微生物測定方法

1、環(huán)境環(huán)境微生物新技術(shù)導師： 匯報人： 學號：Part1寫 下 大 標 題我所在課題組主要研究方向是： 景觀水體富營養(yǎng)化治理及水體修復與凈化技術(shù)故所關(guān)注的微生物主要與引起富營養(yǎng)化的藻類有關(guān)： 主要研究的藻類有：銅綠微囊藻、小球藻、偽魚腥藻、水華魚腥藻等。下面我就其中的 來做一些說明介紹。水華魚腥藻水華魚腥藻的圖片 水華魚腥藻 界門綱目科屬種植物界Alage 藍藻門Cyanophyta 藍藻綱 Cyanophyceae 念珠藻目Nostocales 念珠藻科Nostocales 魚腥藻屬Anabaena 水華魚腥藻 Anabaena aquae藍藻門 藍藻細胞無色素體和真正的細胞核等細胞器，繁殖方

2、式常為細胞分裂。常生長在各種水體或潮濕土壤、巖石、樹干及樹葉上，不少種類能在干旱的環(huán)境中生長繁殖。水生類群常在含氮較高，有機質(zhì)豐富的堿水體中生長。 藍藻能進行光合作用的自養(yǎng)型微生物，其大量生長可改變水體的理化環(huán)境，產(chǎn)生各種有害代謝產(chǎn)物，如毒素和異味物質(zhì)，給公眾健康帶來極大隱患，同時藍藻水華也給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)、供水及旅游業(yè)帶來極大的危害。 魚腥藻屬 植物體為單一絲體，或不定型膠質(zhì)塊，或柔軟膜塊；藻絲等寬或末端尖、直或不規(guī)則的螺旋狀彎曲；細胞球形，筒形；異形胞常為間位；孢子1個或幾個成串，緊靠異形胞或位于異形胞之間。水華魚腥藻 水華魚腥藻在國內(nèi)外發(fā)生的藍藻水華中經(jīng)常有報道。這是一種具有異形胞的絲狀體藍

3、藻，一般不能作為魚類餌料，有固氮的功能。 在春末、夏初、初秋時，此類藻常在湖沼、池塘大量繁殖，造成“水華”，引起水質(zhì)變臭，并且可產(chǎn)生藻毒素，對水生生物有毒害作用，破壞水生生態(tài)系統(tǒng)。故可作為水體發(fā)生富營養(yǎng)化的指標，研究其生長特征、生態(tài)生理功能及其環(huán)境效應對解決水體富營養(yǎng)化有重要意義！Part2寫 下 大 標 題 微生物主要包括原核微生物、真核微生物、病毒等三大類，由于多數(shù)微生物的個體較小，肉眼無法觀察 ，對其計數(shù)一般比較困難。此外，不同環(huán)境介質(zhì)中的微生物種類和特點，以及所處的環(huán)境條件不同，那么所采取的微生物數(shù)量測定方法也有所差異。對微生物計數(shù)的方法主要有三大類：總細胞計數(shù)法、活細胞計數(shù)法和微生物

4、生長量測定法 。一、方法概述總細胞計數(shù)法活細胞計數(shù)法 微生物生長 量計數(shù)法（1） 平板菌落計數(shù)法（2） 比濁法（3） 霉菌計數(shù)法3.1 凱氏定氮計數(shù)法3.2 DNA含量測定法 總細胞計數(shù)法 活細胞計數(shù)法 微生物生長量計數(shù)法（1）血細胞計數(shù)板計數(shù)法 （2）細菌計數(shù)板計數(shù)法 （3） 膜過濾計數(shù)法各方法的比較總結(jié)：血細胞計數(shù)板和細菌計數(shù)板：常用于測定單細胞或孢子 ,相對比較準確；顯微鏡直接計數(shù)法：不辨死活；膜過濾：用于測定細胞濃度很低的樣品 ,平板菌落計數(shù)：形成菌落的微生物，對多數(shù)微生物的測定都適用 ,相對復雜；比濁法：相對準確 ,但需要標準曲線，不用于顏色太深的樣品；凱氏定氮法和DNA含量測定法：

