RNA干擾抑制EphB4基因表達(dá)對(duì)胰腺癌PANC1細(xì)胞的影響

1、.大連醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文RNA干擾抑制EphB4基因表達(dá)對(duì)胰腺癌PANC-1細(xì)胞的影響姓名：李斌申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：外科學(xué)指導(dǎo)教師：趙作偉201106：RNA干擾抑制EphB4基因表達(dá)對(duì)胰腺癌PANC1細(xì)胞的影響碩士生姓名：李斌 指導(dǎo)教師：趙作偉教授 專業(yè)名稱：外科學(xué)摘要目的：胰腺癌是一種惡性程度很高的消化系統(tǒng)腫瘤，它嚴(yán)重危害著人類的生 命健康。由于它發(fā)病隱匿、進(jìn)展迅速，傳統(tǒng)治療方法的效果不能令人滿意，治療 困難，預(yù)后極差，因此研究出診治胰腺癌的新方法顯得尤為重要。近年來，隨著 基因治療技術(shù)的迅速發(fā)展以及胰腺癌相關(guān)基因研究的不斷深入，胰腺癌的基因診 斷和基因治療正在進(jìn)一步的探索中。腫瘤的

2、血管生長(zhǎng)及形成是促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移的重要因素，所以抑 制胰腺癌的血管形成，降低胰腺癌組織中的血管含量，阻止其快速增長(zhǎng)就顯得尤 為重要。EphB4受體促進(jìn)了血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，參與調(diào)控胚胎 期血管形成過程中的動(dòng)靜脈分化。目前，有文獻(xiàn)報(bào)道EphB4受體在胰腺導(dǎo)管細(xì)胞 癌中的高表達(dá)與腫瘤血管的生成及侵襲性有密切相關(guān)性。RNAi通過外源性或內(nèi)源性的雙鏈RNA(dsRNA)，特異性結(jié)合了與dsRNA 序列互補(bǔ)的mRNA，誘導(dǎo)該mRNA的降解，沉默該基因的表達(dá)，屬于轉(zhuǎn)錄后水平 的基因沉默。目前，它的應(yīng)用范圍非常廣，可用于腫瘤基因功能分析和調(diào)控信號(hào) 轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等方面，為腫瘤的基因治療提

3、供新的目標(biāo)和途徑。本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建EphB4基因的siRNA真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染胰腺癌PANC1細(xì)胞 后，研究RNAi對(duì)PANC1細(xì)胞EphB4基因的表達(dá)和細(xì)胞增殖、遷移行為的影響，為 以后進(jìn)一步研究胰腺癌基因治療提供基礎(chǔ)。方法：軟件分析EphB4基因的mRNA結(jié)構(gòu)，篩選出擬干擾靶位點(diǎn)，構(gòu)建 EphB4基因的干擾質(zhì)粒pSIRENRetroQZsGreenEphB4和陰性對(duì)照質(zhì)粒 pSIRENRetroQZsGreen-N，經(jīng)過測(cè)序鑒定后，提取重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PANC1細(xì)胞；實(shí)驗(yàn)分成空白對(duì)照組、pSIRENRetroQZsGreenEphB4組和pSIRENRetroQ- ZsGreen-N組，進(jìn)行體外

4、實(shí)驗(yàn)；在重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞48h后，用RT-PCR和Westernblot分別測(cè)定EphB4 mRNA和EphB4蛋白的相對(duì)含量，觀察各重組質(zhì)粒 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染PANC1細(xì)胞后對(duì)EphB4基因表達(dá)的影響；MTT測(cè)定細(xì)胞增殖能力；劃痕遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力。結(jié)果：測(cè)序鑒定證明重組質(zhì)粒pSIRENRetroQZsGreenEphB4和pSIREN RetroQZsGreen-N構(gòu)建成功；瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48h后，脂質(zhì)體+干擾質(zhì)粒組PANC1細(xì) 胞中EphB4 mRNA的表達(dá)水平較空白組、脂質(zhì)體組、干擾質(zhì)粒組和脂質(zhì)體+對(duì)照 質(zhì)粒組顯著下降(P<005)；空白組、脂質(zhì)體組、干擾質(zhì)粒組和脂質(zhì)體+對(duì)照質(zhì)粒 組四

5、組間比較，差異不明顯(P>005)；Westernblot法測(cè)定發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)體+干擾 質(zhì)粒組PANC1細(xì)胞中EphB4蛋白的表達(dá)水平較空白組和脂質(zhì)體+對(duì)照質(zhì)粒組顯著下降(P<005)；空白組和脂質(zhì)體+對(duì)照質(zhì)粒組兩組間比較，差異不明顯(P>005)；抑制EphB4基因的表達(dá)使PANC1細(xì)胞的增殖能力有所減弱，細(xì)胞的遷 移能力與對(duì)照組比較有所下降。結(jié)論：成功構(gòu)建靶向EphB4的siRNA真核表達(dá)載體并有效轉(zhuǎn)染胰腺癌 PANC1細(xì)胞。干擾質(zhì)粒能有效地抑制胰腺癌PANC1細(xì)胞EphB4基因的mRNA 和蛋白表達(dá)，同時(shí)PANC1細(xì)胞的體外增殖和遷移能力明顯下降。關(guān)鍵詞：胰腺癌PANC一1

