中藥黃連有效成分鹽酸小檗堿與牛血清白蛋白的相互作用

1、Vol.25高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)No.112004年11月CHEM ICAL JOU RNAL OF C HINESE UNIVERSITIES20992103中藥黃連有效成分鹽酸小檗堿與牛血清白蛋白的相互作用劉雪鋒,夏詠梅,方云,劉玲玲,鄒魯(江南大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院,無(wú)錫214036摘要從天然中藥材黃連中提取分離并精制得到鹽酸小檗堿(BC,采用U V光譜和熒光光譜(FS研究其與牛血清白蛋白(BSA的相互作用,解釋了BC導(dǎo)致BSA的熒光發(fā)射光譜峰裂分的現(xiàn)象,其二重峰分別歸屬于色氨酸及酪氨酸殘基.結(jié)果表明,靜態(tài)猝滅和非輻射能量轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致BC對(duì)BSA熒光猝滅的兩大原因, BC與BSA的表觀結(jié)合常數(shù)

2、K A為8.66×104L/mol(30和8.72×104L/mol(37,BC在BSA分子上的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)為(3.1±0.2.BC與BSA分子中熒光性氨基酸殘基之間的距離為3.75nm(30和3.62nm (37,表明BC的部分片段能夠插入BSA分子內(nèi)部.熱力學(xué)函數(shù)計(jì)算結(jié)果表明,該作用過(guò)程是一個(gè)熵增加、G ibbs自由能降低的自發(fā)超分子作用過(guò)程,并由此推斷BC與BSA之間以疏水相互作用為主.關(guān)鍵詞熒光光譜法;中藥有效成分;黃連;鹽酸小檗堿;牛血清白蛋白中圖分類號(hào)O648.162文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0251-0790(200411-2099-05化學(xué)小分子與生物大分

3、子的相互作用是當(dāng)前生命科學(xué)領(lǐng)域經(jīng)常遇到的主要化學(xué)問(wèn)題之一.血清白蛋白是生命體血漿中含量最豐富的蛋白質(zhì),具有貯運(yùn)內(nèi)源代謝產(chǎn)物和外源藥物小分子(離子等重要生理功能.對(duì)各類物質(zhì)與生物大分子的作用已有較多報(bào)道16,目前比較關(guān)注中藥有效成分與生物大分子的相互作用7,8.小檗堿(黃連素是我國(guó)名貴中藥材黃連的主要有效成分,具有抗菌消炎等作用,在原小檗屬植物中廣泛分布,臨床上通常使用鹽酸小檗堿或鹽酸黃連素(Berberine chloride,BC.BC與人血清白蛋白(HSA的表觀結(jié)合常數(shù)已有報(bào)道9,但尚未見(jiàn)到有關(guān)熒光發(fā)射光譜峰裂分現(xiàn)象的闡釋以及確定BC在蛋白質(zhì)分子上的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)和結(jié)合位置的研究報(bào)道.本文從天

4、然中藥材黃連中提取分離并精制得到BC,用UV光譜和熒光光譜(FS研究其與牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA的相互作用,解釋了BC導(dǎo)致BSA的熒光發(fā)射光譜峰裂分現(xiàn)象及二重峰的歸屬;確定靜態(tài)猝滅和非輻射能量轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致BC對(duì)BSA熒光猝滅的兩大原因;由Lang muir單分子吸附模型與質(zhì)量作用定律推得相互作用的數(shù)學(xué)模型,求得BC對(duì)BSA的表觀結(jié)合常數(shù)K A及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n;證實(shí)BC的部分片段能夠插入BSA分子內(nèi)部,并從熱力學(xué)函數(shù)計(jì)算推得BC與BSA之間以疏水相互作用為主.1實(shí)驗(yàn)部分1.1試劑與儀器黃連(生藥材,寧波雙林中藥飲片公司,牛血清白蛋白(99.0%,BSA Frac

