2022年宏基因組測(cè)序mNGS臨床應(yīng)用進(jìn)展(全文)

1、2022 年宏基因組測(cè)序 mNGS 臨床應(yīng)用進(jìn)展(全文)推薦理由感染性疾病的病原體種類多樣，除常見的病原體外，罕見細(xì)菌、病毒、真 菌及寄生蟲等病原體不易被傳統(tǒng)的方法檢測(cè)，給臨床診斷帶來困難，導(dǎo)致 漏診和延誤，或造成抗生素藥物的濫用。近年來，隨著測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā) 展，二代測(cè)序( next-generation sequencing ，NGS )技術(shù)已逐步應(yīng)用 于感染性疾病的診斷、 治療和監(jiān)測(cè)。 宏基因組測(cè)序 ( metagenomics next generation sequencing ， mNGS )技術(shù)是對(duì)樣本中所有核酸進(jìn)行無偏倚 測(cè)序，結(jié)合病原微生物數(shù)據(jù)庫及特定算法，檢測(cè)樣本中含有的病

2、原微生物 序列，在病原微生物的鑒定、分型、耐藥突變檢測(cè)及新型病原體鑒定等方 面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和吸引力。早在 2014 年，美國(guó) Charles Chiu 教授首次應(yīng)用 mNGS 技術(shù)診斷了一例 神經(jīng)系統(tǒng)鉤端螺旋體病例 1 ，而這類疾病依靠常規(guī)檢測(cè)方法是難以檢出 的，此次應(yīng)用證實(shí)了 mNGS 技術(shù)在病原微生物鑒定領(lǐng)域，尤其是疑難微 生物鑒定方面的應(yīng)用潛能。隨著該技術(shù)的社會(huì)經(jīng)濟(jì)成本不斷降低和技術(shù)的 不斷完善， mNGS 已逐漸從科研走向臨床應(yīng)用， 成為臨床疑難和未知病原 微生物檢驗(yàn)的重要手段。 2020 年 12 月 13 日，復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院感 染病科的胡必杰教授團(tuán)隊(duì)在 Small Meth

3、ods 上( IF=12.13 )發(fā)表了一篇 題 為 “ High-ThroughputMetagenomics for Identification ofPathogens in the Clinical Settings的綜述，對(duì)高通量測(cè)序技術(shù)在感染病原檢測(cè)方面的應(yīng)用進(jìn)行了詳細(xì)地闡述，特摘綜述的部分節(jié)選，以饗讀者smallmetHn REVIEW高通量測(cè)序技術(shù)在臨床診斷的應(yīng)用說MarW*-W.3J71ilri Eethodl.宅 Dfiu p 和廠High*Through put Metagenomics for Identification of Pathogens in the Cli

4、nical SettingsNo Lj, Q/jigqing 3, Qmg MitJQ Zes hi 5ong, Ybtn fio昭Bijic Hu 育高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)展歷程2測(cè)序技術(shù)面世至今，測(cè)序技術(shù)和測(cè)序平臺(tái)不斷更迭，而且測(cè)序讀長(zhǎng)不斷加 長(zhǎng)、通量不斷提升、時(shí)間不斷縮短。1977年出現(xiàn)了以San ger測(cè)序技術(shù)3 為代表的一代測(cè)序，其主要特點(diǎn)是測(cè)序讀長(zhǎng)長(zhǎng)（可達(dá)lOOObp ），準(zhǔn)確性高。然而，一代測(cè)序由于測(cè)序成本高，通量低等方面的缺點(diǎn)，嚴(yán)重影響了其真正大規(guī)模的應(yīng)用?，F(xiàn)階段，二代測(cè)序（NGS，技術(shù)大大降低了測(cè)序成本，大幅提高了測(cè)序速 度，并且保持了咼準(zhǔn)確性。但是，NGS存在序列讀長(zhǎng)短、后續(xù)的分

