黑曲霉發(fā)酵玉米淀粉生產(chǎn)檸檬酸

1、黑曲霉發(fā)酵玉米淀粉生產(chǎn)檸檬酸()清華大學(xué)學(xué)報(bào)自然科學(xué)版15?34 ()Jo u rna l o f T singh uaU n ive r sity Sc i & T ech第6期 第52, 55頁 1998年 第38卷黑曲霉發(fā)酵玉米淀粉生產(chǎn)檸檬酸石憶湘 , 劉祖同清華大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)系 ,北京 100084文 摘 用紫外線和亞硝基胍誘變相結(jié)合的方法,從野生黑使得一些檸檬酸生產(chǎn)企業(yè)無法承受。而玉米粉資源曲霉菌株出發(fā),經(jīng)多次誘變篩選 ,得到一株能夠較好地利用豐富、價(jià)格低廉 ,完全可能代替薯干進(jìn)行發(fā)酵。用玉 玉米淀粉生產(chǎn)檸檬酸的黑曲霉菌株 . 95 。對(duì) . A n ig e r A n ig

2、e r米淀粉生產(chǎn)檸檬酸受到各方面的密切關(guān)注。95 在搖瓶和發(fā)酵罐上用玉米淀粉發(fā)酵產(chǎn)生檸檬酸的適宜條1 材料和方法件作了詳細(xì)研究。經(jīng)過比較,認(rèn)為搖瓶產(chǎn)生檸檬酸的適宜培(養(yǎng)基配方及發(fā)酵條件為 :玉米淀粉 20% 均為質(zhì)量分?jǐn)?shù) ,下 1. 1材料)()同 、2% 、 012% 、70. r N H 4 SO 4 KH 2PO 4 M gSO 4 H 2O出 發(fā) 菌株本實(shí)驗(yàn)室保存的野生黑曲霉0.05%,甲醇3%,初始。接種液體種子 5% , 30? 200 3. 0pH ()菌株。 其檸檬酸產(chǎn)酸率不超過A sp e rg illu sn ige r發(fā)酵 7 ,檸檬酸產(chǎn)量 1018% 。在 6. 6的

3、2 型 ?rm in dL B io f lo2% 。發(fā)酵罐上設(shè)定30 ?, 500, 600 ?, 2. 5, 4. 0, 1. 2rm in pH培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基 : 麥芽汁培 ? 的通氣量 , 發(fā)酵 132 , 檸檬酸產(chǎn)量為 913% ?？捎脙r(jià)格 L m in h)( 養(yǎng)基。 其他培養(yǎng)基的配方見表 1 為質(zhì)量分?jǐn)?shù)。 w 低廉、來源豐富的玉米淀粉代替?zhèn)鹘y(tǒng)的薯干 , 作為發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸的原料,為實(shí)際生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。()() ()搖瓶初篩1 、復(fù)篩2 和選定的3培養(yǎng)基配方表1關(guān)鍵詞黑曲霉 ;檸檬酸 ;玉米淀粉;發(fā)酵 100w 分類號(hào)197939Q ()()()成分1 2 3蔗糖1

4、4-玉米淀粉-1520檸檬酸是目前以微生物發(fā)酵生產(chǎn)的重要有機(jī)酸()NH4之一 ,它的用途非常廣泛,需求日益增長。目前國內(nèi)5KH 2PO 4檸檬酸年產(chǎn)量約215 10 其中半數(shù)以上供出口, 0. 2 0. 2 0. 2 t7rM gSO 4H 2O之用。從世界的需求來看, 2000年總需求預(yù)計(jì)將達(dá)0. 05 0.050.055到 71510 左右 ,而目前世界檸檬酸總生產(chǎn)能力甲醇t - - 3 5約61510? 缺口很大。80年代 ,我國國內(nèi)的檸, ta方法1. 2檬酸消費(fèi)急劇上升,速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了西方發(fā)達(dá)國家。隨著人民生活水平的提高 , 硝基胍誘變酸制品的需求量猛增對(duì)食品和飲料等含檸檬,但就人均