5、tion V,Sino-American Biotechnolog y Co.,Tris(生化試劑,上海化學(xué)試劑公司,亞沸蒸餾水(電導(dǎo)率7.8×10-7S/cm,自制,高純N2氣(99.99%,無(wú)錫煉鋼廠,其它所用試劑均為分析純.RF5301PC型熒光光度儀(Shi-madzu公司,UV1100型紫外光譜儀(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司.1.2BC的提取分離與鑒定取10g黃連粗粉,用250mL×4無(wú)水乙醇抽提,濃縮抽提液并加入濃鹽酸得約2g黃色沉淀.用收稿日期:2003-09-16.基金項(xiàng)目:江蘇省自然科學(xué)基金(批準(zhǔn)號(hào):BJ99036資助.聯(lián)系人簡(jiǎn)介:方云(1957年出生,

6、男,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事膠體與界面化學(xué)及酶催化研究.E-mail:fangyunzhou Scheme 1Molecular structure of berberine chl oride沸水溶解,熱濾,取濾液加鹽酸調(diào)pH =2使其重結(jié)晶.將晶體用水洗至剛果紅試劑不變色,干燥后得BC (結(jié)構(gòu)見(jiàn)Scheme 1約0.5g,m.p.183.5184.0,反相HPLC 歸一化純度>98.0%,UV ,IR 及NM R 圖譜均與Sadtler 標(biāo)準(zhǔn)圖譜吻合.1.3光譜實(shí)驗(yàn)方法以T ris-HCl 緩沖液(pH=7.4,含0.15m ol/L NaCl 以維持溶液離子強(qiáng)度為溶劑配制1.0&

7、#215;10-5mol /L 的BSA 標(biāo)準(zhǔn)溶液備用.BC 用無(wú)水甲醇配成2.0×10-3mol /L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用.在50mL 三角瓶中精確移入一定量的BC 甲醇標(biāo)液,以高純N 2氣吹趕甲醇至干,再加入BSA 溶液10mL,超聲分散5min 后,于30或37恒溫3h.激發(fā)光柵及發(fā)射光柵狹縫寬均為3nm,激發(fā)波長(zhǎng)295nm ,恒溫(30或37測(cè)定上述樣品在300500nm 的熒光發(fā)射光譜.以Tris -HCl 緩沖液為溶劑配制1.0×10-5mol /L 的BC 溶液,恒溫(30或37測(cè)定其在300500nm 的U V 吸收光譜.2結(jié)果與討論2.1BC 對(duì)BSA 內(nèi)源性

8、熒光和分子構(gòu)象的影響B(tài)SA 分子中的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸殘基能發(fā)射熒光,所以BSA 是內(nèi)源性熒光物質(zhì).圖1 表Fig .1Ef fect of berberine chloride on f luorescencespectra of BSA at 37c (BSA: 1.0×10-5mol/L;105c (BC /(m ol L -1from peaksa to h :0,0.375,0.75, 1.0, 1.5, 2.25,3.0and 4.5.明BC 可猝滅BSA 的內(nèi)源性熒光,證明BC 與BSA之間存在相互作用.由于色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸殘基在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的空間距離為

9、710nm ,彼此之間的共振能量轉(zhuǎn)移會(huì)導(dǎo)致酪氨酸及苯丙氨酸殘基的熒光猝滅10,所以在大多數(shù)情況下,蛋白質(zhì)的FS 圖似乎只顯示色氨酸殘基的熒光,其峰值在343nm 附近11.當(dāng)BC 濃度在1.0×10-5mol/L 以下,BSA 在343nm 處的熒光發(fā)射只因猝滅而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低,但峰形及峰位置無(wú)明顯變化.當(dāng)BC 濃度達(dá)1.0×10-5mol/L 以上時(shí),BSA 的熒光發(fā)射強(qiáng)度繼續(xù)隨BC 濃度增大而逐漸降低,同時(shí)顯現(xiàn)峰裂分,即原來(lái)343nm 處的單峰逐漸裂分為二重峰,其中一峰峰值藍(lán)移,另一峰峰值紅移.圖1的峰裂分現(xiàn)象目前鮮有報(bào)道9,且對(duì)二重峰的歸屬尚無(wú)解釋.圖2(A 的同步

