幾種滅菌法的優(yōu)缺點(diǎn)及技術(shù)參數(shù)

1、幾種常用 滅菌法 的優(yōu)缺點(diǎn)及技術(shù)參數(shù)滅菌法系指用適當(dāng)?shù)奈锢砘蚧瘜W(xué)手段將物品中活的微生物殺滅或除去,從而使物品殘存活微生物的概率下降至預(yù)期的無菌保證水平的方法。本法適用于制劑、原料、輔料及醫(yī)療器械等物品的滅菌。無菌物品是指物品中不含任何活的微生物。對于任何一批滅菌產(chǎn)物品來說而言,絕對無菌既無法保證也無法用試驗(yàn)來證實(shí)。一批物品的無菌特性只能相對地通過物品中活微生物的概率低至某個可接受的水平來表述,即無菌保證水平(Sterility assurance level,簡稱SAL。實(shí)際生產(chǎn)過程中,滅菌是指將物品中污染微生物的殘存概率下降至一定水平,以無菌保證水平SAL(sterility assuran

2、ce level表示預(yù)期的無菌保證水平。最終滅菌的產(chǎn)物品微生物存活概率,即無菌保證水平不得高于10-6。已滅菌產(chǎn)物品達(dá)到的無菌保證水平可通過驗(yàn)證確定。滅菌產(chǎn)物品的無菌保證不能依賴于最終產(chǎn)品的無菌檢驗(yàn),而是取決于生產(chǎn)過程中采用合格的滅菌工藝、嚴(yán)格的GMP管理和良好的無菌保證體系。滅菌工藝的確定應(yīng)綜合考慮被滅菌物品的性質(zhì)、滅菌方法的有效性和經(jīng)濟(jì)性、滅菌后物品的完整性和穩(wěn)定性等因素。滅菌程序的驗(yàn)證是無菌保證的必要條件。滅菌程序經(jīng)驗(yàn)證后,方可交付正式使用。驗(yàn)證內(nèi)容包括:(1撰寫驗(yàn)證方案及制定評估標(biāo)準(zhǔn)。(2確認(rèn)滅菌設(shè)備技術(shù)資料齊全、安裝正確,并能處于正常運(yùn)行(安裝確認(rèn)。(3確認(rèn)關(guān)鍵控制設(shè)備和儀表滅菌設(shè)備

3、、關(guān)鍵控制和記錄系統(tǒng)能在規(guī)定的參數(shù)范圍內(nèi)正常運(yùn)行(運(yùn)行確認(rèn)。(4采用被滅菌物品或模擬物品按預(yù)定滅菌程序進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn),確認(rèn)滅菌效果各關(guān)鍵工藝參數(shù)符合預(yù)定標(biāo)準(zhǔn),確定經(jīng)滅菌物品的無菌保證水平符合規(guī)定(性能確認(rèn)。 (5匯總并完善各種文件和記錄,撰寫驗(yàn)證報告。日常生產(chǎn)中,應(yīng)對滅菌程序的運(yùn)行情況進(jìn)行監(jiān)控,確認(rèn)關(guān)鍵參數(shù)(如溫度、壓力、時間、濕度、滅菌氣體濃度及吸收的輻照劑量等均在驗(yàn)證確定的范圍內(nèi)。滅菌程序應(yīng)定期進(jìn)行再驗(yàn)證。當(dāng)滅菌設(shè)備或程序發(fā)生變更(包括滅菌物品裝載方式和數(shù)量的改變時,應(yīng)進(jìn)行再驗(yàn)證。產(chǎn)物品的無菌保證水平與滅菌工藝、滅菌前產(chǎn)物品被污染的程度及污染菌的特性相關(guān)。因此,應(yīng)根據(jù)滅菌工藝的特點(diǎn)制定嚴(yán)格監(jiān)

