smaf1基因的異位過表達(dá)對脂肪細(xì)胞3t3l1增殖和凋亡的影響_臨床醫(yī)學(xué)論文

1、SMAF1基因的異位過表達(dá)對脂肪細(xì)胞3T3L1增殖和凋亡的影響_臨床醫(yī)學(xué)論文SMAF1基因的異位過表達(dá)對脂肪細(xì)胞3T3L1增殖和凋亡的影響_臨床醫(yī)學(xué)論文作者：韓威 段佳慧 吳民瀘 林澤超 劉彥華【摘要】 目的 觀察一脂肪細(xì)胞特異性表達(dá)的新基因小脂肪細(xì)胞因子1(SMAF1)在小鼠脂肪前體細(xì)胞3T3L1中的異位表達(dá)對脂肪細(xì)胞增殖和凋亡的影響。方法 構(gòu)建小鼠SMAF1真核表達(dá)載體并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染3T3L1脂肪前體細(xì)胞以獲得永久異位表達(dá)SMAF1基因的細(xì)胞株，使用Western blot證實(shí)SMAF1基因的表達(dá)。體外培養(yǎng)SMAF13T3L1脂肪細(xì)胞，以MTT法檢測SMAF13T3L1脂肪細(xì)胞的增殖;用流式細(xì)

2、胞儀對SMAF13T3L1脂肪細(xì)胞進(jìn)行凋亡分析。結(jié)果 與對照相比，SMAF13T3L1脂肪細(xì)胞增殖明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.05);而SMAF13T3L1脂肪細(xì)胞凋亡分析結(jié)果與對照無顯著性差異。 結(jié)論 SMAF1基因在3T3L1中的異位性表達(dá)，對3T3L1前體脂肪細(xì)胞生長增殖有顯著的抑制作用，而對細(xì)胞凋亡無影響，提示SMAF1在脂肪細(xì)胞增殖分化中發(fā)揮一定的作用。 【關(guān)鍵詞】 SMAF1; 脂肪細(xì)胞; 異位表達(dá); 增殖; 凋亡【Abstract】 Objective To evaluate the effect of a novel adipocytespecific expressed

3、gene small adipocyte factor 1 (SMAF1) on proliferation and apoptosis of preadipcyte 3T3L1. Methods A permanent SMAF1 expression construct was established for stable transfection of 3T3L1 and formation of SMAF1 3T3L1 cell line. After invitro culturing of cells,both MTT method and flow cytometry were

4、used to detect and analyze the proliferation level and apoptosis progress respectively. Results Compared with control groups,SMAF1 3T3L1 cell line showed remarkable reduction in proliferation with statistical significance (0.05),while no notable difference in apoptosis between two cell lines. Conclu

5、sion The ectopic expression of SMAF1 in 3T3L1 preadipocyte might suppress proliferation without interfering apoptosis process.【Key words】 small adipocyte factor 1; preadipocytes; ectopic expression; proliferation; apoptosis肥胖癥與遺傳、中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常、內(nèi)分泌功能紊亂、代謝因素和營養(yǎng)因素不平衡等密切相關(guān)。1994年Zhang 等成功克隆了肥胖基因(ob gene，現(xiàn)稱為瘦素

6、基因)，并發(fā)現(xiàn)其表達(dá)產(chǎn)物瘦素(leptin)1;1995年，Tartaglia 等成功克隆了瘦素受體基因。迄今為止已陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了許多對肥胖有決定作用的基因2。2005年，Ronald Kahn等發(fā)現(xiàn)了褐色脂肪細(xì)胞早期發(fā)育所必需的基因網(wǎng)絡(luò)(374個(gè)基因)，并進(jìn)一步證實(shí)了在胰島素信號和褐色脂肪細(xì)胞控制之間存在著聯(lián)系，這一基因網(wǎng)絡(luò)的完整構(gòu)成的發(fā)現(xiàn)，為肥胖癥和糖尿病的臨床檢驗(yàn)和治療提供了一個(gè)重要藍(lán)圖3。最近研究顯示，在小鼠脂肪組織基因芯片篩選中，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)異于其他蛋白質(zhì)家族的具有約700堿基對/80氨基酸序列的潛在肥胖基因SMAF1小脂肪細(xì)胞因子1(small adipocyte factor 1)4。

