T細胞亞群細胞內因子檢測

1、T細胞亞群細胞內因子IFN-Y/IL-4檢測方法流式細胞儀（BeckmanCoulter,貝克曼庫爾特）原理：直接免疫熒光法。肝素鈉抗凝全血在PMAIonomycin和Monensin存在下短期培養(yǎng)（輔助性T細胞通過細胞因子IFN-丫、IL-4的產生分為Thl、Th2兩個亞群。淋巴細胞活化以后才分泌細胞因子，且迅速分泌到細胞外。因此，利用刺激劑PMA+Ionomycin體外激活淋巴細胞，然后用蛋白轉運抑制劑Monensin阻止細胞因子分泌到細胞外，使細胞因子在細胞內滯留到一定的量），然后進行細胞膜表面抗原和細胞內細胞因子染色，使用流式細胞儀對CD4+ffl胞內的IFN-丫和IL-4進行測定?！?/p>

2、本采集與處理受檢者的準備檢查對象生活飲食處于日常狀態(tài)，空腹采血。采集部位靜脈采血抗凝劑EDTA或肝素抗凝血要求1.樣本量至少1ml。2.樣本應在采集后6小時內處理，冷凍的標本不能用。3.樣本白細胞計數應在4.0-10.0X109/L之間。若10.0X109/L,樣本需要稀釋，用PBSffi釋；若4.0X109/L,應分離單個核細胞。4.溶血樣本不能用。試齊I淋巴細胞培養(yǎng)體系（自配）成分：刺激素PMA離子霉素、莫能霉素、小牛血清、1640液。選白美國SIGM慫司。單克隆抗體CD4PC5IL-4-PE、IFN-丫-FITC選自美國BeckmanCoulter公司。質控品BEKAMANCOULTER

3、&,未開瓶的試劑于2-8C保存，可在有效期內保持穩(wěn)定， 稀釋的試劑于2-8C可穩(wěn)定2周；每天校準一次：遇特殊情況隨時進行校準。儀器BeckmanCoulterEPICSXL/FC500/Altra操作：工田胞培養(yǎng)與染色取200ul抗凝血加入lOulCD4-PC邪抗， 室溫避光孵育30分鐘，RPMI1640洗滌一次，將細胞加入培養(yǎng)體系中，5%CQ37c孵育18小時，取出后以PBSM一次。用專用細胞內因子試劑進行細胞固定、透膜。將細胞分成兩管，其一為測定管加入抗人IL-4-PE和IFN-Y-FITC,另一管加入同型對照，室溫避光20分鐘，PBSSfc滌一次，待測。W式細胞儀測定打開流式細胞

4、儀及氮激光光源（488nm）預熱20min,同時儀器自動初始化；用標準熒光微球校正光路和流路，然后依次檢測標本，每份標本檢測50000以上細胞，在前向散射光（FS）和測向散射光（SSC）散點圖中圈定淋巴細胞群，然后分析CD4陽性細胞中IL-4-PE和IFN-丫-FITC的表達。淋巴細胞在FS/SSC散點圖中位置，即A門內細胞；A門內CD4m性細月的,即B門內細胞； B門內TH細胞亞群分布：1區(qū)數值-Th1細胞（%）4區(qū)數值-Th2細胞（%）2區(qū)數值-Th0細胞（）報告結果報告百分數操作性能精密度批內五次重復CV方靈敏度5001000個熒光素分子正常參考值Th1（IFN-丫）：17.395.52

5、%Th2（IL-4）:1.500.44%ThO:0.510.26%臨床意義淋巴細胞均分泌多種細胞因子：Thl細胞主要分泌IL-2,IL-12,IFN-丫和TNF-b/a等，Th2細胞主要分泌IL-4.IL-5.IL-6,IFN-丫為Thl最特異分泌的細胞因子，IL-4為Th2最特異分泌的細胞因子，所以可根據分泌的細胞因子來區(qū)分Thl與Th20Thl為IFN-丫+,Th2為IL-4+。靜息狀態(tài)（人的正常生理狀態(tài)、即未受到任何刺激下Th0分化為Thl和Th2的能力非常弱，在外周血中僅含有極少量的Thl和Th2細胞，這時我們所能檢測的胞內的IFN-丫和IL-4也微乎其微。當Th細胞受到外界因素，如刺激素、病原體等刺激， 其中Th0即會向Thl或Th2大量分化， 此時我們檢測到的IFN-丫和IL-4也較多。本實驗的檢測實際上是檢測Th細胞對刺激素刺激的反應能力。方案（Protocol）II.Ml.Ml1*LUn1*LUni iIIItni|itni|ii iIJiui|iirmrn