4、控被滅菌物品滅菌前的微生物污染水平及污染菌的耐受性限度并進(jìn)行監(jiān)控,并在生產(chǎn)的各個環(huán)節(jié)采取各種措施降低污染,確保微生物污染控制在規(guī)定的限度內(nèi)。滅菌的冷卻階段,應(yīng)采取措施防止已滅菌物品被再次污染。任何情況下,都應(yīng)要求容器及其密封系統(tǒng)確保產(chǎn)物品在有效期內(nèi)符合無菌要求。滅菌方法常用的滅菌方法有濕熱滅菌法、干熱滅菌法、輻射滅菌法、氣體滅菌法和過濾除菌法?？筛鶕?jù)被滅菌物品的特性采用種或多種方法組合滅菌。只要產(chǎn)物品允許,應(yīng)盡可能選用最終滅菌法滅菌。若產(chǎn)物品不適合采用最終滅菌法,可選用過濾除菌法或無菌生產(chǎn)工藝達(dá)到無菌保證要求,只要可能,應(yīng)對非最終滅菌的產(chǎn)物品作補(bǔ)充性滅菌處理(如流通蒸汽滅菌。一、濕熱滅菌法本法

5、系指將物品置于滅菌柜內(nèi)利用高壓飽和蒸汽、過熱水噴淋等手段使微生物菌體中的蛋白質(zhì)、核酸發(fā)生變性而殺滅微生物的方法。該法滅菌能力強(qiáng),為熱力滅菌中最有效、應(yīng)用最廣泛的滅菌方法。藥品、容器、培養(yǎng)基、無菌衣、膠塞以及其他遇高溫和潮濕不發(fā)生變化或損壞的物品,均可采用本法滅菌。流通蒸汽不能有效殺滅細(xì)菌孢子,一般可作為不耐熱無菌產(chǎn)品的輔助滅菌手段。濕熱滅菌條件的選擇應(yīng)考慮滅菌物品的熱穩(wěn)定性、熱穿透力、微生物污染程度等因數(shù)。濕熱滅菌條件通常采用121×15min、121×30min或116×40min的程序,也可采用其他溫度和時間參數(shù),但無論采用何種滅菌溫度和時間參數(shù),都必須保證證

6、明所采用的滅菌工藝和監(jiān)控措施在日常運(yùn)行過程中能確保物品滅菌后的SAL10-6。當(dāng)滅菌程序的選定采用F0值概念時(F值系當(dāng)采用非121的滅菌條件時,該滅菌程序致死微生物的效果與121的滅菌效果相同,在121下的滅菌時間,應(yīng)采取特別措施來確保滅菌物品能得到足夠的無菌保證,此時,除對滅菌程序進(jìn)行驗(yàn)證外,還必須在生產(chǎn)過程中連續(xù)地、嚴(yán)格地對微生物進(jìn)行監(jiān)控,證明污染的微生物指標(biāo)低于設(shè)定的限度。對熱穩(wěn)定的物品,可采用滅菌工藝可首選過度殺滅法,其SAL應(yīng)10-12。以保證滅菌物品獲得足夠的無菌保證值。熱穩(wěn)定性較差產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)滅菌時間F0指滅菌溫度為121.1,生物指示菌的耐熱參數(shù)D值為1分,滅菌溫度系數(shù)Z值為1

7、0.0時的標(biāo)準(zhǔn)滅菌時間(121.1下計算的微生物等效滅活率一般不低于8min。如產(chǎn)品的熱穩(wěn)定性很差時,可允許濕熱滅菌的F0低于8,此情況下,應(yīng)在生產(chǎn)全過程中,對產(chǎn)品中污染的微生物嚴(yán)加監(jiān)控,并采取各種措施降低微生物污染水平,確保被滅菌產(chǎn)品達(dá)到無菌保證要求。熱不穩(wěn)定性物品,其滅菌工藝的確定依賴于在一定的時間內(nèi),一定的生產(chǎn)批次的滅菌物品滅菌前微生物污染的水平及其耐熱性污染的情況。因此,日常生產(chǎn)全過程應(yīng)對產(chǎn)品中污染的微生物嚴(yán)加監(jiān)控,并采取各種措施降低物品微生物污染水平,特別是防止耐熱菌的污染。熱值一般不低于8min。不穩(wěn)定性產(chǎn)品的F采用濕熱滅菌,被滅菌物品應(yīng)有適當(dāng)?shù)难b載方式,不能排列過密,以保證滅菌的