5、析依賴 于片段拼接可能影響準(zhǔn)確度以及測(cè)序運(yùn)行時(shí)間較長(zhǎng)的問題。因此，二代測(cè) 序仍有改進(jìn)的空間。三代測(cè)序技術(shù)又稱單分子測(cè)序技術(shù)，與NGS相比，三代測(cè)序技術(shù)每秒可檢測(cè)10個(gè)核苷酸，大大縮短了測(cè)序時(shí)間。此外，三代測(cè)序可實(shí)現(xiàn)DNA/RNA直接測(cè)序、無需PCR擴(kuò)增以及無GC偏好性的優(yōu)點(diǎn)。盡管第三代測(cè)序具有 諸多優(yōu)勢(shì)，但由于其錯(cuò)誤率高、成本高，目前仍未在臨床應(yīng)用中得到廣泛 應(yīng)用平臺(tái)'方法方式優(yōu)勢(shì)二代T序lllunna MtSeq邊臺(tái)戰(zhàn)ISO, 2 MPE測(cè)序運(yùn)右時(shí)曜24 36hT遇.誼lllumig N«KtS*q5W55O75J509E. PE利序遠(yuǎn)行時(shí)間Tl-»hUlMHim

6、a4QQ012S.150PE測(cè)序運(yùn)行討殛MilMLmtna NovaSeq 600150PE測(cè)序運(yùn)行陽同40HBGISEQ-50耽含味甘讀世聖耆技木 （cPAS札曲進(jìn)的DMA50SE雀本低+時(shí)洱EX尸薦 瞰注褂證BGISEO-tOO50SEMGISEQ 2CD0100PE三代劃序PacEko Sequel單歸尹實(shí)時(shí)測(cè)序<MRT>M.8kbSEDxfflcdMk-iION 聯(lián)-'L 即字技術(shù)f1D濃厝測(cè)即港堆快表1.病原微生物高通量測(cè)序平臺(tái)參數(shù)匯總2高通量測(cè)序檢測(cè)流程mNGS分為兩個(gè)技術(shù)環(huán)節(jié)，即實(shí)驗(yàn)操作環(huán)節(jié)（也稱“濕實(shí)驗(yàn)”），和之后的 生物信息學(xué)分析環(huán)節(jié)（也稱“干實(shí)驗(yàn)”）。濕

7、實(shí)驗(yàn)包括臨床樣品處理、文庫制 備和測(cè)序步驟；而之后的生物信息學(xué)分析是mNGS中的重要部分，是對(duì)測(cè)序產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，包括但不限于數(shù)據(jù)質(zhì)控、人源序列 比對(duì)過濾、微生物物種鑒定等過程2 o所以就具體操作流程而言，mNGS 主要包括對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行核酸提取（ DNA提取和RNA反轉(zhuǎn)錄）、文庫構(gòu) 建、上機(jī)測(cè)序、數(shù)據(jù)處理和結(jié)果解釋等步驟4 o圖1. mNGS在臨床應(yīng)用中的測(cè)序流程2mNGS 在不同系統(tǒng)感染中的應(yīng)用血液系統(tǒng)感染近十年間，對(duì)引發(fā)膿毒癥的感染病原體研究發(fā)現(xiàn)，各種感染性病原體在膿 毒癥中所占的比例不同，盡管由革蘭氏陰性菌、厭氧菌和真菌感染導(dǎo)致膿 毒癥的報(bào)道屢見不鮮，但是革蘭氏陽性菌仍然

8、是最常見病原菌。然而，目 前仍有約 5O% 的膿毒癥患者其致病菌不明確， 即培養(yǎng)陰性膿毒癥。 尤其是 急性感染和重癥膿毒癥患者如未能及時(shí)進(jìn)行有效的抗生素治療，則病死率 高，此類患者急需在短時(shí)間內(nèi)明確致病病原菌。因此，臨床迫切需要快速 和靈敏的病原微生物診斷技術(shù)。多個(gè)病例報(bào)告和研究表明，血漿中循環(huán)或非循環(huán)病原體的無細(xì)胞病原體DNA 或 RNA 可能與感染有關(guān)， mNGS 技術(shù)通過對(duì)血液樣本中的游離 DNA(cfDNA) 或游離 RNA(cfRNA) 進(jìn)行測(cè)序， 可鑒定病原體。多項(xiàng)研究報(bào) 道提示， mNGS 與血培養(yǎng)結(jié)果的一致性達(dá) 93.7% ，在鑒定膿毒癥致病菌 方面比其他檢測(cè)方法更有效。 而且