5、對微生物細胞內(nèi)含量相對穩(wěn)定的物質(zhì)進行定量測定 , 再算出細胞的數(shù)量 ,操作相對復雜。測定細胞總氮量或總碳量：適于濃度較高的樣品各方法的比較總結(jié)：（一）空氣中 空氣中沒有可為微生物直接利用的營養(yǎng)物質(zhì)和足夠的水分，它不是微生物生長繁殖的天然環(huán)境，因此空氣中沒有固定的微生物種類。它主要通過土壤塵埃、小水滴、人和動物體表的干燥脫落物、呼吸道的排泄物等方式被帶入空氣。由于微生物能產(chǎn)生各種休眠體，故可在空氣中存活相當長的時期而不至死亡。 空氣中微生物的種類，主要為真菌和細菌。其數(shù)量則取決于所處的環(huán)境和飛揚的塵埃量。 適用于空氣中微生物數(shù)量測定方法主要有：1.自然沉降法（沉降平板法）2.撞擊法 3.過濾法

6、4.液體撞擊法 二、空氣中微生物數(shù)量測定方法 ： 1.自然沉降法（沉降平板法） 根據(jù)空氣中攜有微生物氣溶膠粒子在地心引力作用下，以垂直的自然方式沉降到瓊脂培養(yǎng)基上，經(jīng)24h,37溫箱培養(yǎng)計算菌落數(shù)。 根據(jù)奧梅梁斯基建議，面積為100cm2的平板培養(yǎng)基，暴露于空氣中5min,于37溫箱培養(yǎng)24h后所生長的菌落數(shù)相當于10L空氣中的細菌數(shù)?？諝庵械募毦鷶?shù)（cfu/m3）=1000（100/A）(5/t)(1/10)N =50000N/(AT) A-平板面積cm2；T-暴露時間min；N-平均菌落數(shù)(cfu/皿) 特點：簡單方便，但穩(wěn)定性差，直徑15um的粒子在5min內(nèi)沉降距離有限，使小粒子采集效

7、率低。 二、空氣中微生物數(shù)量測定方法舉例 2.撞擊法 Anderson采樣器原理：多級篩孔型采樣器 由6個帶有微細針孔的金屬撞擊盤構(gòu)成，盤下放置有培養(yǎng)基的平皿，每個圓盤上有400個環(huán)形排列小孔，由上到下孔徑逐漸減小。氣流從頂罩進第一級，較小的粒子會由于動量不足隨氣流繞過平皿進入下一級。經(jīng)6次撞擊后，可把絕大部分的微生物采集下。 空氣含菌量(cfu/m3)=【六級采樣板的總菌數(shù)(cfu)28.3(L/min)采樣時間(min)】1000 ：a.采集粒譜范圍廣，一般在0.220um以上； b.采集效率高，逃逸少； c.微生物存活率高。 二、空氣中微生物數(shù)量測定方法特點 3.過濾法 使一定量的空氣通

8、過吸附劑（滅菌生理鹽水），然后培養(yǎng)吸附劑中的細菌，計算出菌落數(shù)。 4.液體撞擊法 和固體撞擊式采樣器一樣，是利用噴射氣流方式將空氣中的微生物粒子采集到小體積液體中，適用于高濃度的空氣微生物采樣。 二、空氣中微生物數(shù)量測定方法 （二）水樣樣中： 適用于水樣中微生物數(shù)量測定方法有： 三、水樣中微生物數(shù)量測定方法水樣中細菌 總數(shù)測定水中細菌活菌數(shù)測定分光光度計測定細菌數(shù)量1.直接計數(shù)法.染色涂片計數(shù)法3.比濁度法 1.平板菌落計數(shù)法 2.液體稀釋法 3.濾膜過濾計數(shù)法應用光電比色計或分光光度計測定（標準曲線） 標準平皿法測定水中細菌總數(shù)（1）采集水樣；（2）取10ml注入90ml無菌水的三角瓶中，混