8、有效性和均一性。濕熱滅菌法應(yīng)確認(rèn)滅菌柜在不同裝載時可能存在的冷點(diǎn)。當(dāng)用生物指示劑進(jìn)一步確認(rèn)滅菌效果時,應(yīng)將其置于冷點(diǎn)處。本法常用的生物指示劑為嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子(Spores of Bacillus stearothermophilus。二、干熱滅菌法本法系指將物品置于干熱滅菌柜、隧道滅菌器等設(shè)備中、利用干熱空氣達(dá)到殺滅微生物或消除熱原物質(zhì)的方法。適用于耐高溫但不宜用濕熱滅菌法滅菌物品的滅菌,如玻璃器具、金屬材質(zhì)制容器、纖維制品、固體試藥、液狀石蠟等均可采用本法滅菌。干熱滅菌條件一般為160170×120min以上、170180×60min以上或250×45mi

9、n以上,也可采用其他溫度和時間參數(shù)。無論采用何種滅菌條件,應(yīng)保證滅菌后的產(chǎn)品的SAL10-6。采用干熱過度殺滅的后產(chǎn)品的SAL應(yīng)10-12,此時物品一般無需進(jìn)行滅菌前污染微生物的測定。250×45min的干熱滅菌也可除去無菌產(chǎn)品包裝容器及有關(guān)生產(chǎn)灌裝用具中的熱原物質(zhì)。采用干熱滅菌時,被滅菌物品應(yīng)有適當(dāng)?shù)难b載方式,不能排列過密,以保證滅菌的有效性和均一性。干熱滅菌法應(yīng)確認(rèn)滅菌柜中的溫度分布符合設(shè)定的標(biāo)準(zhǔn)及確定最冷點(diǎn)位置等。常用的生物指示劑為枯草芽孢桿菌孢子(Spores of Bacillus subtilis。細(xì)菌內(nèi)毒素滅活驗(yàn)證試驗(yàn)是證明除熱原過程有效性的試驗(yàn)。一般將不小于1000單

10、位的細(xì)菌內(nèi)毒素加入待去熱原的物品中,證明該去熱原工藝能使內(nèi)毒素至少下降3個對數(shù)單位。細(xì)菌內(nèi)毒素滅活驗(yàn)證試驗(yàn)所用的細(xì)菌內(nèi)毒素一般為大腸桿菌內(nèi)毒素(Eacherichia coli endoxin。三、輻射滅菌法本法系指將滅菌產(chǎn)物品置于適宜放射源輻射的射線或適宜的電子加速器發(fā)生的電子束中進(jìn)行電離輻射而達(dá)到殺滅微生物的方法。本法最常用的為60Co-射線輻射滅菌。醫(yī)療器械、容器、生產(chǎn)輔助用品、不受輻射破壞的原料藥及成品等均可用本法滅菌。采用輻射滅菌法滅菌后的無菌物產(chǎn)品其SAL應(yīng)10-6。射線輻射滅菌所控制的參數(shù)主要是輻射劑量(指滅菌物品的吸收劑量。該劑量的制定應(yīng)考慮滅菌物品的適應(yīng)性及可能污染的微生物最

11、大數(shù)量及最強(qiáng)抗輻射力,所使用的劑量事先應(yīng)驗(yàn)證不影響被滅菌物品的安全性、有效性及穩(wěn)定性。常用的輻射滅菌吸收劑量為25kGy。對最終產(chǎn)品、原料藥、某些醫(yī)療器材應(yīng)盡可能采用低輻射劑量滅菌。滅菌前,應(yīng)對被滅菌物品微生物污染的數(shù)量和抗輻射強(qiáng)度進(jìn)行測定,以評價滅菌過程賦予該滅菌物品的無菌保證水平。對于已設(shè)定的劑量,應(yīng)定期審核,以驗(yàn)證其有效性。滅菌時,應(yīng)采用適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)或物理方法對滅菌物品吸收的輻射劑量進(jìn)行監(jiān)控,以充分證實(shí)滅菌物品吸收的劑量是在規(guī)定的限度內(nèi)。如采用與滅菌物品一起被輻射的放射性劑量計,劑量計要置于規(guī)定的部位。在初安裝時劑量計應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)源進(jìn)行校正,并定期進(jìn)行再校正。60Co-射線輻射滅菌法常用的生物

