細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

1、生命科學(xué)學(xué)院生物技術(shù)系二O一0年前 言生命科學(xué)是一門實(shí)驗(yàn)科學(xué)，實(shí)驗(yàn)教學(xué)是培養(yǎng)學(xué)生創(chuàng)新能力的重要途徑。細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)主要為驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，其主要目的是使學(xué)生加深理解細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)及其生理功能等各方面的知識，掌握細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的基本操作和技能，并培養(yǎng)學(xué)生分析問題和解決問題的能力以及嚴(yán)謹(jǐn)、求實(shí)的科學(xué)態(tài)度。本著這樣的目的，結(jié)合我們實(shí)驗(yàn)中心的實(shí)驗(yàn)條件，我們共設(shè)置12個實(shí)驗(yàn)，其中開設(shè)9個實(shí)驗(yàn)。希望通過本實(shí)驗(yàn)的學(xué)習(xí)，在加深對細(xì)胞生物學(xué)理論知識的了解和掌握的同時，真正提高學(xué)生的動手能力。動手能力實(shí)際是一種有更高要求的動腦能力。實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)由王秀玲(4,7,8,10,11,12)、聶永心(1,2,9)、周淑梅(3,

2、5,6)三位老師編寫。劉鷹高、朱常香、彭清才等老師對本實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)提出了意見和建議。2010. 6目錄實(shí)驗(yàn)一：特殊顯微鏡的原理及其使用 4實(shí)驗(yàn)二：電子顯微鏡的原理及使用 8實(shí)驗(yàn)三：細(xì)胞膜的滲透性 18實(shí)驗(yàn)四：細(xì)胞的凝集反應(yīng) 20實(shí)驗(yàn)五：誘導(dǎo)細(xì)胞融合聚乙二醇法 23實(shí)驗(yàn)六：線粒體和液泡系的超活染色 26實(shí)驗(yàn)七：葉綠體和細(xì)胞核的熒光觀察 29實(shí)驗(yàn)八：細(xì)胞骨架的觀察 31實(shí)驗(yàn)九：細(xì)胞中DNA、RNA的顯示 33實(shí)驗(yàn)十：細(xì)胞培養(yǎng)的準(zhǔn)備工作 37實(shí)驗(yàn)十一：細(xì)胞的原代培養(yǎng) 42實(shí)驗(yàn)十二：細(xì)胞的傳代培養(yǎng) 45實(shí)驗(yàn)一 特殊顯微鏡的原理及其使用一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.了解暗視野顯微鏡觀察活細(xì)胞的基本原理；2.了解暗視野顯微

3、鏡的特殊組件和位置；3.掌握調(diào)節(jié)暗視野顯微鏡的基本步驟。二、原理和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)在日常生活中，室內(nèi)飛揚(yáng)的微粒灰塵是不易被看見的，但在暗的房間中若有一束光線從門縫斜射進(jìn)來，灰塵便粒?？梢娏?，這是光學(xué)上的丁達(dá)爾現(xiàn)象。暗視野顯微鏡就是利用此原理設(shè)計(jì)的。它的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)主要是使用中央遮光板或暗視野聚光器，常用的是拋物面聚光器，使光源的中央光束被阻擋不能由下而上地通過標(biāo)本進(jìn)入物鏡。從而使光線改變途徑，傾斜地照射在觀察的標(biāo)本上，標(biāo)本遇光發(fā)生反射或散射，散射的光線投入物鏡內(nèi)，因而整個視野是黑暗的。在暗視野中所觀察到的是被檢物體的衍射光圖像并非物體的本身，所以只能看到物體的存在和運(yùn)動，不能辨清物體的細(xì)微結(jié)構(gòu)。但被檢物體

4、為非均質(zhì)時，并大于1/2波長，則各級衍射光線同時進(jìn)入物鏡，在某種程度上可觀察物體的構(gòu)造。一般暗視野顯微鏡雖看不清物體的細(xì)微結(jié)構(gòu)，但卻可分辨0.004m以上的微粒的存在和運(yùn)動，這是普通顯微鏡(最大的分辨力為0.2m)所不具有的特性，可用以觀察活細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞內(nèi)微粒的運(yùn)動等。三、儀器、材料與試劑（一） 儀器具有暗視野聚光器的顯微鏡（二） 材料牙垢微生物，洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞，載玻片，蓋玻片，牙簽，尖頭鑷子，濾紙條，指甲油，擦鏡紙等。（三） 試劑生理鹽水四、實(shí)驗(yàn)步驟1.樣品制備：在一張無劃痕、清潔的載玻片上滴一滴生理鹽水，用牙簽取牙垢或用鑷子撕洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞與載玻片上的生理鹽水混合均勻，蓋上一片無劃痕、

5、清潔的蓋玻片，用濾紙條吸取蓋片四周多余的水分，用指甲油封片（或不封片）。2.將暗視野聚光器安裝在顯微鏡上，調(diào)強(qiáng)照明光。3.將標(biāo)本置于載物臺上，插入10x物鏡，用調(diào)焦螺旋聚焦樣品。4.調(diào)節(jié)暗視野聚光器位置：這一步是調(diào)節(jié)暗視野像的關(guān)鍵，包括調(diào)節(jié)暗視野聚光器的高低位置和中間位置?？煞磸?fù)、緩慢地由低到高或由高到低調(diào)節(jié)暗視野聚光器的高低位置，聚光器偏高或偏低都將在視野中出現(xiàn)質(zhì)量不好的影像，只有在合適的位置時，才可出現(xiàn)背景暗、影像亮的暗視野效果；調(diào)好聚光器的高低位置后，再通過聚光器上的調(diào)中螺旋調(diào)節(jié)聚光器的中心位置，使得到最好的暗視野像效果。5.換用高倍物鏡觀察時，要換用高倍物鏡相匹配的暗視野聚光器，依據(jù)上

6、述步驟進(jìn)行調(diào)節(jié)。五、作業(yè)1.繪制暗視野內(nèi)牙垢微生物、洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞圖（35個細(xì)胞）2.明視野和暗視野像的主要區(qū)別是什么？暗視野顯微鏡的特殊組件是什么？一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.了解相差顯微鏡觀察活細(xì)胞的基本原理；2.了解相差顯微鏡的特殊組件和位置；3.掌握調(diào)節(jié)相差顯微鏡的基本步驟。二、原理和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)光波有振幅（亮度）、波長（顏色）及相位(指在某一時間上光的波動所能達(dá)到的位置)的不同。當(dāng)光通過物體時，如波長和振幅發(fā)生變化，人們的眼睛才能觀察到，這就是普通顯微鏡下能夠觀察到染色標(biāo)本的道理。而活細(xì)胞和未經(jīng)染色的生物標(biāo)本，因細(xì)胞各部微細(xì)結(jié)構(gòu)的折射率和厚度略有不同，光波通過時，波長和振幅并不發(fā)生變化，僅相位有變化