6、EphB4RNA干擾2The influence of RNA interference suppression EphB4 expression for the PANC-1 cells of pancreatic cancerMaster degree candidate：Li Bin Supervisor：Professor Zhao Zuowei Maj or：SurgeryAbstraetObieetive：Pancreatic cancer is a higldy malignant tumor of digestive system，and it is seriously har

7、m to humanS life and healthBecause of its hidden disease and rapid progress，the effect of traditional treatment is not satisfactoryIts treatment is very difficult and prognosis is very poor，SO it is very important to developed a new methodof diagnosis and treatment of pancreatic cancerIn recent year

8、s，with the rapid development of gene therapy and genetic research of pancreatic cancer，gene diagnosis and gene therapy of pancreatic cancer are being further exploredThe blood vessel growth of pancreatic cancer plays a very important role in the development and metastasis of tumor，SO it is very impo

9、rtant to inhibit the growth of pancreatic blood vessels and prevent rapid growth of the tumorEphB4 receptor promotes the sprouting，migration，proliferation and tube formation of endothelial celland regulates arterial and venous differentiation during embryonic angiogenesisIn the present，it has been r

10、eported that high expression of EphB4 receptor in pancreatic ductal cell carcinoma is closely related to tumor angiogenesis and invasionRNA interference(RNAi)is a posttranscriptional gene silencing，it Can triggerposttranscriptional control procedures and lead to degradation of specific single scraIl

11、ded mRNARNAi has been successfully used in gene function and upstream and do、vns臼e鋤molecular intemctions of signal transduction system，and provide a new strategy for cancer therapyIn this study，eukaryotic expression plasmid vector of targeting EpllB4 Wasconstnlcted and transfected to PANC1 pancreati

12、c cancer cells to research the inhibitionof RNAi for PANC1 cells on gene expression of EphB4，cell growth and migrationItprovides the basis for gene therapy of pancreatic cancer in the future·Methods：software analyzed mRNA of EphB4 gene and selected target sitesConstructing EphB4 recombinant euk

13、aryotic expression plasmid pSIREN-RetroQ_3ZsGreen·EphB4 and constructing a negative control plasmid pSIRENRetroQ ZsGreen-NAfter sequencing，the recombinant plasmid was extracted and transfected to PANC一1 cells；(蠆)The experiment Was divided into control group，pSIREN-RetroQ ZsGreen··EphB

14、4 group and pSIREN·-RetroQ··ZsGreen-N group for the vitro experiments；(查)Transfecting plasmid to cells after 48h，恤relative amount of EphB4 mRNA andprotein were measured by RT-PCR and Western-blotting，and observeing the inhibition of the recombinant plasmids for the expression of EphB4

15、 gene of PANC-1 cells；Cell proliferation Was determinated by MTT；Scratch migration assay detected the ability of cell migration Resuits：()sequencing proved that the recombinant plasmid pSIREN·-RetroQ·- ZsGreen··EphB4 and pSIREN··RetroQ·-ZsGreen-N were successfully

16、constructed； (至)Transient transfecting after 48h，the expression level of EphB4 mRNA in the group of liposomes and interfere plasmid more decreased than the control group，the group of liposome，the group of interfere plasmid group，and the group of control plasmid liposome(P<005)There were not signi

17、ficant difference between the control group， the group of liposome，the group of interference plasmid and the group of controlplasmid liposome(P>O05)；Westernblot method showed that the expression level of EphB4 mRNA in the group of liposome interference plasmid more decreased than the control grou

18、p and the group of control plasmid liposome(P<005)There were not significant difference between the blank group and the group of control plasmid liposome(P>005)；(研dae inhibition of EphB4 expression weakened the proliferation of PANC-1，and the ability of cell migration compared慚tIl the control

19、group decreasedConclusion：The siRNA eukaryotic expression plasmid vector of targeting EphB4Was successful constructed and effectively transfected PANC一1 pancreatic cancer cellsRecombinant plasmid Can inhibit the expression of EphB4 gene mRNA and protein of pancreatic cancer PANC-1 cells，and the grow

20、th and migrationof PANC-1cells were significantly decreasedKey words：pancreatic CanCer PANC-1 EpllB4 RNA interference4RNA干擾抑制EphB4基因表達(dá)對(duì)胰腺癌PANC1細(xì)胞的影響碩士生姓名：李斌 指導(dǎo)教師：趙作偉教授 專業(yè)名稱：外科學(xué)日IJ舌胰腺癌是一種高度惡性腫瘤，近年來它的發(fā)病率在全世界逐年上升。在西方 發(fā)達(dá)國(guó)家胰腺癌已成為十大惡性腫瘤之一。在我國(guó)，該病的發(fā)病率也有增高的趨 勢(shì)。胰腺的解剖位置深，較隱匿，難以得到早期診斷及有效治療，大部分患者發(fā) 現(xiàn)腫瘤時(shí)已屬于晚期，腫瘤經(jīng)過

