黃褐毛忍冬HPLC特征圖譜分析

1、黃褐毛忍冬HPLC特征圖譜分析    【摘要】  ：目的 建立貴州道地藥材黃褐毛忍冬的HPLC特征圖譜分析方法,為黃褐毛忍冬的加工、質(zhì)量控制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法 以50%甲醇為提取溶劑,超聲波震蕩30 min,制備黃褐毛忍冬樣品溶液,采用RP-HPLC法,選用Luna C18(2) (5 m,250 mm×4.6 mm)色譜柱,體積流量1.0 mL/min,柱溫30 ,檢測(cè)波長(zhǎng)238 nm,流動(dòng)相為0.2%磷酸乙腈(A

2、)-0.2%磷酸溶液(B),洗脫梯度為015 min,AB為10%90%,1560 min,AB為10%90%40%60%。結(jié)果 對(duì)10批黃褐毛忍冬藥材進(jìn)行測(cè)定,以綠原酸為參照物,確定了黃褐毛忍冬藥材特征圖譜中的9個(gè)共有峰；通過(guò)方法學(xué)考察,精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)RSD值均小于3.0%；采用相似度評(píng)價(jià)軟件評(píng)價(jià)10批樣品與參照特征圖譜之間的相似度,均大于0.99,表明黃褐毛忍冬10批藥材質(zhì)量穩(wěn)定、均一。結(jié)論 建立了黃褐毛忍冬的特征圖譜,為有效控制黃褐毛忍冬的加工、質(zhì)量控制及標(biāo)準(zhǔn)提高提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)( 【關(guān)鍵詞】  黃褐毛忍冬綠原酸高效液相

3、色譜法     Abstract：Objective Establishing a kind of analysis method about HPLC character spectra of native medicinal materials, Lonicera fulvotomentosa, in Guizhou province for 

4、supplying experiment basis to guide processing and quality control of Lonicera fulvotomentosa. Methods Making the Lonicera fulvotomentosa sample liquors with 50% carbinol solvent and

5、60;vibrating 30 minutes by ultrasonic. Adopting high performance liquid chromatography RP-HPLC method, Luna C18 (2) (5 m, 250 mm×4.6 mm) chromatographic column, the volume flo

6、w 1.0 mL/min, the column temperature 30 , the detection wavelength 238 nm, the mobile phase 0.2% phosphoric acid acetonitrile (A)-0.2% phosphoric acid solution (B), the g

7、radient elution 015 min, AB10%90%, 1560 min, AB10%90%40%60%. Results Determined 9 common peak in character spectra of the Lonicera fulvotomentosa by detecting 10 group Lonicera

8、0;fulvotomentosa medicine materials with referring to chlorogenic acid, the precision and stability and reiteration test RSD value all less than 3.0%. The similitude degree between

9、 the samples and the character spectras was more than 0.99 by evaluating ten batch of the samples with the similarity assessing soft, proving that the quality of

10、0;the ten batch of the Lonicera fulvotomentosa medicine materials was stable and homogeneous. Conclusion The character spectra of the Lonicera fulvotomentosa was established to sup

11、ply experiment basis for effectively controlling process, quality and standard of Lonicera fulvotomentosa. Key words：Lonicera fulvotomentosa；chlorogenic acid；HPLC     黃褐毛忍冬為忍冬科植物黃褐毛忍冬Lonicera fulvoto-

12、 mentosa Hsu et S.C.Cheng.的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花。產(chǎn)于我國(guó)西北部、貴州西南部和云南,是貴州省的道地藥材之一1-2,在貴州作為金銀花使用。味甘、性寒,歸肺經(jīng),具有清熱解毒、涼散風(fēng)熱的功效。臨床用于癰腫疔瘡、喉痹、丹毒、熱毒血痢、風(fēng)熱感冒、溫病發(fā)熱3-5。在加工方法上利用茶葉加工技術(shù),高溫高壓蒸汽瞬時(shí)殺青后機(jī)械烘干的加工方法能較好的保持其色澤和有效成分綠原酸的含量。但單一的指標(biāo)性成分量的測(cè)定難以反映中藥材的整體質(zhì)量,而中藥材的特征圖譜能夠反映中藥材的整體特點(diǎn),較全面反映藥材的品質(zhì),而目前HPLC是繪制特征圖譜用途最廣的一種方法,所以