7、SMAF1基因僅在脂肪細(xì)胞中特異性表達(dá)，在大鼠和小鼠培養(yǎng)的原代脂肪前體細(xì)胞中表達(dá)缺失;SMAF1基因表達(dá)和脂肪細(xì)胞基因表型呈現(xiàn)密切相關(guān);不僅如此，SMAF1基因在脂肪細(xì)胞中的mRNA水平和脂肪細(xì)胞成熟分化程度呈正相關(guān)。但目前對SMAF1基因在脂肪細(xì)胞增殖和凋亡過程中所起的作用尚不清楚。本研究主要以SMAF1基因在體外前體脂肪細(xì)胞中的異位性表達(dá)來闡明SMAF1基因?qū)χ炯?xì)胞增殖和凋亡的影響。1 材料與方法1.1 材料前體脂肪細(xì)胞3T3L1購自美國American Type Culture Collection(ATCC)公司。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶均購自美國GIBCO公司。胰島素、地

8、塞米松、12甲基22異丁基黃嘌呤(MIX) 、G418 購自德國Sigma 公司。pCNLXGFP真核表達(dá)質(zhì)粒購自美國Clonetech公司。限制性內(nèi)切酶Hind 和Bam H及T4連接酶均購自美國Invitrogen公司。 PCR試劑中Taq酶和dNTP購自美國PerkinElmer公司。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染試劑盒Fugene購自美國Roche Molecular Biochemicals公司。Western blot試劑中，兔多克隆抗HA抗體和HRP標(biāo)記的抗兔IgG單克隆抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司;ECL顯色劑購自美國Amersham公司。細(xì)胞生長檢測試劑使用瑞士

9、Roche公司生產(chǎn)的細(xì)胞增殖MTT試劑盒。細(xì)胞凋亡檢測試劑CaspSCREENTM Flowcytometric Apoptosis Detection Kit購自美國BioVision公司。1.2 方法1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、分化誘導(dǎo)和鑒定 前體脂肪細(xì)胞3T3L1采用DMEM高糖培養(yǎng)基加入10%胎牛血清，在5%二氧化碳、37 孵箱中生長，每兩天換液1次。待細(xì)胞生長至完全融合后兩天(d 0),開始誘導(dǎo)分化,將培養(yǎng)液換成含0.5 mmol/L MIX、1 mol/ L 地塞米松和5 mg/ L 胰島素的雞尾酒完全培養(yǎng)液; 48 h 后,撤去MIX 和地塞米松,使完全培養(yǎng)液中只含有5 mg/ L 胰

10、島素; 2 d后換液,撤去胰島素,使用不含有任何誘導(dǎo)劑的完全培養(yǎng)基; 以后每2 d換液1次,直至第10 d 95%以上細(xì)胞已分化為成熟的脂肪細(xì)胞。1.2.2 SMAF1真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和前體脂肪細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 在SMAF1編碼基因區(qū)設(shè)計(jì)引物并分別在Forward和Reverse端加入Hind 和Bam H的酶切位點(diǎn)識破序列：F5GAAAAGCTTGCCGCCATGAAGTACCCTCTGGTGCCTCTG3; R5ACAGGGATCCTCAAAGAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTACCAGTGGAGTCCGTCCTCCTCA3。以小鼠白色脂肪組織中分離的cDNA作為模板，應(yīng)

11、用PCR擴(kuò)增含有啟動子ATG并加入HAtag序列的全長SMAF1基因。PCR產(chǎn)物經(jīng)Hind 和Bam H雙酶切后插入pCNLXGFP表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)轉(zhuǎn)化、接種、抽提、測序鑒定正確后成為SMAF1pCNLXHA表達(dá)質(zhì)粒。使用Fugene 6 作為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染試劑將SMAF1pCNLXHA和陰性對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染3T3L1細(xì)胞，48 h 后用G418 篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株后Western 印記驗(yàn)證SMAF1HAtag的蛋白表達(dá)。1.2.3 細(xì)胞增殖和凋亡檢測 穩(wěn)定感染的SMAF13T3L1脂肪細(xì)胞株在100%達(dá)到生長融合點(diǎn)后再接種于96孔板中，密度為每孔5×102并在10% 胎牛血清和100 g/ml的G