21、血管、淋巴系統(tǒng)等途徑轉(zhuǎn)移，需要全身性的治療。 目前，胰腺癌的主要治療手段包括化療、放療、手術(shù)及聯(lián)合治療。但是，手術(shù)切 除率較低，術(shù)后約80-90患者復(fù)發(fā)【l訓(xùn)，并且對(duì)很多化療藥物或放療均不敏感， 以至治療效果不佳，不能令人滿意，因此探索新的有效治療策略和方案顯得非常 重要。隨著基因技術(shù)的迅速發(fā)展，與胰腺癌有關(guān)的基因不斷被發(fā)現(xiàn)和克隆，為胰 腺癌的發(fā)病機(jī)制、診斷和治療等研究提供了很多新的靶點(diǎn)。Eph家族是酪氨酸蛋白激酶受體(receptor tyrosine kinases，RTKs)中最大的亞 家族，它們結(jié)合ephrin配體，共同轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞間信號(hào)。Eph家族可分為兩個(gè)亞群，分 別是EphA和Eph

22、B。同樣，ephrin配體也可分為兩個(gè)亞群，分別是ephrinA和 ephrinB。研究表明，每個(gè)亞群里一個(gè)受體可結(jié)合多個(gè)配體，從而發(fā)揮不一樣的作 用。例如EphA4可結(jié)合ephrinA配體，也可結(jié)合ephrinB配體15訂J。Eph受體和ephrin配體的過表達(dá)與腫瘤的惡性進(jìn)展有關(guān)，它們的部分成員已被證明在乳腺癌瞵。1 ，肺癌1¨，胃癌121，結(jié)腸癌13,14，子宮內(nèi)膜癌【15,16】，黑色素瘤【17,IS等中表達(dá)。而Eph 家族中的EphB4受體在腫瘤血管方面的研究尤為引人關(guān)注。EphB4受體與ephrinB2 配體高度特異性結(jié)合，促進(jìn)了血管內(nèi)皮細(xì)胞的芽生、增殖、遷移和管腔形成&

23、#168;犯UJ。EphB4受體在乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、子宮內(nèi)膜癌、惡性間皮瘤等中表達(dá)。 RNAi是一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默技術(shù)(PTGS)，把一小段siRNA導(dǎo)入細(xì)胞，特異性結(jié)合內(nèi)源性靶基因，誘導(dǎo)其mRNA的降解，從而抑制該基因的表達(dá)【211。近年來， 研究人員常利用RNAi特異性下調(diào)腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)，研究該基因在腫瘤發(fā)生發(fā) 展中的作用，為腫瘤的早期診斷和基因治療提供靶位劇22J。本課題前期研究了16842個(gè)基因點(diǎn)的基因表達(dá)譜芯片，篩選出與胰腺癌相關(guān) 的差異表達(dá)的基因，結(jié)果表明EphB4基因在4例胰腺癌組織中均表達(dá)上調(diào)，并且 在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中表達(dá)上調(diào)。通過免疫組化SP法和RT-PCR方法檢

24、測(cè)胰腺導(dǎo)管 細(xì)胞癌中EphB4基因的表達(dá)及腫瘤微血管密度，結(jié)果表明EphB4受體在胰腺導(dǎo)管 細(xì)胞癌中的表達(dá)程度與腫瘤血管的生成和癌細(xì)胞的侵襲性有正相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用RNA干擾技術(shù)，構(gòu)建EphB4基因的siRNA真核表達(dá)載體pSIREN Re仃oQZsGreenEphB4，轉(zhuǎn)染PANIC1細(xì)胞系，觀察干擾質(zhì)粒下調(diào)EphB4的基因 表達(dá)對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖和遷移能力的影響。通過以上研究，探討EphB4基因在胰 腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的意義，為胰腺癌的基因治療方面提供靶位點(diǎn)。6第一部分靶向EphB4的siRNA表達(dá)載體的構(gòu)建刖吾RNAi是一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默技術(shù)(PTGS)，把-d,段siRNA導(dǎo)入細(xì)胞，特異

25、性 結(jié)合內(nèi)源性靶基因，誘導(dǎo)其rnRNA的降解，從而抑制該基因的表達(dá)。siRNA表達(dá) 載體可在細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，發(fā)揮阻斷基因表達(dá)的作用。我們構(gòu)建了特異性抑制 EphB4基因的siRNA表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染進(jìn)胰腺癌細(xì)胞中，下調(diào)了該基因的表達(dá)，為 進(jìn)一步探討其在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用奠定了基礎(chǔ)。材料與方法1、質(zhì)粒 質(zhì)粒pSIREN。RetroQZsGreen(圖11)，購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。它含有Pu6啟動(dòng)子(Pu6promoter)，能啟動(dòng)shRNA的表達(dá)；它的Pc·MVIE啟動(dòng)子能 夠使綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)，觀察siRNA真核表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染效率；Amp抗性基 因可用于篩選陽性克隆細(xì)菌

26、。酶切位點(diǎn)是BamH I和EcoRI，它們中間的區(qū)域?yàn)椴迦肫?shRNA)的位置，整個(gè)質(zhì)粒序列全長(zhǎng)是6568bp。圖l-1 pSIREN-RetroQZsGreen質(zhì)粒結(jié)構(gòu)2、主要試劑和材料Ecoli Competent Cells JM 1 09寶生物工程(大連)有限公司限制性內(nèi)切酶BamHI寶生物工程(大連)有限公司7限制性內(nèi)切酶EcoRI寶生物工程(大連)有限公司RT-PCR試劑盒寶生物工程(大連)有限公司T4DNA連接酶寶生物工程(大連)有限公司瓊脂凝膠DNA回收試劑盒寶生物工程(大連)有限公司高純度質(zhì)粒提取試劑盒寶生物工程(大連)有限公司LB培養(yǎng)基寶生物工程(大連)有限公司DNA