7、(相應(yīng)發(fā)生的差異即相差)，而這種微小的變化，人眼是無法加以鑒別的，故在普通顯微鏡下難以觀察到。相差顯微鏡能夠改變直射光或衍射光的相位，并且利用光的衍射和干涉現(xiàn)象，把相差變成振幅差(明暗差)，同時它還吸收部分直射光線，以增大其明暗的反差。因此可用以觀察活細(xì)胞或未染色標(biāo)本。 相差顯微鏡與普通顯微鏡的主要不同之處是：用環(huán)狀光闌代替可變光闌，用帶相板的物鏡(通常標(biāo)有PH的標(biāo)記)代替普通物鏡，并帶有一個合軸用的望遠(yuǎn)鏡。環(huán)狀光闌是由大小不同的環(huán)狀孔形成的光闌，它們的直徑和孔寬是與不同的物鏡相匹配的。其作用是將直射光所形成的像從一些衍射旁像中分出來。相板安裝在物鏡的后焦面處，相板裝有吸收光線的吸收膜和推遲相

8、位的相位膜。它除能推遲直射光線或衍射光的相位以外，還有吸收光使亮度發(fā)生變化的作用。調(diào)軸望遠(yuǎn)鏡是用來進(jìn)行合鈾調(diào)節(jié)的。相差顯微鏡在使用時，聚光鏡下面環(huán)f狀光闌的中心與物鏡光軸要完全在一直線上，必需調(diào)節(jié)光闌的亮環(huán)和相板的環(huán)狀圈重合對齊，才能發(fā)揮相差顯微鏡的效能。否則直射光或衍射光的光路紊亂，應(yīng)被吸收的光不能吸收，該推遲相位的光波不能推遲，就失去了相差顯微鏡的作用。三、儀器、材料與試劑（一） 儀器相差顯微鏡（二） 材料口腔上皮細(xì)胞，洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞，載玻片，蓋玻片，牙簽，尖頭鑷子，濾紙條，指甲油，擦鏡紙等。（三） 試劑生理鹽水四、實(shí)驗(yàn)步驟1.樣品制備：在一張清潔無痕的載玻片上滴一滴生理鹽水，用牙簽刮自己

9、的口腔粘膜少許或用鑷子撕洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞與載玻片上的生理鹽水混合均勻，蓋上清潔的蓋玻片，用濾紙條吸取蓋片周圍多余的水分，用指甲油封片（或不封片）。2.將10x相差物鏡旋入光路。3.將相應(yīng)于10x相差物鏡的相差聚光器的環(huán)狀光闌移入光路中，完全打開聚光器的孔徑光闌。4.將樣品置于載物臺上，用聚焦螺旋聚焦樣品。5.用柯勒照明法調(diào)節(jié)聚光器：將視場光闌關(guān)到最小；用聚光器升降調(diào)節(jié)螺旋，調(diào)節(jié)聚光器的上下位置，直至在目鏡中觀察到視場光闌像的邊緣清楚；調(diào)節(jié)聚光器的調(diào)中螺旋，使視場光闌的像移至視場中央（調(diào)中聚光器）；打開視場光闌，使其邊緣與目鏡中的視場同樣大小?？吕照彰魇钦{(diào)好相差像的關(guān)鍵之一。6.觀察物鏡后焦面，調(diào)

10、節(jié)儀器使聚光器中環(huán)狀光闌的像和相差物鏡中相板的圓環(huán)互相吻合，這一步是調(diào)好相差最重要的步驟。具體方法是：取下一個目鏡，插入一個聚焦望遠(yuǎn)鏡，轉(zhuǎn)動望遠(yuǎn)鏡的接目鏡，直到在望遠(yuǎn)鏡中觀察到清晰的環(huán)狀光闌（在聚光器中）和相板（在相差物鏡中）的像。如果環(huán)狀光闌的明亮光圈與圓形相板不吻合，可以通過調(diào)節(jié)聚光器上的調(diào)中螺旋使之吻合。調(diào)節(jié)吻合后，取出聚焦望遠(yuǎn)鏡，插入目鏡，就可在目鏡中觀察到一個清晰的口腔上皮細(xì)胞的相差像。7.如果換用高倍相差物鏡觀察，需要移入相應(yīng)的高倍相差物鏡的聚光器環(huán)狀光闌，重復(fù)以上調(diào)節(jié)步驟。五、思考題1.繪制口腔粘膜上皮細(xì)胞、洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞圖（35個細(xì)胞），并比較暗視野和相差顯微鏡下洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞

11、的差別？2.明視野和相差顯微鏡成像原理有哪些區(qū)別？相差顯微鏡的特殊組件是什么？六、注意事項(xiàng)1.調(diào)節(jié)電源使光源強(qiáng)度較大；2.一定要完全將兩環(huán)合軸。（見實(shí)驗(yàn)七:葉綠體和細(xì)胞核的熒光觀察）實(shí)驗(yàn)二 電子顯微鏡的原理及使用I. 透射電子顯微鏡的使用一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.了解常規(guī)超薄切片技術(shù)的基本過程及原理；2.了解透射電子顯微鏡的操作技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理透射電子顯微鏡是發(fā)展最早、應(yīng)用最廣泛的電子顯微鏡。在細(xì)胞生物學(xué)上，可用于觀察和研究細(xì)胞內(nèi)部的亞顯微鏡結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的形態(tài)結(jié)構(gòu)及病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)。透射電子顯微鏡以電子槍作為照明光源，從電子槍燈絲發(fā)射的電子束經(jīng)聚光鏡會聚照射到樣品上。帶有樣品結(jié)構(gòu)信息的

12、透射電子（transmission electrons，TE）進(jìn)入成像系統(tǒng)，被各級成像透鏡聚焦、放大后，投射在觀察熒光屏上，形成透射電子顯微鏡像。超薄切片技術(shù)是透射電鏡樣品制備最基本最常用的技術(shù)。生物樣品的超薄切片過程是將含水的生物材料經(jīng)過一系列的化學(xué)處理，使其被包埋在堅(jiān)硬的樹脂材料中，并且必須使其超微結(jié)構(gòu)保存良好。這樣在堅(jiān)硬樹脂材料中的生物樣品就可以用超薄切片機(jī)切成厚度為50nm左右的超薄切片，以滿足透射電鏡對觀察樣品的要求。超薄切片制樣過程較為復(fù)雜，包括取材、固定、脫水、包埋、切片、染色等基本步驟。每一步驟對于制片的成敗都很關(guān)鍵，實(shí)驗(yàn)操作者必須認(rèn)真嚴(yán)格地按照要求操作每一步驟，才能得到較好的

13、觀察效果。三、儀器、材料與試劑（一）儀器、用具透射電子顯微鏡、超薄切片機(jī)、制刀機(jī)、玻璃條、恒溫箱、控溫烤箱、冰箱、光學(xué)顯微鏡、磁力攪拌器、手術(shù)剪刀、眼科鑷子、銅網(wǎng)鑷子、量杯、量筒、燒杯、培養(yǎng)皿、注射器、吸管、青霉素小瓶、玻璃缸、載玻片、酒精燈、銅網(wǎng)、濾紙、牙簽、睫毛筆、樣品盒、包埋模具、醫(yī)用膠布。（二）材料鼠肝或其他生物組織。（三）試劑磷酸鹽緩沖溶液（PBS）、戊二醛、1鋨酸、50乙醇、60乙醇、70乙醇、80乙醇、90乙醇、無水乙醇、環(huán)氧丙烷、環(huán)氧樹脂包埋劑一套（包括環(huán)氧樹脂Epon812）、十二烷基琥珀酸酐（DDSA）、甲基內(nèi)次甲基鄰苯二甲酸酐（MNA）、2,4,6-三（二甲氨基甲基）苯酚