10、熒光結(jié)果表明,當(dāng)BC 濃度增大時(shí),BSA 中色氨酸殘基產(chǎn)生熒光的強(qiáng)度降低且峰位置紅移,因此圖1中紅移峰應(yīng)歸屬于色氨酸殘基.基于以下實(shí)驗(yàn)事實(shí),可推斷藍(lán)移峰可能是由酪氨酸殘基產(chǎn)生的:(1HSA 中只含有W 214,而不含有W 135色氨酸殘基,但BC-HSA 體系中也出現(xiàn)類似圖1的峰裂分現(xiàn)象9,故可排除藍(lán)移峰是BSA 分子中W 135殘基產(chǎn)生的可能性;(2藍(lán)移峰強(qiáng)度隨BC 濃度增加而降低,排除此峰為BSA -Fig .2Synchronous f luorescence spectra of BSA c (BSA: 1.0×10-5mol/L ;105c (BC/(mol L -1fro

11、m a to c :0,0.75and 1.5.(A =60nm ;(B =15nm.2100高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào)V ol.25BC 復(fù)合物產(chǎn)生的可能性;(3苯丙氨酸的熒光峰值位于282nm 附近10,排除此峰為苯丙氨酸殘基產(chǎn)生的可能性;(4圖2(B中酪氨酸的熒光峰在305nm 附近且熒光強(qiáng)度隨BC 濃度增加而降低,最接近圖1中藍(lán)移峰的變化趨勢(shì).因此,圖1中的藍(lán)移峰最可能是BSA 中酪氨酸殘基受BC 誘導(dǎo)而終止與色氨酸殘基間的共振能量轉(zhuǎn)移,分裂出自身的熒光發(fā)射峰,其最大發(fā)射波長(zhǎng)藍(lán)移則表明酪氨酸殘基所處微環(huán)境的疏水性增強(qiáng)5.蛋白質(zhì)在343nm 處的熒光峰傳統(tǒng)上被歸屬為色氨酸殘基10,但從其半高峰寬超

12、常的峰形和BC 存在時(shí)的峰裂分現(xiàn)象看,該寬峰應(yīng)對(duì)應(yīng)于蛋白質(zhì)分子中所有熒光性氨基酸殘基.2.2BC 對(duì)BSA 內(nèi)源性熒光猝滅作用機(jī)理對(duì)于不出現(xiàn)熒光發(fā)射峰裂分現(xiàn)象的蛋白質(zhì)熒光猝滅體系,一般采用指定波長(zhǎng)處的相對(duì)熒光強(qiáng)度I 與猝滅劑濃度c Q 之間的變化關(guān)系式來(lái)描述或評(píng)價(jià)熒光猝滅過(guò)程;但對(duì)于存在峰裂分的體系,以熒光發(fā)射總量S (熒光發(fā)射峰面積與猝滅劑濃度c Q 之間的變化關(guān)系來(lái)描述或評(píng)價(jià)熒光猝滅過(guò)程12更合理.BC 對(duì)BSA 熒光猝滅過(guò)程若是動(dòng)態(tài)猝滅,其作用過(guò)程應(yīng)遵循Stern-Volmer 方程12:S 0/S =1+K S V c D,t(1式中,S 0是BSA 溶液的熒光發(fā)射總量,S 是加入BC