13、,本研究應(yīng)用RP-HPLC方法對(duì)機(jī)械加工黃褐毛忍冬的特征圖譜進(jìn)行研究,為進(jìn)一步有效控制黃褐毛忍冬藥材的質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。 1  儀器與試藥     美國(guó)Waters公司W(wǎng)aters1525型高效液相色譜儀及2487紫外檢測(cè)儀。綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào)110753-200413,供含量測(cè)定用)。乙腈(色譜純)；甲醇(分析純、色譜純)；磷酸(分析純)；娃哈哈純凈水。     黃褐毛忍冬樣品均經(jīng)貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院何順志教授鑒定,由貴州飛龍雨公司高溫蒸汽殺青機(jī)械烘干加工而成,來(lái)源見(jiàn)表1(醫(yī)藥

14、學(xué)/臨床醫(yī)學(xué)論文 2  實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果 2.1  色譜條件的選擇 2.1.1  流動(dòng)相  分別比較乙腈-0.2%磷酸溶液、甲醇-0.2%磷酸溶液、乙腈-0.4%磷酸溶液、甲醇-0.4%磷酸溶液、0.2%磷酸乙腈-0.2%磷酸溶液、0.2%磷酸甲醇-0.2%磷酸溶液、0.4%磷酸乙腈-0.4%磷酸溶液、0.4%甲醇-0.4%磷酸溶液的等度和梯度洗脫的效果,結(jié)果表明,等度洗脫的色譜峰保留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)(3 h以上)且色譜峰分離效果不好。甲醇作為流動(dòng)相的色譜峰基線漂移較大不穩(wěn)定；加入0.4%磷酸的流動(dòng)相色譜峰分離不好；流動(dòng)相中

15、只在水中加入0.2%磷酸的溶液在進(jìn)行梯度洗脫時(shí),流動(dòng)相比例變化,其pH值有變化,故而采用0.2%磷酸乙腈(A)-0.2%磷酸溶液(B)作為流動(dòng)相,并考察了2個(gè)梯度,見(jiàn)表2。表2  梯度洗脫表（略）    結(jié)果第2個(gè)梯度色譜峰分離較好。因此,選擇梯度洗脫,流動(dòng)相為0.2%磷酸乙腈(A)-0.2%磷酸溶液(B),洗脫梯度為015 min,AB為10%90%,1560 min,AB為10%90%40%60%；體積流量：1.0 ml/min；柱溫30 。  2.1.2 &#

16、160;色譜柱  分別比較了Luna C18(2)(5 m,250 mm×4.6 mm), Waters C18(2)(5 m,4.6 mm×150 mm)柱,島津Shim-pack 150l×4.6vp-ODS柱,其中Luna柱對(duì)流動(dòng)相pH值適應(yīng)范圍較廣且色譜峰分離度好,故選擇Luna C18(2)(5 m,250 mm×4.6 mm)色譜柱。 2.1.3  檢測(cè)波長(zhǎng)  采用

17、二極管陣列檢測(cè)器對(duì)檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行考察,分別提取在220、238、254、327、350 nm波長(zhǎng)處的色譜圖,結(jié)果在238 nm處各色譜峰均有較好的吸收且分離度和峰形較好,色譜峰信息豐富,因此,選擇238 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。 2.2  供試品溶液的制備      考慮生產(chǎn)制劑和用藥習(xí)慣,結(jié)合參照物綠原酸的理化特性6,考察比較了甲醇(50%)、乙醇(50%)、水對(duì)黃褐毛忍冬藥材提取的效果,結(jié)果用水提取色譜峰雖多但分離不好,乙醇提取的色譜信息較少,甲醇提取的色譜信息適中、分離較好并且樣品處理簡(jiǎn)