27、marker DL2000寶生物工程(大連)有限公司 3、主要實(shí)驗(yàn)儀器細(xì)胞培養(yǎng)箱，倒置顯微鏡，超凈工作臺(tái)，臺(tái)式離心機(jī)，-80超低溫冰箱， 高速冷凍離心機(jī)，37"(2溫箱，恒溫水浴箱，溫控?fù)u床，凝膠成像系統(tǒng)，電子天平， DNA電泳儀，PCR儀。4、方法41 EphB4特異性siRNA序列的選擇由Gene Bank中查找人EphB4基因序列(NM 004444)，應(yīng)用Ambion公司 (http：wwwambioncom)RNAi設(shè)計(jì)軟件并參考相關(guān)文獻(xiàn)，進(jìn)行全基因的掃描和 序列分析，然后根據(jù)siRNA設(shè)計(jì)的原則尋找符和特征的靶位點(diǎn)，使用BLAST技 術(shù)在基因庫(kù)中確認(rèn)沒有與選中的mRNA序

28、列同源的基因，保證靶基因具有序列特 異性。最后決定的靶位點(diǎn)為5GGUGAAUGUCAAGACGCUG3。另外，再設(shè)計(jì) 隨機(jī)陰性對(duì)照序列為：5GCCACUAUGCGCUCUAGAU3，應(yīng)用BLAST分析， 發(fā)現(xiàn)該陰性對(duì)照序列與任何人類基因均無同源性。42 shRNA序列DNA模板的設(shè)計(jì)按照選定的干擾靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)相應(yīng)的shRNA DNA表達(dá)模板：設(shè)定siRNA目標(biāo) 序列為正義鏈(sense)，其反向互補(bǔ)序列為反義鏈·(antisense)，中間是一個(gè)15個(gè) 堿基(51'AGTGCTCCTGGTTG3)的Loop結(jié)構(gòu)，令其能反向互補(bǔ)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)shRNA(small hairpin

29、RNA，shRNA)。shRNA的轉(zhuǎn)錄終止序列采用T1耵結(jié)構(gòu)，兩端分別為BamHI(GATCCG)和EcoRI(Cy'CTTAA)酶切位點(diǎn)。shRNA的兩條 DNA單鏈對(duì)由寶生物工程(大連)有限公司合成。表I-I shRNA的DNA序列shRNA-EphB4(5-BamHI+sense+loop+antiseme+termination signal+EcoRI·3)5型垡KX粥Af6lT(、，IAAGAC婦CTlG塑圈碧笪豎壅磐筵窖CAGC：CHlCl颶ACAT陀ACCm扯9邸3·90CACmCAGTTCTGOGAC墊璺簍氍鎏g壟苤壟苤GTOGCAGAACTAGT

30、GG覆強(qiáng)匿目!自蛩5843 shRNA與pSIRENRetroQZsGreen質(zhì)粒的連接 431兩條sm斟A的DNA單鏈退火形成雙鏈DNA 將合成的DNA單鏈稀釋成0010Drtl，各取sense oligo1“l(fā)antisense oligo1肛l牛STEBuffer1 mH207山六STE Buffer：1 0mM Tris pH80，50mM NaCI，l mM EDTA94。C水浴5分鐘，然后停止加熱冷卻至30水浴90分鐘，4。C保存。 432質(zhì)粒pSIRENRetroQZsGreen的處理 因shRNA的DNA模板在其兩端引入了BamHI和EcoRI酶切位點(diǎn)，在pSIRENRetro

31、QZsGreen的多克隆位點(diǎn)中也有BamHI和EcoRI的酶切位點(diǎn)(見圖 11)，故用BamHI和EcoRI酶切pSIRENRetroQZsGreen質(zhì)粒使其線性化，反應(yīng) 體積為201xl，37過夜。用1的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，用凝膠回收試劑盒回收， 獲得酶切線性的質(zhì)粒。433 shRNA的DNA鏈與pSIRENRetroQZsGreen質(zhì)粒的連接 采用209l反應(yīng)體系，分別加入溶液如下：酶切線性質(zhì)粒51xl退火的DNA鏈5山SolutionI1 01xl于16。C充分混勻，30分鐘后得到重組的pSIRENRetroQZsGreenEphB4質(zhì)粒。 44轉(zhuǎn)化及擴(kuò)增重組質(zhì)粒(1)1009l感受態(tài)細(xì)

32、胞移入滅菌處理后的試管內(nèi)； (2)加入1 01xl重組pSIREN-RetroQ-ZsGreen-EphB4質(zhì)粒； (3)冰中放置30分鐘；(4)42。C放置45,-60秒；(5)冰中放置2"-'3分鐘； (6)加入37。C預(yù)溫好的LB培養(yǎng)基，使終體積為lml； (7)37"C下以160"-225rpm振蕩培養(yǎng)1小時(shí)； (8)涂布瓊脂平板培養(yǎng)基；(9)37"C過夜培養(yǎng)。 45按堿裂解法抽提質(zhì)粒 按質(zhì)粒抽提試劑盒的步驟如下：(1)吸附柱加入500tl平衡液，以13000rpm離心lmin；9(2)5"-'15rra過夜培養(yǎng)的菌液，