5、消費(fèi)量來看誘變方法,我國的(紫外線誘變培養(yǎng)方法,亞取孢子剛剛成熟即30? 培養(yǎng)了2 檸檬酸消費(fèi)還是很低的,以用于食品和飲料的檸檬) , 3的.麥芽汁斜面,總計(jì)加入約30 d A n ig e r mL酸為例 , 1990年美國和日本的人均消費(fèi)量分別為無菌生理鹽水洗孢子,將洗下的孢子轉(zhuǎn)移到種子培384和118 ,而我國則僅為20 左右,市場潛力g gg養(yǎng)基中 , 30?, 200培養(yǎng)約24, 27。此時(shí) .?rm in hA巨大 ,因此增加檸檬酸生產(chǎn)不僅可以滿足國內(nèi)日益在種子培養(yǎng)基中形成直徑約1, 2的菌球增長的需要 ,也是換取外匯的重要手段之一。 n ig e r mm體。每瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中接種

6、5這樣的液體種子 ,mL 我國的檸檬酸生產(chǎn)主要以薯干為原料進(jìn)行發(fā)30?發(fā)酵。終止發(fā)酵后 ,過濾掉菌絲體 ,收集發(fā)酵液 , 酵。 由于近年來薯干粉大幅度漲價(jià) ,生產(chǎn)成本增高 ,進(jìn)行產(chǎn)酸及其它分析。分析方法酸度測定取發(fā)酵濾液 1 ,以酚酞為指示劑 ,用標(biāo)準(zhǔn) mL011429 滴定。求得產(chǎn)酸率。?m o lL N aO H收稿日期 : 1997201214第一作者 :男, 1970年生 ,碩士研究生紙層析法分析檸檬酸的純度()()()展開劑正丁醇?乙酸?水=120VVV?30?50( )溫 度 為 25 ? 1 ?,上 行 2, 3 ,顯 色 劑 為 h0104% 溴酚藍(lán)溶液 ,點(diǎn)樣用 10層析紙為

7、新華一,L號(hào)濾紙 ,標(biāo)準(zhǔn)液使用012 ? 和 012 ? m o lL C 6H 8O 7 m o l。 LH2C2O4還原糖的測定用費(fèi)林法。2 結(jié)果圖 2玉米淀粉用量對(duì)搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸的影響2. 1檸檬酸高產(chǎn)菌 . 95的獲得 An ig e r經(jīng)紫外線和亞硝基胍多次誘變篩選,得到一株能較好地利用玉米淀粉生產(chǎn)檸檬酸的變異株.A(95 。該變異株搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酸 指發(fā)酵的混合物 n ig e r ) 中酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 8% 以上 , 在以檸檬酸鈉為唯 w 一碳源的培養(yǎng)基培養(yǎng) 7 , 未見明顯生長。經(jīng)多次傳 d 代后 , 它的產(chǎn)酸能力穩(wěn)定。2. 2 用玉米淀粉發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸) 1. 95發(fā)酵生產(chǎn)檸

8、檬酸的時(shí)間曲線A n ig e r在 圖 3甲醇添加量對(duì)產(chǎn)酸的影響同樣的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件下發(fā)酵1,1 9 ,得出產(chǎn)酸的時(shí)間曲線見圖1 。 d黑曲霉的檸檬酸產(chǎn)率。其作用機(jī)理還不夠清楚。一般認(rèn)為它是改變膜蛋白的通透性,使得糖化酶更容易分泌到細(xì)胞外 ,淀粉被降解后的小分子糖更容易進(jìn)到胞內(nèi) ,從而導(dǎo)致產(chǎn)生、積累更多的檸檬酸。但其 3% , 對(duì)細(xì)胞造成毒害 , 使檸檬酸產(chǎn)量急劇下降。 w ) 4 三種營養(yǎng)添加劑的作用 發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入 015% 酵母膏、蛋白胨、牛肉胨、牛肉膏 , 研究其對(duì)檸檬酸產(chǎn)率的作用。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明 , 酵母膏、蛋白胨、牛肉膏的產(chǎn)酸分別為 913% , 918% 及 916