14、（DMP30）、醋酸鈾染液、檸檬酸鉛染液。四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟（一）試劑配置L磷酸鹽緩沖溶液（PBS）A液：磷酸氫二鈉·12H2g，加雙蒸水溶解至1000ml。B液：磷酸二氫鈉·2H2O，加雙蒸水溶解至1000ml。 根據(jù)不同要求，按不同配比，可得不同pH值的L的磷酸鹽緩沖溶液，見下表：表2-1 不同配比的磷酸鹽緩沖溶液的pH值pH（25）A液（ml）B液（ml）戊二醛固定液25戊二醛10ml，/L PBS 50 ml，加雙蒸水至100ml即可。3. 1鋨酸固定液（1）配置2鋨酸貯存液：取1g 安瓿四氧化鋨泡酸48h，沖洗48h，雙蒸水漂洗30min。干后用玻璃刀刻劃12道痕

15、，置入棕色磨口瓶，加雙蒸水50ml，用力搖動使安瓿破碎。靜置48h四氧化鋨溶解后備用。4避光保存。（2）配置1鋨酸使用液（現(xiàn)用現(xiàn)配）：取2四氧化鋨貯存液10ml，加l0ml混合。4.不同濃度的乙醇溶液用無水乙醇稀釋成90、80、70、60、50的乙醇。5.環(huán)氧丙烷（必須無水）。6.環(huán)氧樹脂Epon812包埋劑（Luft配方）Epon812，90ml；DDSA（十二烷基琥珀酸酐，軟化劑），6 ml；MNA（甲基內(nèi)次甲基鄰苯二甲酸酐，硬化劑），5ml；DMP-302,4,6-三（二甲氨基甲基）苯酚，按2%加入。使用時根據(jù)不同硬度要求按一定比例增減DDSA和MNA。DDSA液增多，則軟；MNA液增多

16、則硬。三種液體逐次加入混合均勻后，逐滴加入DMP-30，其濃度控制在2。邊加邊攪，充分?jǐn)嚢?0min左右。7.醋酸鈾染液稱取醋酸雙氧鈾1. g,溶于50ml5070乙醇溶液中，靜置12天，使未溶的部分沉淀，取上部黃色透明溶液用，4冰箱避光保存。8.檸檬酸鉛溶液A液：硝酸鉛（必須為新近產(chǎn)品），檸檬酸鈉，雙蒸水（用前加沸冷卻）30ml，充分搖勻，混懸液為乳白色檸檬酸鉛鉻合物。B液：氫氧化鈉（NaOH）lmolL。使用液：A液配制完畢30min后，加B液8ml，加雙蒸水至50ml混勻，溶液清亮（pH值為10-12）。如有沉淀，不能再用。（二）超薄切片的制備超薄切片技術(shù)是指不需要特殊冷凍條件的常規(guī)包埋

17、技術(shù)。包括取材、固定、脫水、浸透、包埋、切片、染色等步驟（圖2-1）。1.取材將動物處死后，要快速取出組織，以免細(xì)胞內(nèi)部細(xì)微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。取材過程要注意以下幾點(diǎn)：取材部位要準(zhǔn)確；無人工損傷，不要牽拉、擠壓，樣品塊要小，一般切成lmm3的小塊，起碼在某一個方向上的厚度要小于lmm，組織離開活體后盡快（1min之內(nèi)）進(jìn)入預(yù)冷的戊二醛固定液中（4）保存。2.固定固定是電鏡樣品制備中最重要的一環(huán)，其目的是使細(xì)胞生命過程立即終止，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)和化學(xué)成分保持生前狀態(tài)。電鏡材料固定一般采用雙重固定法，即先用戊二醛進(jìn)行前固定，然后再用鋨酸進(jìn)行后固定。兩次固定之間要進(jìn)行漂洗。（1）前固定：將取的材料立即投入預(yù)冷的

18、2.5戊二醛溶液中，4條件下固定3h。若不馬上進(jìn)行后面的制備程序，可保存在的PBS中或戊二醛溶液固定液中（4）。戊二醛的兩個醛基與蛋白質(zhì)、核酸等的氨基發(fā)生交鏈作用，可以較好地固定蛋白質(zhì)、核酸和多糖等，能保存微管、糖原、核蛋白和細(xì)胞基質(zhì)等，不易使酶失活，可以用于細(xì)胞化學(xué)研究，但不能固定脂類，對脂質(zhì)顆粒、膜結(jié)構(gòu)等保存不好。如果對保存超微結(jié)構(gòu)（尤其膜系統(tǒng)）有較高的觀察要求，經(jīng)戊二醛溶液單固定的樣品不宜保存過長時間，在1周內(nèi)進(jìn)入常規(guī)制備程序?yàn)楹?。的戊二醛固定液對組織的平均滲透深度為，這是取材要小的原因之一。（2）鋨酸后固定：進(jìn)行后固定以前，材料要用0.1molL PBS漂洗6次，每次l0min。避免戊

19、二醛與四氧化鋨發(fā)生氧化還原反應(yīng)，生成沉淀，所以要徹底洗干凈。漂洗后取出，轉(zhuǎn)入1四氧化鋨固定液中，4條件下固定12h。四氧化鋨對氮有較強(qiáng)的親和力，能與蛋白質(zhì)氨基迅速結(jié)合形成交鏈化合物，對含蛋白質(zhì)的各種結(jié)構(gòu)成分均能固定。能與不飽和脂肪酸反應(yīng)，生成四氧化鋨二酯化合物，使含有脂類的結(jié)構(gòu)固定。因?yàn)殇~是一種高原子序數(shù)元素，在用四氧化鋨固定樣品的同時，還起到一種電子染色作用。但是，四氧化鋨4不能固定核酸，對糖原、微管等保存不好。同時，四氧化鋨又是酶的鈍化劑，不能用于細(xì)胞化學(xué)研究。四氧化鋨固定時間太長，不僅易丟失成分，而且會使組織變脆，難切片。四氧化鋨具有極強(qiáng)的揮發(fā)性和毒性，在任何污染和光照條件下，都可能還原

20、成水和二氧化物而減弱固定效果，故不易長期保存。圖2-1 常規(guī)超薄切片標(biāo)本的制備過程（參考Hall JL，1978）1- 取材；2-醛類固定；3-緩沖液清洗；4-餓酸固定；5-緩沖液清洗；69-脫水；10-環(huán)氧丙烷浸透；11-包埋劑浸透；12-包埋；13-聚合；14-修塊；15-超薄切片；16-染色3.漂洗與脫水（1）將四氧化鋨固定后的材料取出，在脫水以前要進(jìn)行漂洗。先用吸水紙吸干凈四氧化鋨4固定液之后，用0.1molL的PBS漂洗6次，每次10min。以避免在脫水時四氧化鋨4與乙醇產(chǎn)生氧化還原反應(yīng)，生成沉淀，所以要徹底洗干凈。（2）將漂洗后的材料依次放入50乙醇、60乙醇、70乙醇、80乙醇、

21、90乙醇、無水乙醇與環(huán)氧丙烷，每級1520min，使組織中的水分充分除去。脫水劑一般用乙醇、丙酮和環(huán)氧丙烷等，利用它們具有能與水也能與包埋劑混溶的特點(diǎn)，以取代樣品中的水分，使水分充分除去。濃度梯度脫水是為了減少樣品收縮。4.浸透經(jīng)脫水后的材料在包埋以前要經(jīng)過浸透處理，即用包埋劑與脫水劑按濃度梯度分級換液，使包埋劑逐漸取代脫水劑滲透到組織中去，最終使組織細(xì)胞內(nèi)所有空隙均充滿包埋劑。具體操作方法：在室溫下或37條件下將樣品置入3:1的環(huán)氧丙烷與包埋劑的混合液，1030 min；1:1的環(huán)氧丙烷與包埋劑混合液，3060min；1:3的環(huán)氧丙烷與包埋劑混合液，12h或過夜；純包埋劑，25h或過夜。5.