12、418的培養(yǎng)液中培養(yǎng)(d 0)。未轉(zhuǎn)染的陰性脂肪細(xì)胞在相同條件下培養(yǎng)。使用細(xì)胞增殖MTT試劑盒在Fluoskan酶標(biāo)儀上機(jī)對細(xì)胞生長進(jìn)行測定，每隔24 h 1次，連續(xù) 7 d。細(xì)胞凋亡檢測采用流式細(xì)胞儀方法檢測，即在脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化后d 8 收集細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞數(shù)目為1×105/單位，按照廠家建議的操作步驟進(jìn)行反應(yīng)。最后上機(jī)(Coulter Flow Cytometry)在488/530 nm分析細(xì)胞caspase活性并得到細(xì)胞凋亡率(ratio)。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 10.0 對數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)以±s表示,以0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2 結(jié)果2.

13、1 SMAF1基因穩(wěn)定表達(dá)脂肪細(xì)胞的鑒定為驗(yàn)證SMAF1基因是否正確轉(zhuǎn)染到前體脂肪細(xì)胞，以保證SMAF1在3T3L1細(xì)胞中異位表達(dá)成功，本實(shí)驗(yàn)使用兔多克隆抗HA抗體進(jìn)行Western蛋白印記法發(fā)現(xiàn)SMAF1基因在SMAF13T3L1前體脂肪細(xì)胞中高表達(dá)，而在由表達(dá)載體pCNLXGFP轉(zhuǎn)染3T3L1前體脂肪細(xì)胞中未見表達(dá)提示穩(wěn)定轉(zhuǎn)染成功(見圖1)。2.2 SMAF1基因在3T3L1細(xì)胞中異位表達(dá)對前體脂肪細(xì)胞增殖的影響使用SMAF1pCNLXHA質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染3T3L1細(xì)胞并篩選后接種于96孔培養(yǎng)皿，每隔24 h連續(xù)7 d應(yīng)用MTT法對細(xì)胞增殖情況進(jìn)行測定。結(jié)果表明試驗(yàn)組細(xì)胞生長速度比無SMAF1

14、基因插入載體轉(zhuǎn)染的對照組明顯降低，提示SMAF1基因可能抑制前體脂肪細(xì)胞的增殖(見圖2)。2.3 SMAF1基因在3T3L1細(xì)胞中異位表達(dá)對前體脂肪細(xì)胞凋亡的影響穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的SMAF13T3L1細(xì)胞系在用經(jīng)典雞尾酒分化誘導(dǎo)后開始鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。觀察結(jié)果顯示試驗(yàn)組和對照組細(xì)胞形態(tài)均無明顯區(qū)別，均呈現(xiàn)細(xì)胞形狀變圓，胞內(nèi)脂滴出現(xiàn)并逐漸增多等脂肪細(xì)胞成熟化的現(xiàn)象。至分化第8 d收集細(xì)胞使用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞凋亡程度進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組和對照組細(xì)胞無顯著性差異提示SMAF1基因?qū)χ炯?xì)胞凋亡在體外試驗(yàn)無顯著作用(見圖3)。3 討論筆者建立了一個(gè)體外SMAF1異位表達(dá)3T3L1細(xì)胞株，旨在探討SMAF1基因

15、如何在分子水平調(diào)節(jié)和影響前體脂肪細(xì)胞分化增殖作用。作為一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的潛在和肥胖有關(guān)的基因，SMAF1特異性在脂肪組織中表達(dá)而在前體脂肪細(xì)胞中表達(dá)缺失，同時(shí)其在體外培養(yǎng)的前體脂肪細(xì)胞分化過程中和PPAR同步上調(diào)并大量表達(dá)4。 因此SMAF1基因完全可能對脂肪細(xì)胞增殖和分化過程中的分子信號傳導(dǎo)有著特殊的作用，其功能是對脂肪細(xì)胞的生長、分化和能量代謝的影響，可能通過對諸多具有復(fù)雜信號通路的肥胖基因進(jìn)行調(diào)控來實(shí)現(xiàn)。本研究發(fā)現(xiàn)SMAF1基因在3T3L1細(xì)胞中的異位表達(dá)能有效抑制3T3L1細(xì)胞的增殖而對細(xì)胞分化和凋亡未見有明顯的抑制作用。 有報(bào)道證實(shí)，對于準(zhǔn)備定向轉(zhuǎn)化成成熟脂肪細(xì)胞的前體脂肪細(xì)胞，首先要從細(xì)