9、% , 與對(duì)照組 917% 比較圖1.95利用玉米淀粉發(fā)酵生產(chǎn)A n ig e r都對(duì)提高檸檬酸的產(chǎn)率作用不大。 檸檬酸的時(shí)間曲線) 5幾種碳源產(chǎn)檸檬酸能力的比較以紅薯粉、粗玉米粉、黃豆粉、花生餅粉、蔗糖、結(jié)果表明 ,由于黑曲霉產(chǎn)檸檬酸的過程是邊糖可溶性淀粉分別代替玉米淀粉進(jìn)行產(chǎn)酸實(shí)驗(yàn)。結(jié)果化邊產(chǎn)酸 ,所以如果不事先將淀粉用酶解法或酸解用紅薯粉和蔗糖的產(chǎn)酸量基本與玉米淀粉相同,分 法液化 ,則發(fā)酵周期約為7 。d別為 10123% , 10108% 和 9161% ,表明該菌種能利) 2玉米淀粉對(duì)搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸的影響用新碳源玉米淀粉成為工業(yè)生產(chǎn)菌種。改變發(fā)酵培養(yǎng)基中玉米粉的含量,研究其對(duì)檸

10、檬酸生產(chǎn)的影響。結(jié)果示如圖 2 。 2. 3 . 95利用玉米淀粉發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸的An ig e r在一定的范圍內(nèi) ,檸檬酸產(chǎn)量隨著玉米粉含量發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)用 616 美國出 . L N ew B ru n sw ick Sc ien t if ic Co的 升 高 而 升高。玉米粉含量為20%時(shí)產(chǎn)酸為品的 2 型發(fā)酵罐。發(fā)酵過程中定時(shí)取樣 ,分 ?B io f lo 1018%。 此后不再升高。析記錄其中還原糖及檸檬酸產(chǎn)率,菌體生長形態(tài)及) 3甲醇添加量對(duì)產(chǎn)酸的影響() ()清華大學(xué)學(xué)報(bào)自然科學(xué)版1998, 38 6 54轉(zhuǎn)入下一階段。)3 ()第三階段 110 以后 h產(chǎn)酸速率降低 ,還原糖含

11、量繼續(xù)下降 ,溶氧開始上升。鏡檢發(fā)現(xiàn)孢子數(shù)量劇增 ,菌絲斷裂、破碎 ,到132 時(shí)已基本上看不到菌絲。h132 時(shí)發(fā)酵液中還原糖量僅剩013% 。因此停 h止發(fā)酵。經(jīng)計(jì)算 ,發(fā)酵結(jié)束時(shí)檸檬酸產(chǎn)量為913% ,發(fā)酵的轉(zhuǎn)化率為 85% 。 圖 4發(fā)酵罐中檸檬酸生產(chǎn)的動(dòng)力學(xué)曲線3討論第一階段 0, 40 1 h 用黑曲霉菌種進(jìn)行檸檬酸發(fā)酵時(shí) , 接種量的多少 , 取決于進(jìn)入培養(yǎng)系統(tǒng)的孢子數(shù)量 , 實(shí)驗(yàn)表明 , 接 從圖上看 , 這個(gè)階段的特征是 : 檸檬酸緩慢產(chǎn)入的孢子數(shù)與形成的菌球體數(shù)為正相關(guān)關(guān)系,而與 生;發(fā)酵液中還原糖量迅速上升 ,達(dá)到最高值 ;溶孢子數(shù)量相差很遠(yuǎn)。這是因?yàn)橛捎阪咦又g的相互(

12、)氧分?jǐn)?shù)溶氧迅速下降。從外觀上來看 ,發(fā)酵液明 f吸附 ,孢子在發(fā)酵液中萌發(fā)時(shí) ,菌絲的互相纏繞等物顯的由發(fā)酵起始時(shí)的相當(dāng)粘稠狀態(tài) ,演變成完全流理作用 ,多數(shù)情況下每個(gè)菌球體都由幾個(gè)孢子乃至體化。 36 鏡檢可見到大量菌絲。通氣量也由發(fā)酵h一團(tuán)孢子形成 ,實(shí)驗(yàn)表明 ,在一定范圍內(nèi) ,向發(fā)酵培開始時(shí)的115 ? 上升到40 時(shí)的 215 ? 。 L m in h L m in養(yǎng)基中接入的孢子數(shù)量與產(chǎn)酸速率成正比。在檸檬 曲這一些現(xiàn)象都表明 , 這個(gè)階段主要進(jìn)行的是黑酸生產(chǎn)過程中 ,黑曲霉的孢子發(fā)育成菌球體,不同于 霉. 95的菌體生長及增殖。由于發(fā)酵前未A n ig e r分裂增殖的細(xì)菌個(gè)體