33、分次加到15ml離心管中，以13000rpm離心 lmin，倒掉上清；(3)往留有菌體沉淀物的離心管中加入5001al P1溶液(已加入RNase A)，用渦 旋振蕩器去沉淀細(xì)菌；(4)往離心管內(nèi)加入P2溶液，上下翻轉(zhuǎn)57次，時(shí)間不超過4min，再往離心 管內(nèi)加入溶液P3，上下翻57次，充分混勻，出現(xiàn)白色的絮狀沉淀，以13000rpm離心10min，吸取上清到另一個(gè)離心管；(5)將上清液分次轉(zhuǎn)入到過濾柱里，以1 3000rpm離心2min，把收集到的溶液 轉(zhuǎn)移到干凈的管里；(6)把收集到得溶液分兩次加到吸附柱里，以13000rpm離心lmin，把收集管 的廢液倒掉；(7)往吸附柱里加入5001

34、,tl的去蛋白液，以13000rpm離心1min，把收集管的廢 液倒掉；(8)往吸附柱里加入7009l的漂洗液，以13000rpm離心1min，倒掉收集管內(nèi)的 廢液，再往吸附柱里加入500111的漂洗液，以13000rpm離心lmin，把收集管內(nèi)的 廢液倒掉；(9)把吸附柱放回到收集管內(nèi)，以13000rpm離心2min，除掉吸附柱上的廢液，在室溫下晾干乙醇；(10)把吸附柱放到離心管中，往吸附膜滴加2001tl洗脫緩沖液，室溫下放置 2min，以13000rpm離心lmin，把質(zhì)粒收集入離心管里：(11)取出51tl得到的質(zhì)粒溶液，將其稀釋后，用紫外分光光度計(jì)測(cè)OD值，粗 略定量，用-20冰箱

35、保存，待用。46陽性克隆篩選與測(cè)序鑒定461陽性克隆篩選 從干擾質(zhì)粒和陰性對(duì)照質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化平板上各挑取8個(gè)單菌落，用引物pSIRENF3P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1瓊脂糖凝膠電泳。表1-2引物序列462測(cè)序鑒定 把重組質(zhì)粒送交寶生物工程(大連)有限公司測(cè)序，以便鑒定序列的準(zhǔn)確性。lO經(jīng)測(cè)序確認(rèn)的siRNA表達(dá)載體命名為pSIRENRetroQZsGreen-EphB4，陰性對(duì)照質(zhì)粒命名為pSIRENRetroQ-ZsGreen-N。結(jié)果1、陽性克隆篩選 各挑取8個(gè)單菌落，用引物pSIRENF3P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1瓊脂糖凝膠電泳圖片(圖12)，中間六條帶的孔是DNA Marker，左側(cè)8個(gè)孔是干擾質(zhì)粒

36、，右側(cè)8個(gè)孔是陰性對(duì)照質(zhì)粒，PCR擴(kuò)增為單一條帶，大小約為284bp。12345678M12345678圖I-2質(zhì)粒PCR產(chǎn)物2、重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果 將重組干擾質(zhì)粒和陰性對(duì)照質(zhì)粒測(cè)序，測(cè)得的結(jié)果與設(shè)計(jì)序列完全相符合，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。截取部分測(cè)序結(jié)果如圖(圖13)。A圖13質(zhì)粒測(cè)序圖譜A：pSIRENRe仃oQ-ZsGreen-EphB4；B：pSIREN·RetroQ-ZsGreen-N討論EphB4受體是酪氨酸蛋白激酶受體亞家族中的其中一員，它通過雙向信號(hào)途 徑與鄰近的內(nèi)皮細(xì)胞上的配體互相作用，促進(jìn)了血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管 腔形成。RNAi是近幾年新興的基因沉默技術(shù)。它通

37、過外源性或內(nèi)源性的雙鏈RNA (dsRNA)，特異性結(jié)合了與dsRNA序列互補(bǔ)的mRNA，誘導(dǎo)該mRNA的降解， 沉默該基因的表達(dá)。因?yàn)镽NAi作用在轉(zhuǎn)錄后水平，所以被稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默 (PTGS)。目前，發(fā)揮這種生理功能的物質(zhì)被認(rèn)為是小干擾RNA(siRNA)，即長(zhǎng) 度是2123個(gè)堿基的雙鏈小RNA，是較長(zhǎng)的dsRNA被Dicer酶切割后形成的，然 后siRNA和RNA酶結(jié)合，形成了RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(砒SC oRISC結(jié)合與siRNA12特異性互補(bǔ)的靶基因mRNA，接著核酸酶切割mRNA，使其無法進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，從而 抑制基因表達(dá)。siRNA序列的設(shè)計(jì)是RNAi中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，設(shè)計(jì)和篩選出有效

