EGCG對多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞KM3促血管新生作用的抑制效應(yīng)及機(jī)制初探

1、.EGCG對多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞KM3促血管新生作用的抑制效應(yīng)及機(jī)制初探【摘要】本研究探討綠茶茶多酚成分之一表沒食子兒茶素沒食子酸酯()epigallocatechin3gallate，EGCG)對多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞KM3促血管新生作用的影響及其機(jī)制。體外培養(yǎng)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞KM3，觀察不同濃度EGCG作用后的培養(yǎng)上清對血管內(nèi)皮細(xì)胞株HUVEC遷移和形成血管能力的影響。ELISA法檢測KM3細(xì)胞培養(yǎng)上清中血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）分泌水平；RTPCR方法檢測KM3細(xì)胞VEGFmRNA表達(dá)水平。結(jié)果表明：EGCG以濃度依賴方式抑制KM3細(xì)胞培養(yǎng)上清促內(nèi)皮細(xì)胞遷移的作用，5,25,50和100mol/

2、L的EGCG遷移細(xì)胞數(shù)目分別為41427，29970，20242及11613個(gè)，且EGCG的濃度與內(nèi)皮細(xì)胞的遷移數(shù)目呈負(fù)相關(guān)（r=-0.952,p0.05）。同時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞形成小管的面積隨EGCG濃度的升高而減少，25及50mol/L時(shí)的面積分別是88343.93231.1和60897.5914.1m2，均明顯低于對照組（p0.01)，小管面積與EGCG濃度呈負(fù)相關(guān)（r=-0.888,p0.05）。5、25、50、100mol/L的EGCG作用于KM3細(xì)胞48小時(shí)后培養(yǎng)上清中VEGF的含量分別為1399.047.4pg/ml，660.15.7pg/ml，108.55.8pg/ml和26.218

3、.6pg/ml，與對照組比較，25、50、100mol/L組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p0.01）。RTPCR結(jié)果顯示EGCG抑制KM3細(xì)胞VEGF的mRNA水平表達(dá)，且呈濃度依賴性。結(jié)論：EGCG能顯著抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞KM3的促血管新生作用；下調(diào)VEGF轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，減少VEGF的分泌可能是其藥理作用機(jī)制之一。醫(yī)學(xué)論文網(wǎng)【關(guān)鍵詞】多發(fā)性骨髓瘤InhibitoryEffectofEGCGonAngiogenesisInducedbyMultipleMyelomaCelllineKM3andItsMechanismSHAOJing,CHENZhiChao,LIQiuBai,LJianInstitut

4、eofHematology,UnionHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430022,ChinaAbstractTheaimofthisstudywastoinvestigatetheeffectof(-)epigallocatechin3gallate(EGCG)onangiogenesisinducedbymultiplemyelomacelllineKM3anditsmechanism.TheeffectsofKM3cellsupernatantafterbeingtre

5、atedwithEGCGindifferentconcentrationsonmigrationandvascularformatiemabilityofendothelialcelllineHUVECwereinvestigatedthroughcultureofMMcelllineKM3invitro.Thesecretionlevelofvascularendothelialgrowthfactor(VEGF)inKM3cellsupernatantandtheexpressionlevelofVEGFmRNAinKM3weredetectedbyELISAandRTPCRrespect

6、ively.TheresultsindicatedthattheKM3cellsupernatantsignificantlyinducedendothelialcellmigrationandvasselformationinvitro.EGCGinhibitedtheeffectofendothelialcellmigrationinducedbyKM3cellsupernatant,andthenumbersofmigratedcellswere41427,29970,20242and11613at5,25,50,100mol/Lrespectively.Thenumbersofmigr

7、atedcellsshowednegativecorrelationwiththedoseofEGCG(r=-0.952,p0.05).TheareasofthecapillarylikestructuresdecreasedwhiletheconcentrationsofEGCGincreased,88343.93231.1m2at25mol/L,60897.5914.1m2at50mol/L,whichweresignificantlylessthanthatinthecontrol(p0.01）andshowednegativecorrelationwiththedoseofEGCG(r