13、,因此由孢子進(jìn)入生長過程,既 采取任何專門的措施來糖化玉米淀粉 ,僅僅靠高溫( )可以采用一級(jí)種子即把孢子直接接入發(fā)酵體系,滅菌 115 過程中附帶進(jìn)行的淀粉酸水解,因此發(fā)h( 酵起始時(shí)發(fā)酵體系中的還原糖量只有約養(yǎng) 即用種子培養(yǎng)基先把孢 的淀粉還未被液化2% ,大量 也可以進(jìn)行二級(jí)種子培,發(fā)酵液顯得相當(dāng)粘稠 ,這也使得)子培養(yǎng)到一定形態(tài)的菌球體,再進(jìn)入發(fā)酵體系。本 傳氧更為困難,只能達(dá)到115?。接入較大量的L m in文中采用二級(jí)種子的原因,是因?yàn)樾枰^為準(zhǔn)確的黑曲霉. 95后,由于其產(chǎn)生、分泌的各種糖A n ig e r控制同一批發(fā)酵液中接種黑曲霉孢子的數(shù)量,以利 化酶作用 ,發(fā)酵體系中大

14、分子的玉米淀粉迅速被降解為小分子的還原糖,因此體系得以液化,通氣量增大 ,即傳氧速率加快。另一方面,.95經(jīng)過短A n ig e r于定性地分析各種發(fā)酵條件的改變對(duì)產(chǎn)酸的影響。暫的延遲期后,開始大量生長增殖。到這一階段基, 可以認(rèn)為其接種的孢子數(shù)量若使用一級(jí)種子培養(yǎng)本結(jié)束時(shí) , 發(fā)酵體系中還原糖量、是相對(duì)過量的 , 而采用二級(jí)種子則難以達(dá)到這樣的 通氣量、菌體數(shù)量都達(dá)到整個(gè)發(fā)酵過程中的最大值 ,數(shù)量級(jí)。因此使用一級(jí)種子培養(yǎng)應(yīng)該可以有利于提為大量產(chǎn)生積累檸檬酸奠定了基礎(chǔ)。于是發(fā)酵過程高產(chǎn)酸水平和產(chǎn)酸速度。而且發(fā)酵液中黑曲霉作為進(jìn)入第二階段。生產(chǎn)菌種的壓倒優(yōu)勢也更能夠有效地抑制雜菌生長 , 使得最

15、后的發(fā)酵結(jié)果不會(huì)受到明顯的影響。所以后續(xù)工作中建議可考慮采用一級(jí)種子培養(yǎng)的方式。)(2 )檸檬酸發(fā)酵是大量需氧的。若通氣量不足,生產(chǎn) 第二階段第 40, 110h從動(dòng)力曲線上看 , 這一階段的特點(diǎn)是 : 以比較菌的呼吸就受到抑制 , 甚至處于窒息狀態(tài)。由于淀粉穩(wěn)定的速率持續(xù)大量產(chǎn)生檸檬酸 ; 還原糖量則不斷過于粘稠 , 而且受溫度的變化影響較大 , 具體地說 , 下降 ; 溶氧雖然緩慢降低 , 但相對(duì)前兩者來說變化 在一定范圍內(nèi) , 溫度越低 , 粘度越大。 因此就很容易 不是太大。 這一階段的中后期 , 鏡檢發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生孢子。 發(fā)生這種現(xiàn)象 : 高壓滅菌的過程中 , 淀粉液化 , 進(jìn)入 有了第一