12、指示劑為短小芽孢桿菌孢子(Spores of Bacillus pumilus。四、氣體滅菌法本法系指用化學(xué)消毒劑形成的氣體殺滅微生物的方法。常用的化學(xué)消毒劑為環(huán)氧乙等,本法適用于在氣體中穩(wěn)定的物品滅菌。采用氣烷、氣態(tài)過氧化氫、甲醛、臭氧(O3體滅菌法時,應(yīng)注意滅菌氣體的可燃可爆性、致畸性和殘留毒性。本法中最常用的氣體是環(huán)氧乙烷,一般與80%90%的惰性氣體混合使用,在充有滅菌氣體的高壓腔室內(nèi)進(jìn)行。該法可用于醫(yī)療器械,塑料制品等不能采用高溫滅菌的物品滅菌。含氯的物品及能吸附環(huán)氧乙烷的物品則不宜使用。采用環(huán)氧乙烷滅菌時,滅菌柜內(nèi)的溫度、濕度、滅菌氣體濃度、滅菌時間是影響滅菌效果的重要因數(shù)。可采用

13、下列滅菌條件:溫度 (54±10相對濕度 (60±10%滅菌壓力 8×105Pa滅菌時間 90min滅菌條件應(yīng)予驗(yàn)證。滅菌時,將滅菌腔室先抽成真空,然后通入蒸汽使腔室內(nèi)達(dá)到設(shè)定的溫濕度平衡的額定值,再通入經(jīng)過濾和預(yù)熱的環(huán)氧乙烷氣體。滅菌過程中,應(yīng)嚴(yán)密監(jiān)控腔室的溫度、濕度、壓力、環(huán)氧乙烷濃度及滅菌時間。必要時使用生物指示劑監(jiān)控滅菌效果。本法滅菌程序的控制具有一定難度,整個滅菌過程應(yīng)在技術(shù)熟練人員的監(jiān)督下進(jìn)行。滅菌后,應(yīng)采取新鮮空氣置換,使殘留環(huán)氧乙烷和其他易揮發(fā)性殘渣消散。并對滅菌物品中的環(huán)氧乙烷殘留物和反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行監(jiān)控,以證明其不超過規(guī)定的限度濃度,避免產(chǎn)生毒性。

14、采用環(huán)氧乙烷滅菌時,應(yīng)進(jìn)行泄漏試驗(yàn),以確認(rèn)滅菌腔室的密閉性。滅菌程序確認(rèn)時,還應(yīng)考慮物品包裝材料和滅菌腔室中物品的排列方式對滅菌氣體的擴(kuò)散和滲透的影響。生物指示劑一般采用枯草芽孢桿菌孢子(Spores of Bacillus subtilis。五、過濾除菌法本法系利用細(xì)菌不能通過致密具孔濾材的原理以除去氣體或液體中微生物的方法。常用于氣體、熱不穩(wěn)定的藥品溶液或原料的除菌。除菌過濾器采用孔徑分布均勻的微孔濾膜作過濾材料,微孔濾膜分親水性和疏水性兩種。濾膜材質(zhì)依過濾物品的性質(zhì)及過濾目的而定。藥品生產(chǎn)中采用的除菌濾膜孔徑一般不超過0.22m。過濾器的孔徑定義來自過濾器對微生物的截留,而非平均孔徑的分

15、布系數(shù)。所以,用于最終除菌的過濾器必須選擇具有截流實(shí)驗(yàn)證明的除菌級過濾器。過濾器不得對被濾過成分有吸附作用,也不能釋放物質(zhì),過濾器對濾液的吸附不得影響藥品質(zhì)量,不得有纖維脫落,禁用含石棉的過濾器。過濾器的使用者應(yīng)了解濾液過濾過程中的析出物性質(zhì)、數(shù)量并評估其毒性影響。濾器和濾膜在使用前應(yīng)進(jìn)行潔凈處理,并用高壓蒸汽進(jìn)行滅菌或作在線滅菌。更換品種和批次應(yīng)先清洗濾器,再更換濾芯或?yàn)V膜或直接更換濾器。過濾過程中無菌保證與過濾液體的初始生物負(fù)荷及過濾器的對數(shù)下降值LRV(Log reduction value有關(guān)。LRV系指規(guī)定條件下,被過濾液體過濾前的微生物數(shù)量與過濾后的微生物數(shù)量比的常對數(shù)值。即:-L