9、， mNGS 測(cè)序總體檢測(cè)陽性率高于培養(yǎng)， 可以識(shí)別出傳統(tǒng)培養(yǎng)方法遺漏的潛在細(xì)菌病原體。值得注意的是，雖然健康人血液通常被認(rèn)為是無菌環(huán)境，但偶爾也能檢測(cè) 到細(xì)菌 DNA ，盡管如此，健康人與膿毒癥患者血液病原菌的組成還是存 在顯著差異。研究表明，在健康人血液中檢測(cè)到厭氧菌居多，其中大多數(shù) 是雙歧桿菌類細(xì)菌， 而膿毒癥患者血液中， 大部分為需氧或微需氧微生物 因此，雖然在健康人血液中檢測(cè)到細(xì)菌 DNA ，提示細(xì)菌進(jìn)入血液系統(tǒng)中， 但其并不總是導(dǎo)致敗血癥。 上述研究結(jié)果有助于對(duì)疑似膿毒癥患者 mNGS 檢測(cè)結(jié)果的解讀。綜上所述， mNGS 對(duì)病毒、結(jié)核、厭氧菌、真菌和寄生蟲，以及混合感染 診斷方面

10、優(yōu)勢(shì)明顯，對(duì)抗菌藥物的治療方案具有指導(dǎo)意義，可以有效避免 血流感染患者的抗生素濫用，與此同時(shí)， mNGS 檢測(cè)時(shí)間可縮短至 24 小 時(shí)，大大提高患者生存率。中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染 2感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)的病原體種類多樣，其癥狀包括腦膜炎、腦炎和膿腫， 往往威脅患者生命。然而，傳統(tǒng)病原體檢測(cè)方法尚不能有效涵蓋臨床感染 性疾病的病原譜， 尤其是罕見病原體。 此外， CNS 感染性疾病確診的依據(jù) 在于從腦實(shí)質(zhì)或腦脊液（CSF）內(nèi)檢測(cè)到病原微生物，但是由于腦脊液和 腦組織樣本取材相對(duì)困難，且標(biāo)本量小，限制了 CNS 感染性疾病病原體 的檢出。因此， CNS 感染患者往往未能查出病因，尤其在急性腦膜腦炎患 者中

11、高達(dá) 50% ，臨床迫切需要快速、準(zhǔn)確的診斷技術(shù)。近十年來， mNGS 在臨床感染性疾病的診斷中顯示出了極大的潛在價(jià)值。目前已有多個(gè)病例報(bào)道應(yīng)用 mNGS 技術(shù)從腦脊液和腦組織中鑒定出病毒、細(xì)菌、真菌、寄生蟲等，并表明 mNGS 在診斷難度較大的亞急性或慢性 腦膜炎病例中具有突出價(jià)值。研究表明，在CNS細(xì)菌性感染中，mNGS比傳統(tǒng)檢測(cè)方法的總體檢出率更高，但仍不能取代細(xì)菌培養(yǎng)等傳統(tǒng)檢測(cè)方 法，建議將 mNGS 與常規(guī)微生物學(xué)檢測(cè)結(jié)合使用，從而提高致病菌的檢 出率。mNGS在結(jié)核性腦膜炎（TBM ）患者CSF的檢測(cè)中具有較高的靈 敏度、特異性和陽性預(yù)測(cè)值（ PPV）o mNGS 的敏感性顯著高于

12、傳統(tǒng)培養(yǎng) 法，并且mNGS與常規(guī)方法相結(jié)合可以最大限度地提高TBM的檢出率。上述結(jié)果表明，mNGS可作為TBM診斷的前沿診斷工具。在真菌檢測(cè)方 面， mNGS 在診斷隱球菌性腦膜炎和腦曲霉病中的敏感性分別為 76.92 和80 %，與傳統(tǒng)檢測(cè)方法結(jié)合也可顯著提高檢出率。在CNS病毒感染中，同時(shí)進(jìn)行DNA和RNA測(cè)序可以提高CSF品中病毒的檢出率。除此之外， mNGS 技術(shù)在檢測(cè)診斷困難和少見的病原體上也呈現(xiàn)了巨大的優(yōu)勢(shì)， 如單 核細(xì)胞增多性李斯特菌、布魯氏菌、福氏耐格里阿米巴、腦囊蟲以及創(chuàng)傷 弧菌。mNGS 另一個(gè)應(yīng)用前景是鑒別傳染性和非傳染性病因， 并且?guī)椭R床指導(dǎo) 用藥。腦脊液 mNGS可