16、階段的基礎(chǔ) , . 95 開始進(jìn)入穩(wěn) A n ig e r 并充滿通氣管 ; 而滅菌后 , 這部分淀粉凝固 , 導(dǎo)致通 定期 , 大量產(chǎn)生積累檸檬酸。這一階段雖然淀粉的糖 氣口被堵塞。盡管采取了對(duì)策 , 但仍然未徹底解決問 化可能仍在繼續(xù) , 但已經(jīng)不能補(bǔ)償消耗 , 因此發(fā)酵液 題。因此本應(yīng)大量通氣時(shí)卻通氣不足 , 這嚴(yán)重地影響 中的還原糖量逐漸下降。 孢子的出現(xiàn)則反映出菌體 了檸檬酸的產(chǎn)生和積累。這大概就是發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)中 , 的生長環(huán)境已趨于惡化 , 這也預(yù)示了發(fā)酵過程即將 產(chǎn)酸率反而稍低于搖瓶發(fā)酵的主要原因。 因?yàn)閾u瓶ac id o b ta ined f rom m ed ium co n

17、 ta in ing 20% co rn sta rch ,發(fā)酵不存在堵塞通氣管的問題,在轉(zhuǎn)速、三角瓶規(guī)() 0. 2% N H SO , 0. 2% KH PO , 0. 05% M gSO r 7H O ,4 24 24 4 2格、裝液量、紗布層數(shù)等因素均固定時(shí),可以認(rèn)為其3% m e thano l and pH 3.0 is th e h ighe st o ne fo r c it r ic ac id (通氣量是固定的至少對(duì)于培養(yǎng)基表層來說是這 p ro duc t io n o n th e ro ta ry sh ake r se t a t 30?, 200 rm in. ?

18、T h e y ie ld s o f c it r ic ac id w e re 10. 8% in the sh ak e rincuba ted )樣。 而擴(kuò)大規(guī)模到發(fā)酵罐上,無論是實(shí)驗(yàn)室用的小w ith A . n ige r 95 fo r 7 day s and 9. 3% in a 5 lite r N. B. S. 3發(fā)酵罐 ,還是實(shí)際生產(chǎn)中使用的容積約100 的大m B io f lo 2? fe rm en to r unde r co nd itio n s o f 30?, 500 ,罐,情況很不一樣。由于體積大,液面離罐底有很高1.5 ,pH 4. 0, and a

19、n a ir f low ra te o f ?m in , 600 r2. 5 L m in. ?的距離 ,因此僅靠表層的那些自然溶氧是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能h. 85% suga r is u t ilized in th eT he re sea rch m ak e s it po ssib le to u se co rn fe rm en to r.fo r 132滿足需要的。要從根本上解決這一矛盾,可以采取的sta rch , w h ich is cheap e r and m o re abundan t, a s th e m a in辦法有兩個(gè):一是先將淀粉用酶或酸完全液化 ; 二 c

20、a rbo n so u rce in cit r ic ac id p ro duc t io n , in p lace o f sw ee t是以較低的初始淀粉濃度上罐,在發(fā)酵過程中用流po ta to.加的方法逐漸補(bǔ)充營養(yǎng)。 這樣就牽涉到一系列工藝 i l lu s n ig e r A . n ig e r 95; cit r ic ac id;() Key words A sp e rgco rn sta rch; fe rm en ta t io n和經(jīng)濟(jì)上的問題。()參考 文獻(xiàn) 上接51頁3 L au rence G D. Po lyac ry la te th ick en

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25、ac id produced by A. n ig e r 95 A bstrac t T he acry lic inve r se em u lsio n copo lym e r iza t io nh a s been stud ied w ith Sp an 2Tw een o r Sp an 2O P m ix tu re a s us in g corn sta rchem u lsif ie r, A lip h a t ic hyd ro ca rbo n a s o il m ed ium and u singredo x in it ia to r. T he inf l

26、uence s o f va r io u s fac to r s,such a s , L IU Z u to ng S H I Y ix ia ng react io n tem p e ra tu re and t im e, pH va lue o f w a te r p h a se,m o nom e r co ncen t ra t io n , the ra t io o f o il and w a te r, D ep a r tm en t o f B io lo g ica l Sc ience and B io tech no lo gy,m o nom e r ra t io , the am o un t o