38、的siRNA序列 才能達(dá)到沉默基因表達(dá)的效果。siRNA序列的設(shè)計(jì)原則如下：1、由靶基因mRNA 的起始密碼開始，查詢到類似“AA”或者“NA”的序列，它們3端的1 9個(gè)堿基可以 成為siRNA的候選序列；2、候選序列中GC的含量最好在4555左右；3、排 除非編碼區(qū)的序列，這些序列含有較多調(diào)控蛋白結(jié)合的序列，會(huì)妨礙RISC結(jié)合 mRNA；4、避免出現(xiàn)GGG，免得影響了siRNA的解鏈；5、用BLAST比較選擇 好的序列，排除掉那些與其他編碼序列或EST同源的序列，以確保目的序列的特 異性。shRNA序列的設(shè)計(jì)也是RNAi的重要部分。設(shè)計(jì)shRNA的時(shí)候，要調(diào)整好它 的正義鏈及反義鏈的位置、拌

39、環(huán)堿基的序列及長(zhǎng)度等。研究表明【23J，正義鏈及反 義鏈的位置關(guān)系到siRNA能否成功形成以及RNAi能否達(dá)到預(yù)期的干擾效果。如 果把正義鏈放在shRNA的3端，由shRNA被Dicer酶作用后產(chǎn)生的siRNA可能無 法與靶基因互補(bǔ)結(jié)合，導(dǎo)致干擾失敗。Paddison24】等發(fā)現(xiàn)，由shRNA在細(xì)胞內(nèi)被 酶作用后形成的siRNA，干擾效果與直接合成好的siRNA是一樣的。siRNA的制備方法是RNAi技術(shù)的重要研究?jī)?nèi)容。現(xiàn)在常用的制備方法主要 有：體外轉(zhuǎn)錄法、體外消化法、化學(xué)合成法、表達(dá)框架法以及siRNA表達(dá)載體法。 體外轉(zhuǎn)錄法、體外消化法和化學(xué)合成法都是直接制備好siRNA，通過轉(zhuǎn)染等方法

40、 導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。但是，直接導(dǎo)入的siRNA穩(wěn)定性不夠，容易在短期內(nèi)被核酸酶降解， 對(duì)特異性mRNA的干擾時(shí)間短，所以其應(yīng)用范圍不大，目前主要應(yīng)用于siRNA的 篩選過程。siRNA表達(dá)框架法和表達(dá)載體法是利用轉(zhuǎn)錄元件或合適的載體，把 siRNA加入到它們中，轉(zhuǎn)染入細(xì)胞內(nèi)，從而在細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)期穩(wěn)定地表達(dá)siRNA。目 前，最常用的是siRNA表達(dá)載體。Sui等f25】報(bào)道利用siRNA重組表達(dá)載體，在細(xì) 胞內(nèi)長(zhǎng)期穩(wěn)定地表達(dá)siRNA，下調(diào)靶基因表達(dá)的方法。表達(dá)載體需要合適的啟動(dòng) 子來啟動(dòng)siRNA的表達(dá)，現(xiàn)在我們多采用人源和鼠源的U6啟動(dòng)子以及人的H1 啟動(dòng)子的其中一種，它們都屬于RNA聚合酶III啟

41、動(dòng)子(pollII)26-301。本實(shí)驗(yàn)選擇構(gòu)建siRNA真核表達(dá)載體法獲得siRNA。本研究使用的 pSIRENRetroQZsGreen質(zhì)粒是一個(gè)真核表達(dá)質(zhì)粒，它含有Pu6啟動(dòng)子(Pu6 promoter)，能啟動(dòng)載體上的shRNA表達(dá)；它的PcMVIE啟動(dòng)子能夠使綠色熒光蛋 白轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)，觀察siRNA真核表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染效率；Amp抗性基因便于篩選陽性 克隆細(xì)菌。載體轉(zhuǎn)錄的終止以6個(gè)連續(xù)胸腺嘧啶(T)為終止信號(hào)。把BamHI和 EcoRI兩個(gè)酶切位點(diǎn)結(jié)合到shRNA序列的兩端，以便該序列連接到真核質(zhì)粒上的 BamHI和EcoRI之間。本實(shí)驗(yàn)把將外源性shRNA插入到pSIRENRetroQ

42、ZsGreen13質(zhì)粒的BamHI和EeoRI酶切位點(diǎn)之間，來構(gòu)建pSIRENRe仃oQZsGreenEphB4的 干擾載體。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的pSIRENRe仃oQZsGreen-EphB4干擾載體為下一步的基因轉(zhuǎn)染 和進(jìn)一步探索Epha4的基因功能奠定了基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明EphB4基因干擾質(zhì)粒 的序列正確，siRNA表達(dá)載體構(gòu)建成功，可以繼續(xù)進(jìn)行抑制EphB4基因表達(dá)后對(duì)胰腺癌細(xì)胞的影響的研究。14第二部分EphB4干擾質(zhì)粒對(duì)PANC一1細(xì)胞的影響刖舌EphB4受體能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，參與調(diào)控胚胎期血 管形成過程中的動(dòng)靜脈分化。但它的異常表達(dá)在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展中起到什么作用