13、看做在自身免疫性疾病確診之前，排除廣譜潛在 CNS傳染病的適當(dāng)工具。與培養(yǎng)法相比 mNGS受抗生素藥物影響更小， 但如果患者在腦脊液采樣之前接受抗菌治療時(shí)間延長(zhǎng)，那么 mNGS 的檢 出率將顯著下降。此外，mNGS半定量可協(xié)助臨床監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展和治療效 果，但由于 mNGS 存在假陰性的可能， 對(duì)于 mNGS 檢測(cè)結(jié)果陰性的情況， 仍需謹(jǐn)慎對(duì)待。綜上所述， mNGS 在結(jié)核、 真菌以及罕見病原體方面具有突出優(yōu)勢(shì)、 受抗生素影響小、可進(jìn)行傳染性和非傳染性病因的鑒別。因此，推薦mNGS可作為慢性和復(fù)發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的一線診斷方法，急性腦炎病例的二線診斷方法。呼吸系統(tǒng)感染 2上呼吸道感染和下呼吸道

14、感染是臨床常見病，也是造成免疫抑制人群死亡 的重要因素。呼吸道感染是由病毒、細(xì)菌、真菌和寄生蟲等多種病原體感 染所致，感染的病情輕重不一，嚴(yán)重者亦可導(dǎo)致肺炎。毫無疑問，病原檢 測(cè)和鑒定對(duì)于精確治療和改善患者預(yù)后至關(guān)重要，但是呼吸道感染患者常 接受經(jīng)驗(yàn)性廣譜性抗生素治療，如頻繁和不適當(dāng)?shù)厥褂每股貢?huì)限制培養(yǎng) 法檢測(cè)的敏感性和準(zhǔn)確性。宏基因組測(cè)序技術(shù)無需預(yù)先假設(shè)，可一次性檢測(cè)多種病原體，并且多項(xiàng)臨 床研究已經(jīng)證明了其可以快速、準(zhǔn)確的協(xié)助診斷肺部復(fù)雜感染和重癥感 染。眾所周知， 細(xì)菌是下呼吸道感染最常見的致病菌， 例如銅綠假單胞菌、 肺炎克雷伯菌、 鮑曼不動(dòng)桿菌， 除上述細(xì)菌以外， mNGS 與傳統(tǒng)

15、的培養(yǎng)方 法相比可以鑒定出更多的細(xì)菌，包括結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（ MTB ）、非結(jié) 核分枝桿菌（ NTM ）、諾卡氏菌和各種放線菌。此外， mNGS 在輔助肺部 侵襲性真菌感染、肺部混合性感染和重癥無反應(yīng)性肺炎診斷方面也具有一 定的價(jià)值， 尤其在免疫功能低下患者的研究中， mNGS 的檢測(cè)準(zhǔn)確率甚至可以達(dá)到 100 mNGS 在新發(fā)病原體檢測(cè)方面的優(yōu)勢(shì)及應(yīng)用價(jià)值毋庸置疑， 尤其對(duì)呼吸道 病毒（例如 SARS-CoV ， MERS-CoV 和 H7N9 ）的檢測(cè)， mNGS 可作為 助力疫情跟蹤和監(jiān)控的有效方法。此外， mNGS 對(duì)不同呼吸道標(biāo)本類型的檢測(cè)靈敏度也存在差異。 mNGS 在外周肺感染

16、性病變的診斷中，經(jīng)支氣管鏡肺活檢（TBLB）組織樣本的特異性要高于肺泡灌洗液（BALF）樣本，但是BALF樣本的敏感性更高；在 痰液和組織樣本類型中， mNGS 檢測(cè)與培養(yǎng)法相比具有更高的靈敏度。 就 目前的報(bào)道來看， mNGS 檢測(cè)的總體靈敏度在不同的呼吸道樣本中差異不 顯著。雖然在常見細(xì)菌檢測(cè)方面 mNGS 的靈敏度并不優(yōu)于培養(yǎng)法，但是， mNGS 在結(jié)核，真菌，病毒和厭氧菌診斷方面優(yōu)勢(shì)更明顯。骨和關(guān)節(jié)感染 2在人工關(guān)節(jié)置換術(shù)和人工關(guān)節(jié)翻修手術(shù)后可能引發(fā)骨和關(guān)節(jié)感染（boneand joint infection ， BJI）， BJI 有較高的致病率，特別假體關(guān)節(jié)周圍感染（peripro