22、包埋包埋的目的是讓樣品材料獲得一定的硬度、彈性和韌性，以便制成超薄切片。操作過程如下：在包埋模具內(nèi)滴一滴包埋劑，把樣品置入并使之定位于合適位置（依模具而異），緩緩注入包埋劑，然后放入烤箱中進(jìn)行聚合（使包埋劑固化）。控溫及時間依次為：37，12h；45，12h；60，36h。在包埋過程中，充分浸透的樣品包埋在包埋劑中，加溫使包埋劑逐漸由單體聚合成高分子，樣品及包埋介質(zhì)獲得高度的穩(wěn)定性、均勻性、合適的硬度和彈性。Epon812是一種優(yōu)良的包埋劑，為進(jìn)口環(huán)氧樹脂（epoxy resin），DDSA（dodecenyl succinic anhydride）為十二烷基琥珀酸酐，是一種軟化包埋塊的長鏈脂

23、肪族分子；MNA（methyl nadic anhydride）為甲基內(nèi)次甲基鄰苯二甲酸酐，可以硬化包埋塊；DMP-30為2,4,6-三（二甲氨基甲基）苯酚，可以加速固化。6.制備超薄切片制備超薄切片的主要步驟有：修塊（包埋塊粗修）、制備玻璃刀、制備支持膜、半薄切片、修塊（包埋塊細(xì)修）、制備超薄切片。（1）包埋塊粗修：在對包埋樣品進(jìn)行超薄切片之前，先要粗修包埋塊，機(jī)修、手修均可。一般可在解剖鏡下先小心地把塊頂端的包埋介質(zhì)修去，暴露出組織，再把樣品四周修成錐體形，頂面修成梯形。（2）玻璃刀的制備：超薄切片常用玻璃刀或鉆石刀。玻璃刀要用含7275二氧化硅、58mm厚的硬質(zhì)玻璃，并在專門的制刀機(jī)上制

24、備。制備好的玻璃刀還要在刀刃背部用膠布或銀膠帶圍成一個水槽（鉆石刀水槽是固定的），用石蠟封固，以方便切片的收集。（3）支持膜的制備：通常用銅網(wǎng)做超薄切片的載網(wǎng)，類似光鏡下載玻片的作用。電鏡細(xì)胞化學(xué)樣品則需要用鎳、鉑、金、不銹鋼或尼龍網(wǎng)等。載網(wǎng)直徑一般為3mm，厚2050pm，網(wǎng)孔數(shù)量1400目不等，形狀多種多樣。網(wǎng)上一般要覆蓋一層支持膜，膜的厚度約1020nm，以防止漏片、卷片，加強(qiáng)切片的穩(wěn)定性（較大的切片最好不用支持膜）。常用支持膜為Formvar膜（聚乙烯醇縮甲醛膜）或者火棉膠膜，也可用碳膜等，（4）切片：切片可分兩步進(jìn)行。半薄切片：先將粗修好的包埋塊在超薄切片機(jī)上切成厚2m的半薄切片，用

25、甲苯胺藍(lán)染色或亞甲藍(lán)、天青堿性品紅染色后，在光鏡下觀察。其目的是：可以根據(jù)半薄切片精確定位，準(zhǔn)確保留超薄切片位置，避免丟失有價值的結(jié)構(gòu)；了解樣品包埋質(zhì)量，以確定是否繼續(xù)做超薄切片；半薄切片可以得到比一般石蠟切片更清晰的圖像，所以便于進(jìn)行定量形態(tài)學(xué)分析，而且可與超薄切片對照觀察研究。超薄切片：超薄切片用超薄切片機(jī)完成。根據(jù)推進(jìn)原理，切片機(jī)分為熱膨脹式和機(jī)械推動式兩大類。TEM常規(guī)超薄切片厚度最佳值為5080nm，觀察干涉色可以判斷漂在刀槽里的切片厚度，以便確定用銅網(wǎng)撈取哪些切片。超薄切片要求在防震、恒溫和無較大氣流流通的環(huán)境下進(jìn)行，否則會影響切片效果。7.電子染色電鏡觀察時，切片需具有一定的反差

26、，故常用重金屬鹽染色，也稱電子染色。常用的重金屬鹽有鈾鹽和鉛鹽。（1）醋酸鈾可與大多數(shù)細(xì)胞成分結(jié)合，尤其易于與核酸結(jié)合，不易出現(xiàn)沉淀。但鈾鹽見光分解，應(yīng)避光染色。用醋酸鈾染液染1030min后，先用雙蒸水漂洗，再用濾紙吸干。（2）鉛鹽易與蛋白質(zhì)、糖類結(jié)合。因?yàn)殂U鹽與二氧化碳反應(yīng)生成碳酸鉛沉淀,所以防止鉛污染至關(guān)重要。用檸檬酸鉛染液染15min，立即用雙蒸水漂洗，用氫氧化鈉分化，再用雙蒸水漂洗，自然干燥后觀察。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析（一）透射電鏡的操作使用透射電鏡觀察生物組織切片的一般程序簡述如下：1.啟動穩(wěn)壓電源，接通冷卻循環(huán)水。2.啟動電鏡的真空泵抽真空。3.真空度達(dá)到要求后，將載有超薄切片的銅

27、網(wǎng)安放在樣品桿上并送入樣品室。4.啟動高壓，加熱燈絲獲得照明。5.先在低倍條件下調(diào)節(jié)亮度，利用樣品移動裝置選擇觀察視場，并聚焦需要觀察的標(biāo)本，再選擇適宜的觀察區(qū)域放大觀察。6.調(diào)節(jié)中間鏡電流，控制放大倍數(shù)，配合調(diào)節(jié)聚光鏡，選擇合適的亮度，精確調(diào)焦，消像散。7.將需要的結(jié)構(gòu)圖像照相記錄。8.電鏡使用完畢后，先關(guān)掉機(jī)器，再關(guān)冷卻水和總電源。（二）超薄切片的觀察在教師的指導(dǎo)下，將超薄切片樣品至于透射電子顯微鏡下，認(rèn)真仔細(xì)觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，選擇滿意的區(qū)域，進(jìn)行拍照。六、注意事項(xiàng)1.取材時動作一定要迅速，所用刀片要潔凈鋒利，否則會損傷樣品結(jié)構(gòu)。2.配置包埋劑的過程中，需要充分?jǐn)嚢?，在攪拌的同時，防止包

