蒸餾水分別洗三次，真空干燥后得到白色的共聚合型硅膠包裹BPTA-Tb3+納米熒光微粒。 4. 共聚合型熒光納米微粒用于測定人血清樣品中的 AFP 將含抗人 AFP單克隆抗體（

8、10 g/ml ）的 pH 值為 9.6 的 0.1 mol/L 碳酸鈉緩沖溶液 50 l 分注 000記的抗 AFP多抗溶液， 37C， 1 小時反應后，用緩沖溶液1 洗 4 次，然后進行固相時間分辨熒光測定。5. 共價鍵合型熒光納米微粒的制備將 10.4mg 氨 丙 基 三 乙 氧 基 硅(APS ，47 ?mol) ， 7.1 ?mol4,4-bis(1",1",1",2",2",3",3"-heptafluoro-4",6"-hexanedion-6"-yl)-chlorosulfo-o

9、- terphenyl(BHHCT)及3.55?mol EuCl3?6H2 O 加入 30 l 環(huán)己烷中，超聲振蕩反應15 分鐘后，反應液加入到含有1.1 ml 水，4.74g TritonX-100 、 3.64 g 正辛醇及 14.50 g 環(huán)己烷的 W/O型微乳液中，攪拌 0.5 小時后，加入 200 l 的 TEOS和 200 l 的濃氨水。室溫攪拌反應 24 小時后，加入 40 ml 丙酮結束反應。將反應液離心后除去上清液，沉淀部分用乙醇和二次蒸餾水分別洗三次后懸浮于水中備用。6.共價鍵合型納米微粒用于人血清中乙肝表面抗原（HBsAg）測定使用抗 HBsAg單抗和多抗進行測定，測定步

10、驟與摻雜型納米熒光微粒測定人血清中PSA相同。結果和討論1.摻雜型納米熒光微粒的制備及時間分辨熒光免疫測定PSA摻雜型納米熒光微粒的制備原理見圖1。在表面活性劑和助表面活性劑的作用下，含有3+TEOS的水合TEOS,BPTA-Tb 的水溶液在油相中形成均勻的小液室，每一個小液室相當于一個微反應器，化和聚合化的過程都被限制在微反應器內。微反應器的體積主要由水和表面活性劑的比值所決定，而微反應器的體積大小又決定了納米顆粒的尺寸大小。我們用這種方法制備了直徑在42 3 nm的納米顆粒( 圖 2) ，由電鏡照片可以看出納米顆粒形狀規(guī)則、尺寸均勻。圖 1 在微乳液中制備納米微粒的原理圖 2 硅膠包裹 B

11、PTA-Tb 3+納米微粒的電鏡照片納米熒光微粒表面的硅膠經過修飾后可與生物分子相連。將納米熒光微粒與SA共價結合后，可用于時間分辨熒光免疫測定。PSA是前列腺癌診斷的一個重要指標，現用于臨床檢測的方法主要有放射性免疫法和酶聯(lián)免疫法，它們的檢測靈敏度大約在100 pg/ml 左右。而最近的研究表明，如果方法的檢測靈敏度可達到20 pg/ml以下，那么至少可以提前一年診斷出治療后前列腺癌患者是否復發(fā)。所以發(fā)展高靈敏度的血中PSA的檢測方法顯得十分重要。使用 BPTA-Tb3+ 納米微粒標記SA的時間分辨熒光免疫分析法測定 PSA的工作曲線如圖 3 所示，方法的最低檢測限為7 pg/ml（用本底信

12、號標準偏差的3 倍計算）。使用本方法對24 個人血清樣品的PSA濃度進行了測定，并與臨床測定的結果進行了比較，兩者的相關性見圖 4。兩種方法對24 個人血清樣品中PSA濃度測定結果的相關性方程式為y 1.01x 0.008，相關系數為 0.998 ，說明使用納米微粒作為標記物的測定方法的結果是完全可信的。圖 3 用硅膠包裹 BPTA-Tb 3+ 納米微粒標記 SA圖 4 新方法和臨床檢測法用于24 個人血清的時間分辨熒光免疫測定PSA 的工作曲線樣品中 PSA 濃度測定的相關性2. 共聚合型納米熒光微粒的制備及時間分辨熒光免疫測定AFPAEPS 和 TEOS 一樣，都可以在氨水存在的條件下發(fā)生