8、=-0.888,p0.05).48hoursaftertreatmentwithEGCGatconcentrationsof5,25,50and100mol/L,thelevelsofVEGFintheculturesupernatantwere1399.047.4，660.15.7，108.55.8and26.218.6pg/mlrespectively.Except5mol/L,alltheothergroupsshowedsignificantchangeswhilecomparedwiththecontrols(p1.8）和含量。取總RNA2l，Oligo(dT)1l,DEPC水補(bǔ)充至

9、12l，70預(yù)熱5分鐘，再依次加5buffer4l，RNA酶抑制劑1l，10mmol/L的dNTP2l，37孵育5分鐘，再加逆轉(zhuǎn)錄酶1l，42，60分鐘，停止反應(yīng)。VEGF的引物序列正義鏈5TGCCTTGCTGCTCTACCTCC3，反義鏈5TCACCGCCTCGGCTTGTCAC3，產(chǎn)物VEGF121409bp，VEGF165613bp。actin的引物序列是正義鏈5GACAGGATGCAGAAGGAGATTACT3,反義鏈5TGATCCACATCTGCTGGAAGGT3,擴(kuò)增產(chǎn)物141bp。取2lcDNA，加10buffer2.5l，Taq酶1l，dNTP0.5l，MgCl21l，VEGF

10、或actin上下游引物各1l，用DEPC水補(bǔ)充體積至25l。反應(yīng)采用SDPCR程序5，94預(yù)變性5分鐘，94變性1分鐘，退火溫度自65開始，以3幅度遞減至53，每個(gè)溫度退火2分鐘，72延伸1分鐘，4個(gè)循環(huán)，5個(gè)溫度共20個(gè)循環(huán)，然后以50為退火溫度進(jìn)行12個(gè)循環(huán)，最后72充分延伸7分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外光顯影。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以SD表示，應(yīng)用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件，組間分析采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)及相關(guān)分析方法進(jìn)行處理。結(jié)果EGCG對KM3細(xì)胞培養(yǎng)上清誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞遷移的抑制作用從陰性對照組可以看出，內(nèi)皮細(xì)胞本身具有一定的遷移能力，而未經(jīng)EGCG作用過的KM3細(xì)胞培養(yǎng)上清能

11、明顯促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、細(xì)胞數(shù)增加。經(jīng)不同濃度EGCG作用48小時(shí)的KM3細(xì)胞培養(yǎng)上清對內(nèi)皮細(xì)胞的遷移效應(yīng)明顯低于陽性對照組，遷移細(xì)胞的數(shù)目隨著EGCG藥物濃度的升高而減少（圖1）。陽性對照組與陰性對照組，EGCG藥物作用組與陽性對照組之間相比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p0.01）（表1）。內(nèi)皮細(xì)胞遷移數(shù)目與EGCG藥物濃度的直線相關(guān)性分析結(jié)果顯示，二者呈負(fù)相關(guān)（r=-0.952,p0.05）。EGCG對KM3細(xì)胞培養(yǎng)上清誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞小管形成的抑制作用未經(jīng)EGCG作用的KM3細(xì)胞培養(yǎng)上清能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞在Matrigel上形成小管狀結(jié)構(gòu)，逐漸成網(wǎng)狀相連。與陰性對照相比，管腔完整，數(shù)目多。經(jīng)不同濃度EG

12、CG作用48小時(shí)的KM3細(xì)胞培養(yǎng)上清對內(nèi)皮細(xì)胞的小管形成效應(yīng)明顯低于陽性對照組，管腔面積隨著EGCG藥物濃度的升高而減少，100mol/LEGCG作用組已無完整的管腔形成（圖2）。陰性對照組與陽性對照組，25、50mol/LEGCG藥物作用組與陽性對照組之間相比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p0.01）（表2），內(nèi)皮細(xì)胞形成小管的面積與EGCG藥物濃度之間呈負(fù)相關(guān)（r=-0.888,p0.05）。討論表沒食子兒茶素沒食子酸酯()epigallocatechin3gallate,EGCG)是綠茶茶多酚的一種主要成分，具有多種生理活性和藥理效應(yīng)。眾多的研究表明，EGCG在腫瘤的防治中有重要作用，其抑癌機(jī)制包括