28、埋劑產(chǎn)生很多小氣泡，如產(chǎn)生需要將包埋劑放入40烘箱中，趕走小氣泡。否則樣品不能充分浸透。包埋過程中所使用的一切器皿和工具，都必須充分干燥。3.鋨酸即四氧化鋨揮發(fā)性強(qiáng)，屬強(qiáng)氧化劑，毒性強(qiáng)，因此使用時注意通風(fēng)，操作時應(yīng)在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。配置和儲存不當(dāng)會產(chǎn)生鋨黑，使其失效，因此需冷凍、密封和遮光保存，臨用前需徹底化開，以免濃度欠佳。4.醋酸鈾染液有微量放射性，能發(fā)熒光，需小心使用、避光保存。七、思考題1.簡述透射電鏡超薄切片制備的生物樣品取材過程中有那些要求，為什么? 2.簡述超薄切片制備技術(shù)中用戊二醛、鋨酸進(jìn)行雙固定的意義。II. 掃描電子顯微鏡的使用一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 了解解掃描電子顯微鏡樣品制備過

29、程。2. 了解掃描電子顯微鏡的使用技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）的分辨本領(lǐng)雖然不如透射電鏡（TEM），但卻具有很強(qiáng)的立體感，可以在亞細(xì)胞水平上生動地顯現(xiàn)生物樣品的三維結(jié)構(gòu)，適合于觀察樣品的表面形貌，在生物學(xué)上，通常于觀察研究組織和細(xì)胞表面的三維立體顯微及亞顯微結(jié)構(gòu)。掃描電鏡與透射電鏡相同的是都采用電子束作光源，電磁場作透鏡。所不同的主要是電子束、電子束照射樣品的方式和被利用來成像的信號電子不同。掃描電鏡主要是利用二次電子信號成像來觀察樣品的表面形態(tài)，即用極狹窄的電子束去掃描樣品，通過電子束與樣品的相互作用產(chǎn)生各種效應(yīng)，其中主

30、要是樣品的二次電子發(fā)射。二次電子能夠產(chǎn)生樣品表面放大的形貌像。這個像是在樣品被掃描時按時序建立起來的，即是使用逐點(diǎn)成像的方法獲得放大像。由于觀察目的不同，除了使用相同的固定液之外，SEM生物樣品制備與TEM有較大的差異。為了得到無損、真實(shí)而清晰的表面形貌結(jié)構(gòu)，在SEM樣品制備的全過程中都必須十分小心地保護(hù)被觀察面。在取材時，針對不同的樣品、不同的觀察要求，采取不同的技術(shù)，使被觀察表面充分地暴露出來；脫水時，為了避免觀察表面皺縮變形，設(shè)計(jì)了特殊的干燥方法；此外，還必須對樣品進(jìn)行導(dǎo)電處理，在樣品表面噴鍍一層厚度適當(dāng)、均勻的金屬膜。三、實(shí)驗(yàn)材料、試劑和儀器（一）儀器、用具掃描電子顯微鏡、臨界點(diǎn)干燥器

31、、離子濺射儀、超聲波清洗機(jī)、電吹風(fēng)機(jī)、磁力攪拌器、干燥器、拋光膏、刀片、剪刀、鑷子、樣品盒、酒精燈、牙簽、竹簽、培養(yǎng)皿、燒杯、量筒、量杯、注射器、載玻片、脫脂棉、導(dǎo)電膠。（二）材料小鼠小腸（三）試劑戊二醛溶液、1鋨酸溶液、L磷酸鹽緩沖溶液，醋酸異戊酯、液體二氧化碳、雙蒸水。四、方法與步驟1. 準(zhǔn)備樣品托用拋光膏擦凈樣品托，然后用丙酮洗凈拋光膏，電吹風(fēng)吹干備用。2. 取材注意保護(hù)好被觀察表面，徹底清洗干凈，暴露出最佳位置。樣品體積應(yīng)依據(jù)觀察要求及樣品托大小等酌情而定。3. 固定、漂洗和脫水由于掃描電鏡是觀察樣品某一表面形貌的，所以固定時間可以比透射電鏡短。另外，脫水時，到純乙醇級即可。漂洗可參考

32、透射電鏡樣品制備。4. 用醋酸異戊酯置換乙醇棄去乙醇，用醋酸異戊酯與純乙醇l:1的混合液浸1020min。棄去混合液浸入純醋酸異戊酯，浸1020min。5. 二氧化碳置換醋酸異戊酯及臨界點(diǎn)干燥從純醋酸異戊酯中取出樣品，保持濕狀態(tài)時置入臨界點(diǎn)干燥儀（critical point dryer）的樣品盒并放進(jìn)樣品室（預(yù)冷）。蓋緊樣品室，充入液體二氧化碳，液面高出盒面。緩慢排出氣體二氧化碳。直至樣品保持濕潤、周圍有少量液體二氧化碳為止。重復(fù)充液排氣23次。然后，向樣品盒內(nèi)注入液體二氧化碳（高度不超過80），加熱、加壓達(dá)到臨界點(diǎn)進(jìn)行干燥之后，排氣。取出樣品放入干燥器內(nèi)備用。臨界點(diǎn)干燥是利用液態(tài)二氧化碳的

33、臨界狀態(tài)下表面張力為零的特性，使樣品中的液態(tài)二氧化碳逸出，避免了表面張力對結(jié)構(gòu)的破壞。6. 粘貼樣品用少量導(dǎo)電膠涂在樣品托上，用鑷子輕夾樣品側(cè)面，觀察面朝上置于樣品托上。7. 離子濺射鍍膜把樣品托插入離子濺射儀真空室樣品臺上，操作濺射儀，可使樣品表面覆蓋一層1015nm厚的金屬膜。濺射鍍膜的基本原理是：高能粒子轟擊金屬靶（金、鉑、鈀銥合金等），靶金屬原子獲能后由靶表面逸出而沉積在樣品表面，形成連續(xù)的導(dǎo)電膜。這種金屬膜不僅可以導(dǎo)電，受激產(chǎn)生較強(qiáng)的二次電子發(fā)射，嚴(yán)格地控制膜的厚度，是獲得清晰、真實(shí)的二次電子表面形貌成像效果的重要條件。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析（一）掃描電鏡的操作掃描電鏡的一般操作步驟如下

34、：1.啟動電鏡。包括接通電源，開動真空系統(tǒng)進(jìn)行排氣，在真空度達(dá)到要求后，接通顯示單元電源。 2.放入樣品，注意調(diào)節(jié)樣品高度。 3.設(shè)定觀察條件。這些條件包括：加速電壓、束電流、光欄直徑、工作距離、放大倍率以及傾斜角等。注意選擇好視野。 4.聚焦，消像散。 5.照相攝影。根據(jù)底片特性選擇合適的反差、亮度及拍攝時間。 6. 電鏡使用完畢后，先關(guān)掉機(jī)器，再關(guān)掉電源和冷卻水。 （二）樣品標(biāo)本的觀察在教師的指導(dǎo)下，將樣品標(biāo)本至于掃描電子顯微鏡下，認(rèn)真仔細(xì)觀察標(biāo)本的表面形貌特征，進(jìn)行拍照。六、注意事項(xiàng)1.戊二醛用時現(xiàn)配，常與鋨酸配合使用，其缺點(diǎn)是不能增加樣品的二次電子發(fā)射率。2.四氧化鋨屬重金屬鹽類，具有