13、水解和聚合反應。而且它具有的活性基團-NH 2在聚合后會存在于納米微粒的表面，為后續(xù)標記生物分子提供極大的方便。所以，在我們的研究中利用將 AEPS 和 TEOS 共聚合的方法在微乳液中制備出了表面帶有活性氨基的功能性硅膠包裹鋱配合物納米熒光微粒。 其電鏡測定結果 （見圖5）顯示這種納米微粒不僅形狀規(guī)則， 而且粒徑分布范圍窄(45±3 nm) 。聚合后存在于納米微粒表面的-NH 2 基團使得生物標記更加容易。通過簡單的方法將納米微粒與抗AFP抗體結合后， 建立了一種以納米微粒為標記物的時間分辨熒光免疫分析方法用于人血清中AFP 的測定，其工作曲線見圖6。本方法的最低檢測限為0.1ng

14、/ml ，相對標準偏差（CV% ）小于 9.0% ，血清添加回收率在 84.0-98.0% 范圍，說明該法具有較高的精密度和準確度，可以用于人血清樣品的測定。圖 5 功能性鋱納米熒光微粒的電鏡照片圖 6測定 AFP 的工作曲線3. 共價鍵合型納米熒光微粒的制備及時間分辨熒光免疫測定HBsAgBHHCT-Eu 3+是一種強熒光性銪配合物，只是它的水溶性較差，所以在用摻雜型方法制備納米微粒時只有少量的配合物被包進納米微粒中，導致制得的納米微粒熒光很弱。而采用共價鍵合的方法則不但可以增加每個納米微粒中所包含BHHCT-Eu 3+分子的個數， 從而使得納米微粒的熒光強度得到大幅度提高，而且一次性地在納

15、米微粒表面導入了自由氨基。電鏡測定結果（見圖 7）顯示該法制得的納米微粒大小均勻，粒徑為 37± 3 nm。圖 7 共價鍵合型納米微粒的電鏡照片圖 8. 納米微粒標記SA（ a）和 BHHCT-Eu 3+標記 SA-BSA（b）測定人血清中HBsAg 的工作曲線將納米微粒與SA 結合后，用于時間分辨熒光免疫測定人血清中的HBsAg ，其工作曲線見圖 8a。本法的最低檢測限為23 pg/ml ，證明其靈敏度要高于直接使用BHHCT-Eu 3+為標記物的測定方法 （圖 8b，最低檢測限為 84pg/ml ）。該法用于人血清樣品測定的相對標準偏差小于10%，添加回收率在80-110%范圍，

16、說明該法具有較高的精密度和準確度。結論本研究利用微乳液法制備了三種硅膠基質納米稀土熒光微粒，制備方法簡單且重復性好。所制備的納米微粒形狀規(guī)則、尺寸均勻， 在對其進行表面修飾后用于生物標記及時間分辨熒光免疫測定，建立了人血清中 PSA 、AFP 及 HBsAg 的高靈敏度定量測定方法。由于新型稀土熒光微粒具有強熒光、強抗光漂白性能及易用于生物標記等優(yōu)點，預計其在熒光顯微鏡生物成像測定及生物芯片等領域也有重要的應用前景，這部分的研究工作將在近期展開。注：本文系由中國科學院領域前沿項目大連化物所青年基金資助參考文獻：1. Soini, E.; L?vgren, T.CRC Crit. Rev. An

17、al. Chem .1987, 18, 105-154.2. Taylor, J. R.; Fang, M. M.; Nie, S.Anal. Chem. 2000 .72. 1979-1986.3. Schroedter, A.; Weller, H.2002,17, 3218-3221.Angew. Chem Int. Ed.4.5.Santra, S.; Zhang, P.; Wang, K.; Tapec, R.; Tan, W.Anal. Chem.2001, 73, 4988-4993.Ye, Z. , Tan, M., Wang, G. and Yuan, J.Analytica

18、l Chemistry . 2004， 76, 513-518.6.Ye, Z. , Tan, M., Wang, G. and Yuan, J.Talanta. 2004 In press.7.Hai, X., Tan, M., Wang, G., Ye, Z., Yuan, J. and Matsumoto, K. Analytical Sciences 2004，20, 245-246.Fluorescent Lanthanide Nano-materials and Time-Resolved FluoroimmunoassayZhiqiang Ye and Mingqian TanDirected by Jingli Yuan and Guilan Wang101 group, Department of Analytical ChemistryAbstract: Three kinds of silica-based fluorescent