43、，目前沒有相關(guān)的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建pSIRENRe仃oQZsGreenEphB4的干擾載 體并轉(zhuǎn)染PANC1細(xì)胞系，觀察下調(diào)EphB4基因表達(dá)后對(duì)胰腺癌PANC1細(xì)胞增 殖和遷移能力的影響，為胰腺癌在分子水平的診治提供基礎(chǔ)。材料與方法l、主要試劑和材料DMEM高糖培養(yǎng)基大連綠竹科技有限公司標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清大連綠竹科技有限公司胰酶大連綠竹科技有限公司Lipofectamine聊2000美國(guó)Invitrogen公司DEPC美國(guó)Sigma公司Trizol試劑美國(guó)GIBCO公司RT-PCR反應(yīng)試劑盒晶美生物公司DNA marker DL2000美國(guó)MBI公司EphB4一抗美國(guó)Bioworld公司 辣根酶標(biāo)記

44、山羊抗兔IgG北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司 ELC發(fā)光試劑盒上海普飛公司二十四孔板大連綠竹科技有限公司六孔板大連綠竹科技有限公司96孔培養(yǎng)板大連綠竹科技有限公司MTT大連綠竹科技有限公司DMSO大連綠竹科技有限公司目的基因與內(nèi)參引物寶生物大連有限公司 2、主要實(shí)驗(yàn)儀器熒光顯微鏡，酶標(biāo)儀，細(xì)胞培養(yǎng)箱，倒置顯微鏡，超凈工作臺(tái)，高速冷凍離 心機(jī)，臺(tái)式離心機(jī)，一80超低溫冰箱，恒溫水浴箱，37"C溫箱，溫控?fù)u床，凝 膠成像系統(tǒng)，電子天平，PCR儀，DNA電泳儀。3、質(zhì)粒 為第一部分成功構(gòu)建的重組質(zhì)粒載體pSIRENRetroQZsGreenEphB4、pSIREN-RetroQ·Z

45、sGreen-N。4、細(xì)胞系 人胰腺癌PANC1細(xì)胞系購(gòu)自中科院上海生化與細(xì)胞所細(xì)胞庫(kù)。 5、實(shí)驗(yàn)方法51胰腺癌PANC1細(xì)胞培養(yǎng)、傳代、凍存和復(fù)蘇 人胰腺癌PANC1細(xì)胞，培養(yǎng)體系為含10FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基，于37、10C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。511細(xì)胞傳代(1)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，倒掉舊培養(yǎng)液，加PBS 5ml，洗3次，倒掉PBS； (2)加入適量胰酶(1-一2m1)，37下消化3min(在顯微鏡下看見細(xì)胞疏松，貼壁不緊可停止)；(3)加入3ml含1 0FBS的培養(yǎng)液來終止消化； (4)吹打，混勻，吸出加入離心管，離心1000rpm，8min，倒掉上清； (5)加入培養(yǎng)液，吹打，混勻

46、，制成單細(xì)胞懸液； (6)拿兩個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶，分別加入15ml含有10FBS的DMEM高糖培養(yǎng)液； (7)把第5步的細(xì)胞懸液分別加入兩個(gè)培養(yǎng)瓶中； (8)扭松培養(yǎng)瓶的瓶蓋，放置于37。C、10C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 512細(xì)胞凍存(1)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，倒掉舊培養(yǎng)液，加入PBS 5ml，洗3次，倒掉PBS； (2)加入胰酶(1"-2m1)，37。C下消化3min(顯微鏡下看見細(xì)胞疏松，貼壁不緊可停)；(3)至lJ超凈臺(tái)操作，加入3ml含10FBS的培養(yǎng)基去終止消化； (4)吹打，混勻，加入離心管，離心1000rpm，8min，倒掉上清液； (5)以7：2：1的比例各加入無血清培養(yǎng)基、

47、FBS及DMSO，配好凍存液，吸3ml凍存液加到離心管里，混勻，制成單細(xì)胞懸液； (6)細(xì)胞懸液加到兩個(gè)無菌的凍存管里，旋緊蓋子，用封口膜封口； (7)4。C放置30rain，一20放置30min，然后掛在液氮罐口過夜； (8)第二天投入液氮(一1 96。C)中，可長(zhǎng)期保存。513細(xì)胞復(fù)蘇 (1)從液氮罐中快速取出PANC1細(xì)胞的凍存管，放到己預(yù)熱好的37C水浴箱里，快速解凍，lmin內(nèi)完成，不要讓外來的液體進(jìn)入管內(nèi)，用75酒精棉球擦拭后，放入超凈臺(tái)；16(2)混勻，吸取細(xì)胞懸液到5ml培養(yǎng)液的離心管里，室溫下離心800rpm，5min， 倒掉上清；(3)加入2ml含有10FBS的DMEM高糖

48、培養(yǎng)液； (4)吹勻懸浮細(xì)胞，吸取混勻的細(xì)胞懸液到培養(yǎng)瓶中； (5)旋松培養(yǎng)瓶的瓶蓋，放到37。C、10C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； (6)第二日換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。52細(xì)胞轉(zhuǎn)染用脂質(zhì)體LipofectamineaM2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，在6孔板上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染前24h， 對(duì)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用胰酶消化后進(jìn)行計(jì)數(shù)，調(diào)整癌細(xì)胞的濃度，將5x105 個(gè)PANC1細(xì)胞接種至6孔板，用沒有抗生素的DMEM高糖培養(yǎng)基(含有10FBS) 培養(yǎng)24h后，使轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞融合度達(dá)60"-'80。按照脂質(zhì)體Lipofectaming刑2000 說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染：(1)轉(zhuǎn)染1h前將500p1無血清的DMEM高糖