35、增加反差作用，因而可提高樣品的二次電子發(fā)射率，缺點(diǎn)是易氧化。3.進(jìn)行掃描電鏡標(biāo)本制備時，不同的樣品制樣方法有所不同，但都應(yīng)遵循以下原則：在樣品制備過程中，防止標(biāo)本污染和損傷，盡可能地保持原有結(jié)構(gòu)；在脫水和干燥處理時，盡量減少因標(biāo)本收縮導(dǎo)致的人為假象；在應(yīng)用組織導(dǎo)電法處理樣品時，應(yīng)充分漂洗，以防鏡筒污染。七、思考題1.分析掃描電鏡與透射電鏡的主要異同點(diǎn)。2.簡述掃描電子顯微鏡生物樣品制備的過程。實(shí)驗(yàn)三、細(xì)胞膜的滲透性一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模毫私饧?xì)胞膜的滲透性及各種物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的速度。二、實(shí)驗(yàn)原理人工合成的脂質(zhì)體主要用來研究細(xì)胞膜的滲透性及各類物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的速度。但不同分子通過脂雙層擴(kuò)散的速率差別很大，主要

36、取決于它們在脂類和水之間的分配系數(shù)及其分子的大小。分子越小，分配系數(shù)越大，通過質(zhì)膜的速率越快。小的、親脂性的、非極性分子容易溶解于脂雙層，可迅速透過脂雙層。小的、不帶電荷的極性分子如果時間足夠，也能很快透過脂雙層；大的、不帶電荷的極性分子可以跨膜擴(kuò)散運(yùn)輸，但比較困難；對于帶電荷的分子或離子，由于這些分子的電荷及高的水化度，因此不管多小，都很難透過脂雙層的疏水區(qū)，它們要通過載體介導(dǎo)的主動運(yùn)輸方式跨膜運(yùn)輸。與人工脂雙層膜不同的是，生物膜不但允許水和非極性分子借簡單的物理擴(kuò)散作用透過，還允許各種極性分子，如離子、糖、氨基酸、核苷酸及很多細(xì)胞代謝產(chǎn)物通過特有的機(jī)制通過。如果將紅細(xì)胞放置在各種溶液中，根

37、據(jù)紅細(xì)胞質(zhì)膜對各種溶質(zhì)的滲透性不同，有的溶質(zhì)可滲入，有的溶質(zhì)不能滲入。即使能滲入，速度也有差異。可通過觀察紅細(xì)胞溶血現(xiàn)象時間的不同來記錄滲入速度。血紅蛋白從紅細(xì)胞中逸出的現(xiàn)象稱為溶血現(xiàn)象。滲入紅細(xì)胞的溶質(zhì)能提高紅細(xì)胞滲透壓，使水進(jìn)入紅細(xì)胞，引起溶血及細(xì)胞膜破裂。此時光線較容易通過溶液，使溶液呈現(xiàn)透明即為溶血。由于溶質(zhì)透入速度不同，溶血時間也不同。因此，可通過溶血現(xiàn)象來測量各種物質(zhì)通透性的差別。三、材料、試劑和儀器1材料一齡雞，將雞血溶于含有抗凝劑的等滲液中（肝素鈉0.2mg/mL,一般范圍在；等滲液為）2. 試劑 0.17 molL氯化鈉，0.17 molL 氯化銨，0.17 molL硝酸鈉，

38、 0.32 molL葡萄糖，0.32 molL甘油，0.32 molL乙醇，0.32molL丙醇；0.12 molL硫酸 鈉，0.10 molL草酸鈉，0.10molL醋酸鈉，3. 器材試管，5mL量筒，滴管，載玻片，蓋玻片，光學(xué)顯微鏡。四、實(shí)驗(yàn)程序1血紅細(xì)胞懸液：用注射器吸入 2mL含有肝素的等滲液后從雞翼下靜脈取雞血5mL，加 入50mL燒杯，將雞血用等滲液進(jìn)行1：10稀釋。2溶血現(xiàn)象觀察：取試管一支加入3mL蒸餾水，加入1滴或2滴稀釋的雞血，輕混一下，然后靜止注意觀察溶液的顏色變化。由于紅細(xì)胞發(fā)生破裂，溶液顏色由渾濁的紅色逐漸清亮。此即為溶血現(xiàn)象。3雞紅細(xì)胞的滲透性記時比較：對上述溶液進(jìn)

39、行溶血記時比較，注意從滴進(jìn)血紅細(xì)胞開始記時，操作方法同2。 注意觀察顏色變化，回答是否有溶血現(xiàn)象？為什么？五、結(jié)果與分析將觀察到的現(xiàn)象記錄，并進(jìn)行分析試管編號溶液種類是否溶血溶血所需時間結(jié)果分析12345678910六、思考題1.推斷下列溶液的溶血反應(yīng)會如何。0.17 mol/L氯化鉀、0.17 molL硝酸鉀 0.12molL氯化鎂、0.12 molL氯化鈣、0.10 molL硫酸鉀、0.10molL醋酸鉀、0.10mol/L 檸檬酸鈉、0.32 molL，甘露醇、0.32mol/L 蔗糖。 2.溶液的滲透壓主要與哪些因素有關(guān)? 對簡單鹽溶液如何粗略計(jì)算出其滲透壓?實(shí)驗(yàn)四：細(xì)胞的凝集反應(yīng)一、

40、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)研究細(xì)胞凝集反應(yīng)的方法，了解細(xì)胞發(fā)生凝集反應(yīng)的原因。二 實(shí)驗(yàn)原理凝集素是一類含糖、并能與糖專一結(jié)合的蛋白質(zhì)，被認(rèn)為與糖的運(yùn)輸、儲存物質(zhì)的積累、細(xì)胞間的互作以及細(xì)胞分裂的調(diào)控有關(guān)。凝集素使細(xì)胞凝集是因?yàn)樗c細(xì)胞表面的糖分子連接，在細(xì)胞間形成“橋”的結(jié)果，加入與凝集素互補(bǔ)的糖可以抑制細(xì)胞發(fā)生凝集。大多數(shù)凝集素存在于儲藏器官中，作為一種氮源；對某些植物而言，受到危害時，凝集素作為一種防御蛋白發(fā)揮作用。凝集素與糖結(jié)合的活性及專一性決定其功能。三、實(shí)驗(yàn)材料與用品實(shí)驗(yàn)材料：馬鈴薯塊莖，韭菜葉片。試劑：(1)磷酸緩沖液：分別稱取NaCl7.2g、Na2HP041.48g、KH2P04用蒸餾水溶

41、解，混合后用蒸餾水定容至1000ml，用（NaOH）調(diào)pH值至7.2。(2)生理鹽水：0.9氯化鈉無菌水溶液(3)硫酸銨(4)石英砂儀器與器材：離心機(jī)，光學(xué)顯微鏡，研缽（2），藥匙（2），紗布，離心管（7ml，2個），帶刻度（2ml）滴管，25ml燒杯，玻璃棒，10ml量桶，載玻片，蓋玻片，濾紙，吸水紙。四、實(shí)驗(yàn)步驟：1. 2%雞血細(xì)胞制備：以無菌方法抽取雞的靜脈血液（含0.2肝素鈉）用生理鹽水洗3次，每次1500r/min離心5min，最后按沉淀壓積的紅細(xì)胞體積加生理鹽水配成2%雞血細(xì)胞液。2.馬鈴薯塊莖：(1)提取凝集素：稱取馬鈴薯去皮塊莖4g，加少許石英砂和磷酸緩沖液于研缽中研磨成勻漿，