13、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和下調(diào)Bcl2蛋白的表達(dá)6。EGCG還能強(qiáng)烈抑制端粒酶的活性，引起腫瘤細(xì)胞端粒的縮短、染色體的改變和對與細(xì)胞壽命相關(guān)的半乳糖苷酶的表達(dá)的抑制7。另外也有研究表明,EGCG可誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞的凋亡，其機(jī)制與線粒體膜電位的下降，細(xì)胞色素C、Smac/DIABLO和AIF從線粒體的釋放及升高胞內(nèi)活性氧水平相關(guān)8。由此證實(shí)，EGCG對MM也有較強(qiáng)的抗腫瘤作用。EGCG除上述的抗腫瘤效應(yīng)外，還有研究表明在乳腺癌等腫瘤中具有抗血管新生的作用9，10。血管新生在MM的發(fā)病中有重要意義，并和預(yù)后密切相關(guān)，以抗血管新生為靶點(diǎn)的治療已成功的應(yīng)用于臨床11。EGCG是否可抑制MM的促

14、血管新生作用目前尚無報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用內(nèi)皮細(xì)胞遷移和小管形成實(shí)驗(yàn)證明，MM細(xì)胞的培養(yǎng)上清具有明顯的促內(nèi)皮細(xì)胞遷移和小管形成的作用，而經(jīng)不同濃度的EGCG作用后的MM細(xì)胞上清誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和小管形成的能力是逐漸減弱的，且呈濃度依賴性，說明在體外實(shí)驗(yàn)中EGCG可明顯抑制MM細(xì)胞誘導(dǎo)的血管新生作用。腫瘤的血管新生有賴于腫瘤細(xì)胞分泌的血管新生因子與內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用。VEGF作為血管新生中重要的正調(diào)控因子已發(fā)現(xiàn)在MM細(xì)胞系及來源于患者的瘤細(xì)胞中高表達(dá)12，其mRNA通過不同的剪切方式產(chǎn)生了5種不同的異構(gòu)體，其中VEGF165在體內(nèi)最常見，除可存在于細(xì)胞表面或細(xì)胞外基質(zhì)中，還可分泌至細(xì)胞的培養(yǎng)上清中。在

15、體內(nèi)，VEGF通過存在于內(nèi)皮細(xì)胞上的VEGF受體特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移促進(jìn)新生血管生長13。本實(shí)驗(yàn)通過ELISA方法檢測MM細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGF的含量顯示，經(jīng)25mol/L的EGCG作用48小時(shí)后上清中的VEGF濃度即有明顯下降，且與EGCG呈濃度依賴性。從mRNA水平的檢測可以看到，EGCG對VEGF在轉(zhuǎn)錄水平的作用與蛋白分泌水平結(jié)果一致，即在轉(zhuǎn)錄水平抑制了VEGF的表達(dá)，從而減少蛋白的分泌，明確了EGCG抑制MM細(xì)胞的促血管新生作用可能是以抑制促進(jìn)血管新生因子VEGF表達(dá)為機(jī)制，從而阻斷其與內(nèi)皮細(xì)胞上特異受體的結(jié)合，激活下游的信號傳導(dǎo)及相應(yīng)的生物學(xué)

16、效應(yīng)。本研究初步探討了EGCG抑制MM血管新生作用及其機(jī)制，但其上游調(diào)控機(jī)制和是否存在其他機(jī)制尚不清楚，這些均有待進(jìn)一步的研究。綠茶是國人所喜愛的傳統(tǒng)保健飲料之一，EGCG作為綠茶茶多酚的一種，來源廣泛。深入研究其對MM的抗腫瘤機(jī)制和藥理效應(yīng)，對開發(fā)新的抗MM藥物有重要意義?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1VaccaA,RibattiD,RoncaliL,etal.Bonemarrowangiogenesisandprogressioninmultiplemyeloma.BrJHaemato1,1994;87:503-5082RajkumarSV,FonsecaR,WitzigTE,etal.Bonemarro

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