49、培養(yǎng)液換至6孔板中； (2)40燼的質(zhì)?；煸?501d無血清DMEM高糖培養(yǎng)基中，輕輕搖勻；(3)把1 0111脂質(zhì)體Lipofectamine刑2000與250p1無血清DMEM高糖培養(yǎng)基混 合，輕輕搖勻，室溫下孵育5mira(4)5min后，把脂質(zhì)體與質(zhì)粒混合，室溫下孵育20min，使質(zhì)粒和脂質(zhì)體的復(fù) 合物充分形成；(5)6孔板中每孔加入500p1脂質(zhì)體一質(zhì)粒復(fù)合物，前后移動(dòng)培養(yǎng)板，與培養(yǎng)基混勻；(6)將培養(yǎng)板送入37。C、10C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；(7)4-一6h后更換含有1 0FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基，繼續(xù)在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培 養(yǎng)48h。53熒光顯微鏡檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率 將消毒處理后的蓋玻

50、片置于六孔板的孔底，5×105個(gè)PANC1細(xì)胞細(xì)胞懸液鋪于其上，24h后待細(xì)胞融合率達(dá)60",-80時(shí)，用脂質(zhì)體一質(zhì)粒復(fù)合物轉(zhuǎn)染細(xì)胞， 培養(yǎng)48h后，取出蓋玻片，用冰PBS洗2次，然后在熒光顯微鏡下觀察，照相保 存后用AdobePhotoshop CS軟件處理圖像，檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。54 RT-PCR檢測(cè)EphB4基因mRNA表達(dá)541 RNA的提取(1)取出6孔板，倒掉培養(yǎng)基，冰PBS洗滌23次；(2)裂解：每孔加入Iml Trizol試劑，在冰上反復(fù)吹打、混勻，移至EP管，冰浴10mira(3)分相：加入02ml氯仿，用力震蕩15s，室溫下靜置5min，在低溫高速離心17機(jī)

51、中以4"C、12000rpm離心10min，分為三層，上層為RNA相； (4)RNA沉淀：將上層移至新的EP管內(nèi)，加入05ml異丙醇，在一20下靜置3h，然后以4、14000rpm離心10min； (5)RNA清洗：吸干上清，加入70的乙醇05ml，以4"C、14000rpm離心5min； (6)RNA干燥：吸凈上清，勿觸及沉淀，置于超凈臺(tái)吹干，管底可見白色沉淀； (7)RNA再次溶解：加入101xl DEPC水溶解RNA，進(jìn)行RNA定量后置于一80保存。542總RNA的定量取2pl總RNA溶解于4981d DEPC處理水中，在紫外分光光度計(jì)上分別測(cè)定 260nm和280n

52、m處的吸光度。根據(jù)OD260和OD280兩者比值可以確定RNA的濃度 和純度，將總RNA的濃度調(diào)整為1I-tglxl分裝，置于-80"C長(zhǎng)期保存，用于RT-PCR的擴(kuò)增。543 RT-PCR檢測(cè)EphB4 mRNA的表達(dá)(1)逆轉(zhuǎn)錄至eDNA按照下列組成配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液MgCl2m1 0xRT BufferRNase Free dH20蔓7dNTP MixtureRNase Inhibitor仉 2AMV Reverse Transeriptase0L m吣m蛆UOligo dT-Adaptor Primer0L樣品RNATotal1 2卸卸卸卸c1n按照下列條件進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)423

53、0min995min55min共進(jìn)行1個(gè)循環(huán) (2)PCR反應(yīng)引物序列18按下列組成配制PCR反應(yīng)液5xPCR Buffer10山滅菌蒸餾水2875pl瑚<狀aExTaqHS0251xl上游特異性PCR引物05pl下游特異性PCR引物051xlTotal40Itl把PCR反應(yīng)液加入到逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)結(jié)束后的PCR管中，輕輕混勻；PCR反應(yīng)：95預(yù)變性5min，然后在95變性30s、55退火15s、72 延伸30s，以上三個(gè)步驟共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后720C延伸4min，將擴(kuò)增產(chǎn)物置于-20冰箱中保存或進(jìn)行2瓊脂糖凝膠電泳。 55 westernblot檢測(cè)EphB4基因蛋白的表達(dá) 551細(xì)胞蛋白的提取(1)轉(zhuǎn)染48h后倒掉培養(yǎng)液，每瓶細(xì)胞加入3ml已經(jīng)4預(yù)冷的PBS液(001M pH7273)，輕輕搖動(dòng)lmin，洗滌細(xì)胞，倒掉廢液。洗滌三次，把PBS液倒干凈 后，置培養(yǎng)瓶于冰上；(2)lml的裂解液加lO山的PMSF(100raM)，搖勻，放在冰上； (3)每一瓶細(xì)胞加入4009l含有PMSF的裂解液，放置于冰上30min，輕輕搖動(dòng)； (4)放在冰上，用干凈的刮棒快速把細(xì)胞刮到培養(yǎng)瓶的一側(cè)，把細(xì)胞碎片及裂解液移到EP管； (5)4"C下以12000rpm離心，5