42、最終加到5ml磷酸緩沖液，浸泡1.5 h，浸出的粗提液中含有可溶性馬鈴薯凝集素。(2)測定血凝活性：用滴管吸取馬鈴薯凝集素粗提液和2%雞血細(xì)胞液各一滴，置載玻片上，充分混勻，靜置10 min后于顯微鏡下觀察細(xì)胞凝集現(xiàn)象。用一滴磷酸緩沖液和一滴2%雞血細(xì)胞液混合作為對照觀察。3.韭菜葉片：(1)取韭菜葉片5g用蒸餾水洗凈剪碎，加少許石英砂和生理鹽水于研缽中研磨成勻漿，最終加到5ml生理鹽水，砂布過濾，濾液倒入2個離心管，平衡后在5000r/min下離心20 min，棄沉淀,留上清液。(2)上清液加相應(yīng)硫酸銨至60%飽和度沉淀（見附錄“不同飽和度硫酸胺沉淀蛋白質(zhì)表”）,邊加入邊用玻璃棒攪拌至完全溶

43、解。5000r/min下離心20 min，沉淀用1ml磷酸緩沖液溶解。(3)用滴管吸取韭菜凝集素提取液和2%雞血細(xì)胞液各一滴, 置載玻片上，充分混勻，靜置10 min后于光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞凝集現(xiàn)象。五、結(jié)果與分析繪圖表示血細(xì)胞凝集現(xiàn)象，并說明原因。六、思考題1.植物細(xì)胞凝集素在雞紅細(xì)胞凝集過程中起什么作用？2.哪些因素影響細(xì)胞凝集反應(yīng)？附錄“不同飽和度硫酸胺沉淀蛋白質(zhì)表”實(shí)驗(yàn)五：誘導(dǎo)細(xì)胞融合聚乙二醇法一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私饧?xì)胞融合的原理，初步掌握用PEG誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法。 二、實(shí)驗(yàn)原理細(xì)胞融合，即在自然條件下或利用人工法 (生物的、物理的、化學(xué)的)，使兩個或兩個以上 的細(xì)胞合并成一個具有雙核或多

44、核細(xì)胞的過程。 人工誘導(dǎo)細(xì)胞融合始于20世紀(jì)50年代，并迅速成為一門新興技術(shù)。由于不僅同種細(xì)胞可以融 合，種間遠(yuǎn)緣細(xì)胞也能融合，甚至于動植細(xì)胞也能合二為一，因此細(xì)胞融合技術(shù)目前較廣泛應(yīng)用 于細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)和醫(yī)學(xué)研究等各個領(lǐng)域， 并且取得顯著的成績。聚乙二醇(PEG)結(jié)構(gòu)為： CH2(OH)-(CH20CH2)n-CH2OH，相對分子質(zhì)量在2000-6000均可用作細(xì)胞融合劑。普遍認(rèn)為聚乙二醇分子能改變各類細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)，使兩細(xì)胞接觸點(diǎn)處質(zhì)膜的脂類分子發(fā)生疏散和重組，由于兩細(xì)胞接口處雙分子層質(zhì)膜的相互親和以及彼此的表面張力作用，從而使細(xì)胞發(fā)生融合：細(xì)胞融合率是指在顯微鏡的一個視野內(nèi)，已發(fā)生融合

45、的細(xì)胞其細(xì)胞核總數(shù)與該視野內(nèi)所有細(xì)胞(包括已融合的細(xì)胞)的細(xì)胞核總數(shù)之比，通常以百分比表示。該方法的優(yōu)點(diǎn)是：用法簡單，容易獲得融合體，融合效果好。三、實(shí)驗(yàn)材料與用品材料：雞血紅細(xì)胞。 試劑： (1)Alsver液：葡萄糖2.05 g，檸檬酸鈉 0.8 g，氯化鈉0.42 g，用檸檬酸溶液調(diào)節(jié)pH值至7.2,最后用雙蒸水定容至100 mL 即可。(2)0.85生理鹽水：0.85g氯化鈉溶于 100mL雙蒸水中。 (3)GKN液：氯化鈉8 g，氯化鉀0.4 g， 磷酸氫二鈉1.77g，磷酸二氫鈉0.69g，葡萄糖2 g，酚紅0.01 g，溶于1000mL雙蒸水中。 (4)Ringer溶液：氯化鈣0

46、.25g，氯化鉀 0.42g，氯化鈉8.5g溶于1000mL蒸餾水中。 (5)Hanks液：氯化鈣0.14g ,氯化鉀 0.4g , 磷酸二氫鉀0.06g ,氯化鎂0.10g , 氯化鈉8.0g ,碳酸氫鈉0.35g , 七水磷酸氫二鈉0.09g ,D-葡萄糖1.0g,酚紅0.01g溶于100mL蒸餾水中。(6)50PEG混合液：稱取少許PEG(Mw 4000)放人刻度離心管內(nèi)，在沸水浴中加熱， 使其溶化，待冷卻至50時，加入預(yù)熱至50 的等體積的GKN液，混勻。注意使用前配制。(7) 0.2%次甲基藍(lán)儀器：顯微鏡，離心機(jī)，水浴箱，電爐， 量筒，離心管，注射器，試管，移液管，燒杯， 吸管，載玻

47、片，蓋玻片。 四、實(shí)驗(yàn)步驟1.雞血紅細(xì)胞懸液的制備：用注射器吸入 1mLAlsver液后從雞翼下靜脈取雞血2mL，注 入刻度離心管內(nèi)，按照3：1(VV)加入6mL Alsver液混勻，放入4冰箱內(nèi)可保存3-4天。2.取細(xì)胞懸液1mL，移人10mL離心管， 加入4mL0.85生理鹽水混勻。1500rmin離心5 min。 3.棄上清液(用吸管吸去)，加0.85生理 鹽水至5mL，混勻后1500rmin離心5min。 4.重復(fù)上述條件，再離心洗滌1次。 5.收集最后1次離心沉淀的血細(xì)胞，加入 適量的GKN液或Ringer溶液，按壓積紅細(xì)胞體積配成10的紅細(xì)胞懸液。 6.取懸液1mL到1個試管中，加

48、入0.50.8 mL預(yù)熱的50PEG (慢慢沿著離心管壁逐滴加入,邊加邊輕搖離心管,使其混勻)， 37水浴中溫浴2min； 7.緩慢加入Hanks液5ml以終止PEG的作用, 輕輕吹打混勻,37水浴中靜止5min8.1000rmin離心5min,去上清,指彈使細(xì)胞團(tuán)分散.9.取細(xì)胞懸液1滴滴于載玻片上，再加入0.2%次甲基藍(lán)溶液1滴,染色3分鐘蓋上蓋玻片,顯微鏡下觀察細(xì)胞融合現(xiàn)象10.進(jìn)行多個視野的測定，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞平均融合率。 五、結(jié)果與分析1、繪制觀察到的融合細(xì)胞圖,計(jì)算觀察到的細(xì)胞融合率。2、試說明細(xì)胞融合的關(guān)鍵.六、注意事項(xiàng)如抗凝血要保存在冰箱，抗凝劑預(yù)先要進(jìn)行滅菌，采血在無菌條件下進(jìn)行。