16、gNLRV=IgN為產(chǎn)品除菌前的微生物數(shù)量。式中NN為產(chǎn)品除菌后的微生物數(shù)量。LRV 用于表示過濾器的過濾除菌效率，對孔徑為 022m 的過濾器而言，要求每 1cm2 有效過濾面積的 LRV 應(yīng)不小于 7。因此過濾除菌時，被過濾產(chǎn)品總的污染量應(yīng)控制 在規(guī)定的限度內(nèi)。為保證過濾除菌效果，可使用兩個除菌級的過濾器串連過濾，或在灌 裝前用過濾器進(jìn)行再次過濾。 在過濾除菌中，一般無法對全過程中過濾器的關(guān)鍵參數(shù)(濾膜孔徑的大小及分布， 濾膜的完整性及 LRV進(jìn)行監(jiān)控。 因此， 在每一次過濾除菌前后均應(yīng)作濾器的完整性試驗(yàn)， 即氣泡點(diǎn)試驗(yàn)或壓力維持試驗(yàn)或氣體擴(kuò)散流量試驗(yàn)， 確認(rèn)濾膜在除菌過濾過程中的有效 性

17、和完整性。完整性的測試標(biāo)準(zhǔn)來自于相關(guān)細(xì)菌截留實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。除菌過濾器的使用時間 應(yīng)進(jìn)行驗(yàn)證，一般不應(yīng)超過一個工作日，否則應(yīng)進(jìn)行驗(yàn)證。 過濾除菌法常用的生物指示劑為缺陷假單胞菌(Pseudomonas diminuta。 通過過濾除菌法達(dá)到無菌的產(chǎn)品應(yīng)嚴(yán)密監(jiān)控其生產(chǎn)環(huán)境的潔凈度，建議應(yīng)在無菌環(huán) 境下進(jìn)行過濾操作。相關(guān)的設(shè)備、包裝容器、塞子及其他物品應(yīng)采用適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行滅 菌，并防止再污染。 六、無菌生產(chǎn)工藝 無菌生產(chǎn)工藝系指必須在無菌控制條件下生產(chǎn)無菌制劑的方法，無菌分裝及無菌凍 干是最常見的無菌生產(chǎn)工藝。后者在工藝過程中應(yīng)采用過濾除菌法。 無菌生產(chǎn)工藝應(yīng)嚴(yán)密監(jiān)控其生產(chǎn)環(huán)境的潔凈度，并應(yīng)在無菌控制的

18、環(huán)境下進(jìn)行過濾 操作。相關(guān)的設(shè)備、包裝容器、塞子及其他物品應(yīng)采用適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行滅菌，并防止被 再次污染。 無菌生產(chǎn)工藝過程的無菌保證應(yīng)通過培養(yǎng)基無菌灌裝摸擬試驗(yàn)驗(yàn)證。在生產(chǎn)過程 中，應(yīng)嚴(yán)密監(jiān)控生產(chǎn)環(huán)境的無菌空氣質(zhì)量、操作人員的素質(zhì)、各物品的無菌性。 無菌生產(chǎn)工藝應(yīng)定期進(jìn)行驗(yàn)證，包括對環(huán)境空氣過濾系統(tǒng)有效性驗(yàn)證及培養(yǎng)基模擬 灌裝試驗(yàn)。 生物指示劑 生物指示劑系一類特殊的活微生物制品，可用于確認(rèn)滅菌設(shè)備的性能、滅菌程序的 驗(yàn)證、生產(chǎn)過程滅菌效果的監(jiān)控等。用于滅菌驗(yàn)證中的生物指示劑一般是細(xì)菌的孢子。 1、制備生物指示劑用微生物的基本要求 不同的滅菌方法使用不同的生物指示劑，制備生物指示劑所選用的微生