13、 后BSA 溶液的熒光發(fā)射總量,c D,t 是BC 的總濃度(mol/L.K S V 是Stern-Volmer 猝滅常數(shù)(L/m ol,且由下式定義:K S V =k q × 0(2式中,k q 是由擴(kuò)散過(guò)程控制的雙分子動(dòng)態(tài)猝滅速率常數(shù)(L mol -1s -1, 0是生物大分子內(nèi)源性熒光壽命,本文取 0=10-8s 13.將BC 對(duì)BSA 的熒光猝滅數(shù)據(jù)(37按式(1處理作圖得圖3,從圖3中直線部分線性擬合得到K SV =3.46×104L/mol(R 2=0.9902.由式(2得到猝滅常數(shù)k q =3.46×1012L mol -1s -1,此值遠(yuǎn)大于各種猝

14、滅體對(duì)生物大分子的最大擴(kuò)散猝滅常數(shù)(2×1010L m ol -1s -13,表明BC 對(duì)BSA 內(nèi)源性熒光的猝滅過(guò)程不是由擴(kuò)散控制的動(dòng)態(tài)猝滅過(guò)程,而可能是靜態(tài)猝滅過(guò)程3,并在BC 與BSA 之間形成了基態(tài)復(fù)合物.圖4中BC 的UV 吸收光譜與BSA 的FS 發(fā)射光譜有相當(dāng)程度的重疊,據(jù)Fo rster 無(wú)輻射能量轉(zhuǎn)移理論13,BSA 與BC 之間存在著非輻射能量轉(zhuǎn)移.因此,靜態(tài)猝滅和非輻射能量轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致BC 對(duì)BSA 熒光猝滅的兩大原因 .Fig .3Stern -Vol mer curves of f luorescencequenching of BC to BSA at 37

15、 Fig .4Overlap of BC absorption spectrum (a with BSA fl uorescence spectrum (b at 37a .c (BC=1.0×10-5mol/L;b .n (BC n (BSA=11.根據(jù)Forster 無(wú)輻射能量轉(zhuǎn)移理論,當(dāng)熒光給體與受體分子之間最大距離小于710nm ,且熒光給體的FS 發(fā)射光譜與受體的U V 吸收光譜存在相當(dāng)程度的重疊時(shí)(圖4,兩者之間可發(fā)生能量轉(zhuǎn)移,其效率E 與給體-受體之間的能量轉(zhuǎn)移距離r 及E =50%時(shí)的臨界距離R 0存在下列關(guān)系:E =R 60/(R 60+r 6(3E =1-S /S

16、 0(4R 60=8.8×10-25K 2N -4!p J (5式(5中,K 2為偶極空間取向因子,N 為介質(zhì)折射指數(shù),!p 為BSA 的熒光量子產(chǎn)率,J 為給體熒光發(fā)射光譜與受體吸收光譜的重疊積分J =(I p ( D ( 4 /(I p ( (6式中,I p ( 是BSA 在波長(zhǎng) 處的熒光強(qiáng)度,D ( 是BC 在波長(zhǎng) 處的摩爾吸光系數(shù).據(jù)圖4結(jié)果按照式(6得J =2.818×10-14cm 3L mol -1(30及2.819×10-14cm 3L mol -1(37.在本文實(shí)驗(yàn)2101N o.11劉雪鋒等:中藥黃連有效成分鹽酸小檗堿與牛血清白蛋白的相互作用條

17、件下,取K 2=2/3,N =1.336,!p =0.1513,按式(5計(jì)算得R 0=3.03nm ,按式(4計(jì)算得E =0.2173(30及0.2561(37,進(jìn)而得到r =3.75nm(30及3.62nm (37,表明BC 的部分片段能夠插入BSA 分子內(nèi)部.2.3BC 與BSA 的表觀結(jié)合常數(shù)K A 以及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n藥物小分子D 與生物大分子P 之間的相互作用滿足下式:D +P k +k -D-P Complex (7設(shè)在一定藥物濃度范圍內(nèi)每個(gè)大分子上存在n 個(gè)等同且獨(dú)立的藥物結(jié)合位點(diǎn),且D 與P 之間相互作用關(guān)系符合Langm uir 單分子吸附模型14,15,當(dāng)相互作用達(dá)到平衡狀態(tài)時(shí)