9、勻成10-1稀釋液，注意吸水樣前，水樣及稀釋水應混合均勻；（3）吸取稀釋液1ml按10倍稀釋法稀釋成10-2、10-3、10-4等系列的稀釋度； (4)根據(jù)水樣潔凈程度，污染嚴重者選取10-2、10-3、10-4三個連續(xù)稀釋度，中等的選取10-1、10-2、10-3稀釋度。稀釋度的選擇是關(guān)鍵，選擇適宜，平皿上菌落總數(shù)介于30到300間；（5）吸取由高倍到低倍的稀釋液，每個稀釋液分別注入兩個培養(yǎng)皿，每皿1ml; (6)注入徹底融化且冷卻到45的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約15ml,立即旋搖培養(yǎng)皿，充分混勻。讓平皿培養(yǎng)基于水平位置至固化；（7）接種河水水樣的培養(yǎng)皿，倒置于37培養(yǎng)24h。接種海水水樣的培養(yǎng)皿則

10、置于1820培養(yǎng)5d(長出明顯菌落)； (8)根據(jù)菌落計算原則和方法計算。 三、水中微生物數(shù)量測定方法舉例 （三）土壤中： 土壤是最復雜、最豐富的微生物基因庫，所含微生物不僅數(shù)量巨大，而且各類繁多，主要包括細菌、真菌和放線菌三大類，是土壤最活躍的成分。適于土壤微生物數(shù)量測定方法可分為三大類： 四、土壤中微生物數(shù)量測定方法將土壤微生物染色后，在顯微鏡下觀察計數(shù)，稱為直接鏡檢法，包括:a.涂片法、 b.瓊脂薄片法 c.膜過濾法根據(jù)培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)來計算土壤微生物數(shù)量，統(tǒng)稱為培養(yǎng)計數(shù)法，主要有：a.稀釋平板法、 b.最大或然計數(shù)法直接將微生物從土壤中分離和提取出來后再進行測定，主要有離心分離法。

11、 1.稀釋平板法測定土壤中微生物數(shù)量（1）土壤系列稀釋液制備 ：取新鮮土壤（2）10.00g，放入裝有70ml水的廣口瓶中，在振蕩機上振蕩10min。迅速吸取10ml，放入滅菌的裝有90ml水的廣口瓶中，混合均勻。如此依次配制一系列土壤稀釋液。上述操作均在無菌條件下進行，以避免污染。（2）平板制備和培養(yǎng) ： 從兩個稀釋倍數(shù)的土壤稀釋液中吸取1.00ml，分別放入五套培養(yǎng)皿中；再向培養(yǎng)皿內(nèi)注入4550的培養(yǎng)基10ml，立即混合均勻，靜置凝固后，倒置放于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細菌和放線菌在28下培養(yǎng)710d，真菌在25下培養(yǎng)35d。（3）鏡檢計數(shù) ：用顯微鏡觀察，明顯有菌絲的一般是真菌，絲狀分枝，比較粗大

12、；而放線菌菌絲呈放射狀，較細。細菌有球狀和桿狀，酵母菌個體比較大，一般有圓形、橢圓形、卵形、檸檬形或黃瓜形，有些還有瘤狀芽。 在兩級稀釋度中，選細菌和放線菌菌落數(shù)為30200個、真菌菌落數(shù)為2040個的培養(yǎng)皿各5個，取其平均值計算出每組的菌落數(shù)。如果菌落很多，可將其分成24等份進行計數(shù)。微生物生物量可以通過微生物細胞個體大小和密度計算得到。4）計算 ：土壤微生物數(shù)量（cfu/g）=MD/W 式中: M為菌落平均數(shù)：D為稀釋倍數(shù)；W為土壤烘干質(zhì)量（g）。 四、土壤中微生物數(shù)量測定方法舉例 2.FDA染色涂片法測定土壤中活菌絲數(shù)（1）土壤分散 取10.00g新鮮土壤（2）于200ml三角瓶中，加入95 ml 0.06 molL-1磷酸鹽緩沖溶液，充分振蕩1