17、sthetic joint infection，PJI）可引發(fā)嚴(yán)重的并發(fā)癥。然而，關(guān)節(jié)感染患者往往臨床細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果為陰性，陰性結(jié)果不僅影響臨床抗生素 的使用，而且無法明確病因，對(duì)患者和醫(yī)生造成困擾。mNGS 是提高 BJI 診斷效率的有效補(bǔ)充方法，檢測(cè)樣本類型包括滑膜液、 植入物的超聲清洗液以及假體周圍的組織。值得注意的是，檢測(cè)超聲清洗 液可能比滑膜液更有利于區(qū)分主要致病菌和污染菌。因?yàn)橹虏【ǔ４嬖?于假體表面的生物膜中，超聲處理可以裂解植入物表面的生物膜，從而提 高樣本中致病菌豐度。綜上所述，推薦微生物培養(yǎng)結(jié)果為陰性、經(jīng)驗(yàn)性抗 菌藥物治療效果不佳以及清創(chuàng)效果差的患者使用 mNGS 進(jìn)行病原

18、檢測(cè)。尿路感染 2尿路感染（ urinary tract infections ，UTI ）是常見的社區(qū)獲得性感染，可 致尿路感染的病原體有細(xì)菌、真菌及病毒（即多瘤病毒和人皰疹病毒） 。 其中大腸埃希菌是最常見致病菌（約占 75 ），常見于復(fù)雜性尿路感染和 非復(fù)雜性尿路感染，而復(fù)雜性尿路感染可由多種細(xì)菌感染所致，大大增加 了病原體檢測(cè)的難度。 mNGS 不依賴培養(yǎng)技術(shù)， 以其檢測(cè)速度快、 靈敏度 高等明顯優(yōu)勢(shì)，為臨床醫(yī)生提供精準(zhǔn)診療的依據(jù)。此外，尿液檢測(cè)中的限制點(diǎn)在于報(bào)告解讀難度大，原因包括：尿液樣本 采集前和采集后不正確的取樣方式，均容易污染樣本。遠(yuǎn)端尿道、尿道 周圍皮膚以及陰道定植菌會(huì)干擾

19、報(bào)告判讀，因?yàn)閷?duì)免疫功能低下的患者， 某些條件致病菌也可能會(huì)引起疾病。患者可能經(jīng)常出現(xiàn)無癥狀持久性或 潛伏性的感染。因此，明確尿路感染的病因，需要有經(jīng)驗(yàn)的臨床醫(yī)生參與 解讀。消化系統(tǒng)感染 2 消化系統(tǒng)感染主要為胃腸道感染，主要致病細(xì)菌包括源自外部環(huán)境的侵入性腸致病菌和正常腸道共生菌。人體消化道內(nèi)有很多共生定植細(xì)菌，近年 來，腸道微生物菌群已成為研究的熱點(diǎn)。然而mNGS在腸道致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用較少，主要應(yīng)用于糞便樣品中非細(xì)菌（例如輪狀病毒A，隱孢子蟲和人副腸弧病毒） 、急性膽囊炎患者致病菌、罕見病毒以及急性肝衰竭 患者的合并感染的檢測(cè)。此外，mNGS在腸道病原菌耐藥基因檢測(cè)方面也 具有重要的價(jià)值

20、。復(fù)雜和非典型的病原體感染 2許多病例研究已經(jīng)證明了 mNGS在多方面的優(yōu)越性，包括：鑒定復(fù)雜 和非典型病原體感染方面，如鸚鵡熱衣原體、軍團(tuán)菌屬以及難培養(yǎng)的厭氧 菌和分枝桿菌；人畜共患病原體，如豬鏈球菌、恙蟲病東方體、鉤端螺 旋體和弓形蟲；新發(fā) RNA和DNA病毒，如博卡病毒、埃博拉病毒、 寨卡病毒、基孔肯雅病毒和新型冠狀病毒等?？偨Y(jié)多個(gè)文獻(xiàn)報(bào)道已證明，mNGS應(yīng)用于臨床診斷方面具有明顯優(yōu)勢(shì)。 在眾多 的分子檢測(cè)手段中， mNGS 作為一種全面直接的檢測(cè)方法， 雖然存在經(jīng)濟(jì) 成本等問題，使 mNGS 很難在短期內(nèi)成為臨床一線檢測(cè)手段，但在傳統(tǒng) 微生物檢驗(yàn)陰性、經(jīng)驗(yàn)治療失敗、疑難雜癥、不明原因的危重癥、免疫缺陷等特殊患者人群以及新發(fā)突發(fā)傳染病的診斷中仍是一種非常高效的病原體篩查方法5。盡管如此，各種檢測(cè)策略各有所長(zhǎng)，mNG