18、,則有K A =c D,b /c D,f (nc P,t -c D,b (8式中,K A 為D 與P 之間的表觀結(jié)合常數(shù),c D,b ,c D,f 及c P,t 分別為被結(jié)合藥物、游離藥物以及生物大分子總濃度(mol /L ,n 為每個(gè)大分子上存在的小分子結(jié)合位點(diǎn)數(shù).假定D -P 復(fù)合物不發(fā)熒光,則體系中各物種之間有下列定量關(guān)系式:c D,b /nc P,t =(S 0-S /S 0(9c D,t =c D,b +c D,f(10將式(9及式(10代入式(8,可得S 0/S =K A c D,t S 0/(S 0-S - nK A c P,t(11Fig .5The c D ,t S 0/(S

19、 0-S vs .S 0/S curves of BC and BSA system a .S 0/S =8.66×104c D,t S 0/(S 0-S -2.838,R 2=0.9963;b .S 0/S =8.72×104c D,t S 0/(S 0-S -2.552,R 2=0.9985.按照式(11對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,結(jié)果見(jiàn)圖5,線性擬合得到方程,再由方程斜率和截距可得表觀結(jié)合常數(shù)K A 和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n (表1.表1數(shù)據(jù)表明,BC 與BSA 之間具有較強(qiáng)的相互作用,BSA 分子上具有(3.1±0.2個(gè)BC 的結(jié)合位點(diǎn),故BC 能夠被BSA 貯運(yùn).Tabl

20、 e 1The apparent association constant (K A andvalue of binding site (n in BC -BSA systemt /K A /(L mol -1n 308.66×104 3.3378.72×104 2.92.4BC 與BSA 之間相互作用的熱力學(xué)參數(shù)以及作用力類型在溫度變化范圍不大時(shí),若將BC 與BSA 之間的作用過(guò)程的焓變 H 作為一個(gè)不隨溫度改變的常數(shù),則可由式(12(14得到BC 與BSA 結(jié)合過(guò)程的熱力學(xué)參數(shù) G , H 和 S ,結(jié)果列于表2.G =-RT ln K A(12 H =RT 1T 2l

21、n(K A 2/(K A 1T 2-T 1(13S =( H - G /T (14Tablet 2Thermodynamic parameters of the BC -BSA binding procedure t / H /(kJ mol -1 G /(kJ mol -1 S /(J mol -1K -1300.77-28.6497.06370.77-29.3297.06表2中 H 的數(shù)值與 G 的相比,可以按照 H 0處理.可見(jiàn),藥物BC 與BSA 之間是以非化學(xué)鍵形式相互作用的,藥物分子BC 與BSA 分子的扦插以及BSA 分子構(gòu)象的自發(fā)應(yīng)激改變,使原本固定于BSA 的疏水空腔內(nèi)部的部

22、分水分子得以釋放,所以該作用過(guò)程是一個(gè)熵增加、Gibbs 自由能降低的自發(fā)超分子作用過(guò)程.根據(jù)熱力學(xué)參數(shù)與作用力的關(guān)系16可知,BC 與BSA 之間以疏水相互作用為主.從BC 的分子結(jié)構(gòu)(Scheme 1可知,BC 與BSA 之間也存在靜電作用,但從作用過(guò)程熱力學(xué)函數(shù)變化量 H 對(duì) G 的貢獻(xiàn)較小的實(shí)驗(yàn)事實(shí)判斷,靜電作用不是主要的,疏水作用是主要的,BC 與BSA 之2102高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)V ol.25間的結(jié)合是熵驅(qū)動(dòng)自發(fā)過(guò)程.參考文獻(xiàn)1XU Hong (徐宏,DE NG Hong (鄧洪,HU Hong -Yu (胡紅雨et al .Chem .J .Chinese Universitie

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