18、單,故選擇甲醇提取7。    考察了超聲提取30 min、煎煮1 h、回流30 min的提取效果,結(jié)果水煎煮色譜信息豐富,但沒(méi)有較好的分離,甲醇、乙醇回流提取的色譜信息較少,甲醇超聲提取色譜信息量較大且分離好,故選擇甲醇超聲提取。    精密稱取黃褐毛忍冬粉末0.5 g,精密加入50%甲醇50 mL超聲提取30 min,冷卻后補(bǔ)足損失質(zhì)量,過(guò)濾,濾液用微孔濾膜濾過(guò),作為供試品溶液。 2.3  參照品溶液的制備  &#

19、160; 精密稱取綠原酸對(duì)照品適量,用50%甲醇制成40.52 g/mL的溶液,作為參照品溶液。 2.4  分析時(shí)間的確定    用以上條件考察,色譜峰在60 min基本分離,參考文獻(xiàn)特征圖譜常用的監(jiān)測(cè)時(shí)間,監(jiān)測(cè)120 min。轉(zhuǎn)貼于 免費(fèi)論文下載中心  2.5  特征圖譜的測(cè)定    精密稱取黃褐毛忍冬樣品0.5 g,精密加入50%甲醇50 mL超聲提取30 min,過(guò)濾,濾液用微孔濾

20、膜濾過(guò)作為樣品溶液；用Waters1525型高效液相色譜儀及2487紫外檢測(cè)儀；色譜柱Luna5 m,C18(2),250 mm×4.6 mm；流動(dòng)相按015 min 0.2%磷酸乙腈-0.2%磷酸溶液(1090),1560 min 0.2%磷酸乙腈-0.2%磷酸溶液(10904060)的梯度洗脫系統(tǒng)；柱溫30 ；檢測(cè)波長(zhǎng)238 nm；進(jìn)樣量20 L進(jìn)行梯度洗脫,記錄圖譜時(shí)間為120 min,對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定后用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版處理。結(jié)果如下：通過(guò)比較

21、不同樣品的色譜峰,確定9個(gè)共有峰(見(jiàn)圖1和圖2),其中S峰為綠原酸的吸收峰。相對(duì)保留時(shí)間和峰面積見(jiàn)表3和表4。表3  10批黃褐毛忍冬藥材特征圖譜共有峰相對(duì)保留時(shí)間（略）表4  10批黃褐毛忍冬藥材特征圖譜共有峰相對(duì)峰面積（略） 2.6  方法學(xué)考察 2.6.1  精密度試驗(yàn)  精密稱取黃褐毛忍冬S9號(hào)樣品0.5 g,按樣品溶液制備方法制備,連續(xù)進(jìn)樣5次,記錄圖譜,計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積,各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD在0.1%0.9%,各共有峰相對(duì)峰面積的RSD在0.01%0.05%

22、。RSD均<3.0%,表明精密度好。 2.6.2  穩(wěn)定性試驗(yàn)  精密稱取S9號(hào)樣品0.5 g,按樣品溶液制備方法制備,分別在0、2、4、8、12 h進(jìn)樣,記錄圖譜,計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積,各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD在0.1%0.9%,各共有峰相對(duì)峰面積的RSD在0.01%0.05%。RSD均<3.0%,表明供試液在12 h內(nèi)保持穩(wěn)定。 2.6.3  重復(fù)性試驗(yàn)  精密稱取5份S9號(hào)樣品0.5 g,按樣品溶液制備方法制備,記錄圖譜,計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積,各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD在0.0%1.8%,各共有峰相對(duì)峰面積的RSD在0.01%0.95%。RSD均<3.0%,表明重復(fù)性好。 2.7  相似度評(píng)價(jià)    根據(jù)10批黃褐毛忍冬藥材HPLC特征圖譜的檢測(cè)結(jié)果,應(yīng)用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版處理,采用中位數(shù)法,10批樣品與參照?qǐng)D譜的相似度及10批樣品間的相似度見(jiàn)表5。表5  10批黃褐毛忍冬藥材特征圖譜與參照?qǐng)D譜的相似度（略） 3