16、胞周期中脫離出來才能再次接受脂肪分化因子的刺激，從而開始細(xì)胞分化5。前體脂肪細(xì)胞通常是在達(dá)到細(xì)胞生長融合點(diǎn)后通過細(xì)胞之間的相互作用，使細(xì)胞增殖發(fā)生停止現(xiàn)象6。而SMAF1基因的異位表達(dá)可能加大這種3T3L1細(xì)胞生長融合后的增殖終止現(xiàn)象，進(jìn)而使得細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期的G0/G1期。而其具體作用機(jī)理可能是部分地和脂肪細(xì)胞生長有關(guān)的信號通路產(chǎn)生作用從而抑制細(xì)胞的生長。其他研究證實(shí)，PPAR在前體脂肪細(xì)胞中的異位表達(dá)能對脂肪細(xì)胞分化有明顯的促進(jìn)作用7。 PPAR和具有高度親和力的TZD協(xié)同作用而成為十分有效的脂肪細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑。PPAR在對數(shù)生長期中的NIH3T3和3T3L1 細(xì)胞中異位表達(dá)足以促使這

17、些細(xì)胞生長停滯并能使這兩種細(xì)胞發(fā)生脂肪細(xì)胞分化作用8。PPAR不僅能夠阻止脂肪細(xì)胞的生長，誘發(fā)細(xì)胞分化的開始，還能維持成熟脂肪細(xì)胞的分化表型，表明其在調(diào)解脂肪細(xì)胞分化過程中起到關(guān)鍵作用9。 對SMAF1基因的前期研究表明SMAF1基因序列中具有和胞核激素受體特異性結(jié)合的NRbox;其表達(dá)在脂肪細(xì)胞分化過程中遞增并和包括PPAR等其他脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志物和脂肪聚集呈同步效應(yīng)提示SMAF1可能和PPAR協(xié)同作用對脂肪細(xì)胞增殖產(chǎn)生影響。細(xì)胞凋亡主要是以胞核中DNA caspase為主要的生化指標(biāo)。研究表明瘦素靜脈注射后能劇烈上調(diào)PPAR從而刺激脂肪細(xì)胞凋亡的啟動10。而PPAR又是脂肪細(xì)胞分化最重要的

18、啟動子之一。 SMAF1基因在3T3L1細(xì)胞中的異位表達(dá)對體外成熟脂肪細(xì)胞凋亡并無顯著作用提示此基因可能尚未和PPAR等轉(zhuǎn)錄基因協(xié)同作用影響脂肪細(xì)胞自然凋亡。綜上所述,脂肪細(xì)胞增殖和凋亡受多種基因和因子的影響。機(jī)體通過各種基因/因子的相互促進(jìn)或相互抑制調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞凋亡。SMAF1基因在脂肪細(xì)胞分化中所起作用還有待進(jìn)一步研究證實(shí)，而此基因和脂肪細(xì)胞增殖的影響可能和肥胖有關(guān)，從而為肥胖的治療提供了一個(gè)潛在的靶基因?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 Zhang Y,Proenca R,Friedman JM,et al. Positional cloning of the mouse obese gene and

19、its human homologueJ. Nature,1994,372(6505):425432.2 Tartaglia LA,Dembski M,Tepper RI,et al. Identification and expression cloning of a leptin receptor,OBRJ. Cell,1995,83:12631271.3 Gunton JE,Kulkarni RN,Kahn CR,et al. Loss of ARNT/HIF1b mediates altered gene expression and pancreatic islet dysfunct

20、ion in human type 2 diabetesJ. Cell,2005,122:337349.4 Kim JY,Tillison K,Smas CM. Cloning,expression,and differentiationdependent regulation of SMAF1 in adipogenesisJ. Biochem Biophys Res Commun,2005,326(1):3644.5 Gregoire FM,Smas CM,Sul HS. Understanding by adipocyte differentiationJ.Phy Siol Rev,1998,78:783809.6 Ailhaud G,Dani C,Grimaldi P,et al. Coupling growth arrest and adipocyte differentiationJ. Environ Health Perspect,1989