19、物必須具備 以下特性： 6 (1菌種的耐受性應(yīng)大于需滅菌產(chǎn)品中所有可能污染菌的耐受性。 (2菌種應(yīng)無致病性。 (3菌株應(yīng)穩(wěn)定。存活期長，易于保存。 (4易于培養(yǎng)。若使用休眠孢子，生物指示劑中休眠孢子含量要在 90以上。 2生物指示劑的制備 生物指示劑的制備應(yīng)按一定的程序進(jìn)行，制備前，需先確定所用微生物的特性，如 D 值（微生物的耐熱參數(shù)，系指一定溫度下，將微生物殺滅 90%所需的時間，以分表示） 等。 菌株應(yīng)用適宜的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。 培養(yǎng)物應(yīng)制成懸浮液， 其中孢子的數(shù)量應(yīng)占優(yōu)勢， 孢子應(yīng)懸浮于無營養(yǎng)的液體中保存。 生物指示劑中包含一定數(shù)量的一種或多種孢子，可制成多種形式，通常是將定數(shù) 量的孢子

20、附著在惰性的載體上，如濾紙條、玻片、不銹鋼、塑料制品等；孢子懸浮液也 可密封于安瓿中；有的生物指示劑還配有培養(yǎng)基系統(tǒng)。D 值除與滅菌條件相關(guān)外，還與 微生物存在的環(huán)境有關(guān)。因此，一定形式的生物指示劑制備完成后，應(yīng)測定 D 值和孢子 總數(shù)。生物指示劑應(yīng)選用合適的材料包裝，并設(shè)定有效期。載體和包裝材料在保護(hù)生物 指示劑不致污染的同時，還應(yīng)保證滅菌劑穿透并能與生物指示劑充分接觸。載體和包裝 的設(shè)計原則是便于貯存、運(yùn)輸、取樣、轉(zhuǎn)移接種。 有些生物指示劑可直接將孢子接種至液體滅菌物或具有與其相似的物理和化學(xué)特 性的替代品中。使用替代品時，應(yīng)用數(shù)據(jù)證明二者的等效性。 3生物指示劑的應(yīng)用 在滅菌程序的驗(yàn)證中

21、，盡管可通過滅菌過程某些參數(shù)的監(jiān)控來評估滅菌效果，但生 物指示劑的被殺滅程度，則是評價一個滅菌程序有效性最直觀的指標(biāo)?？墒褂檬惺鄣臉?biāo) 準(zhǔn)生物指示劑， 也可使用由日常生產(chǎn)污染菌監(jiān)控中分離的耐受性最強(qiáng)的微生物制備的孢 子。在生物指示劑驗(yàn)證試驗(yàn)中，需確定孢子在實(shí)際滅菌條件下的耐受性 D 值，并測定孢 子的純度和數(shù)量。驗(yàn)證時，生物指示劑的微生物用量應(yīng)比日常檢出的微生物污染量大， 耐受性強(qiáng)，以保證滅菌程序有更大的安全性。在最終滅菌法中，生物指示劑應(yīng)放在滅菌 柜的不同部位。并避免指示劑直接接觸到被滅菌物品。生物指示劑按設(shè)定的條件滅菌后 取出，分別置培養(yǎng)基中培養(yǎng)，確定生物指示劑中的孢子是否被完全殺滅。 過度

22、殺滅產(chǎn)品滅菌驗(yàn)證一般不考慮微生物污染水平，可采用市售的生物指示劑。對 滅菌手段耐受性差的產(chǎn)品，設(shè)計滅菌程序時，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)預(yù)計在該生產(chǎn)工藝中產(chǎn)品微生物 7 污染的水平，選擇生物指示劑的菌種和孢子數(shù)量。這類產(chǎn)品的無菌保證應(yīng)通過監(jiān)控每批 滅菌前的微生物污染的數(shù)量、耐受性和滅菌程序驗(yàn)證所獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行評估。 4常用生物指示劑 (1 濕 熱 滅 菌 法 濕熱滅菌法最常用的生物指示劑為嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子 (Spores of Bacillus stearothermophilus，如 NCTC 10 007、NCIMB8157、ATCC 7953。 D 值為 1.53.0min，每片(或每瓶活孢子數(shù) 5×1055×106 個，在 121、19min 下應(yīng) 被完全殺滅。此外，還可使用生孢梭菌孢子（Spores of Clostridium sporogenes 如 NCTC 8594、NCIMB 8053、ATCC 7955，D 值為 0.40.8min。 (2干熱滅菌法 干熱滅菌法最常用的生物指示劑為枯草芽孢桿菌孢子(Spores of Bacillus subtilis，如 NCIMB 8058、ATCC 9372。D 值