49、PEG有毒，請操作過程中勿沾到皮膚上。實(shí)驗(yàn)六線粒體和液泡系的超活染色一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.觀察動植物活細(xì)胞內(nèi)線粒體、液泡系的形態(tài)數(shù)量與分布；2.學(xué)習(xí)一些細(xì)胞器的超活染色技術(shù)二、實(shí)驗(yàn)原理活體染色是指對生活有機(jī)體的細(xì)胞或組織能著色但又無毒害的一種染色方法.其目的是顯示生活細(xì)胞內(nèi)的某些結(jié)構(gòu),而不影響細(xì)胞的生命活動和產(chǎn)生任何理化變化以致引起細(xì)胞死亡.活染技術(shù)可用來研究生活狀態(tài)下的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理、病理狀態(tài).根據(jù)所用染色劑的性質(zhì)和染色方法的不同, 活體染色可分為體內(nèi)活染與體外活染兩類.體內(nèi)活染是以膠體狀的染料溶液注入動植物體內(nèi),染料的膠粒固定于細(xì)胞內(nèi)某些特殊結(jié)構(gòu)內(nèi)以達(dá)到易于識別的目的. 體外活染又稱超活染色

50、，是由活的動植物分離出部分細(xì)胞或組織小塊，以染料溶液浸染，染料因其“電化學(xué)”特性與被染部分相互吸引被選擇固定在活細(xì)胞的某種結(jié)構(gòu)中而顯色但不是任何染料都可作為活體染色劑使用,一般應(yīng)選擇那些無毒或毒性小的堿性染料(易溶于類脂質(zhì))并配成較稀的溶液來使用.詹納斯綠和中性紅兩種堿性染料是活體染色中重要的染料，對線粒體和液泡系的染色各有專一性詹納斯綠可專一性地對對線粒體進(jìn)行活染,這是由于線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素氧化酶系的作用,使染料始終保持氧化狀態(tài)(即有色狀態(tài)),呈藍(lán)綠色;而線粒體周圍的細(xì)胞質(zhì)中,這些染料被還原為無色的色基. 中性紅對液泡系的染色具有專一性,只將活細(xì)胞中的液泡系染成紅色,細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)不著色,這

51、可能與液泡中的某些蛋白質(zhì)有關(guān).三、實(shí)驗(yàn)用品. 器材：顯微鏡、恒溫水浴鍋、剪刀、鑷子、解剖刀、載玻片、蓋玻片、吸管、牙簽、吸水紙.試劑：Ringer溶液氯化鈉,;氯化鉀,;氯化鈣,1/5000詹納斯綠溶液稱取0.5g詹納斯綠溶于5ml Ringer溶液中,稍加熱(30-40)溶解,用濾紙過濾后,即為1%原液.取1ml1%原液加入49mlRinger溶液,即得1/5000工作液,將其裝入棕色瓶中備用.最好現(xiàn)配現(xiàn)用,以保持充分的氧化能力.1/3000中性紅溶液稱取0.5g中性紅溶于50ml Ringer液,稍加熱(30-40)溶解,用濾紙過濾,裝入棕色瓶中于暗處保存.臨用前取1ml1%原液加入29m

52、lRinger溶液,即得1/3000工作液,將其裝入棕色瓶中備用.3.材料：人口腔上皮細(xì)胞洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細(xì)胞綠豆幼根根尖四 實(shí)驗(yàn)方法（一）線粒體的超活染色與觀察. 人口腔黏膜上皮細(xì)胞線粒體的超活染色與觀察載玻片于37恒溫水?。?/5000詹納斯綠溶液2滴人口腔上皮細(xì)胞黏液牙簽刮取染色1015min，蓋上蓋玻片，吸去周圍染液，顯微鏡下觀察. 洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細(xì)胞線粒體的超活染色與觀察載玻片于37恒溫水浴：1/5000詹納斯綠B溶液滴洋蔥鱗莖內(nèi)表皮鑷子撕取染色1015min，吸去染液，加Ringer溶液滴，蓋上蓋玻片，顯微鏡下觀察（二）綠豆幼根根尖液泡系的中性紅染色觀察載玻片于37恒溫水?。撼跎G豆

53、幼苗根尖（12cm）縱切面切片片1/3000中性紅溶液滴染色510 min，吸去染液，加Ringer溶液滴，蓋上蓋玻片壓扁根尖，顯微鏡下觀察五、結(jié)果與分析1.繪出人口腔上皮細(xì)胞、洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細(xì)胞示線粒體的形態(tài)與分布并簡要分析；2.繪出綠豆幼根根尖細(xì)胞示液泡系的形態(tài)與分布并簡要分析實(shí)驗(yàn)七：葉綠體和細(xì)胞核的熒光觀察一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1. 觀察葉綠體的自發(fā)熒光和細(xì)胞核的次生熒光2. 熟悉熒光顯微鏡的使用方法二、實(shí)驗(yàn)原理:熒光顯微術(shù)是利用熒光顯微鏡對可發(fā)熒光的物質(zhì)進(jìn)行觀察的一種技術(shù)。某些物質(zhì)在定短波長的光(如紫外光)的照射下吸收光能進(jìn)入激發(fā)態(tài)，從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時，就能在極短的時間內(nèi)放射出比照射光波長更長

54、的光(如可見光)，這種光就稱為熒光。若停止供能熒光現(xiàn)象立即停止。有些生物體內(nèi)的物質(zhì)受激發(fā)光照射后直接發(fā)出熒光，稱為自發(fā)熒光(或直接熒光)，如葉綠索的火紅色熒光和木質(zhì)素的黃色熒光等。有的生物材料本身不發(fā)熒光，但它吸收熒光染料后同樣也能發(fā)出熒光，這種熒光稱為次生熒光(或間接熒光)，如葉綠體吸附吖啶橙后可發(fā)桔紅色熒光。利用熒光顯微鏡對可發(fā)熒光物質(zhì)進(jìn)行檢測時，將受到許多因素的影響，如溫度、光、淬滅劑等。因此在熒光觀察時應(yīng)抓緊時間。三、實(shí)驗(yàn)材料與用品：實(shí)驗(yàn)材料：煙草、大蔥葉片試劑：O.01%吖啶橙 ，0.9氯化鈉溶液。儀器與器材：刀片，眼科鑷子（直頭），載玻片，蓋薄片，滴管， 微量加樣器，槍頭、1.5m

55、l離心管、離心管架、錫箔紙、普通顯微鏡，熒光顯微鏡四、實(shí)驗(yàn)方法:1、徒手切片或撕取葉片表皮條在普通顯微鏡觀察葉綠體形態(tài)用刀片將新鮮的葉片削出一斜面，沿斜面切下一薄層完整組織，置于載玻片上，遞加1-2滴0.9NaCl溶液，加蓋片后輕壓，置顯微鏡下觀察。記錄細(xì)胞中葉綠體的形態(tài)、數(shù)目和分布狀況。2、徒手切片葉綠體自發(fā)熒光觀察相同方法制備葉片徒手切片，置熒光顯微鏡下，用藍(lán)光激發(fā)光照射標(biāo)本，觀察記錄細(xì)胞中葉綠體的形態(tài)、數(shù)目和分布狀況。3、葉綠體和細(xì)胞核次生熒光觀察葉片的徒手切片或表皮條至于載玻片上，遞加1-2滴O.01%吖啶橙，染色1分鐘，加蓋玻片，置熒光顯微鏡下觀察。用紫外激發(fā)光照射標(biāo)本，記錄細(xì)胞中葉綠體的形態(tài)、數(shù)目和分布狀況。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析1、普通光鏡下，可看到表皮細(xì)胞內(nèi)葉綠體數(shù)量要比葉肉細(xì)胞少。葉綠體為綠色橄欖形，在高倍鏡