分枝桿菌藥物外排泵及其在耐藥機(jī)制中作用

1、分枝桿菌藥物外排泵及其在耐藥機(jī)制中作用作者：陳敏王躍時(shí)間：2007-11-22 11:39:00 【關(guān)鍵詞】 分枝桿菌藥物外排泵近年來(lái)，分枝桿菌耐藥現(xiàn)象日趨嚴(yán)重，耐多藥結(jié)核分枝桿菌也日漸增多，導(dǎo)致其感染的難治性。分枝桿菌內(nèi)在性耐藥主要是細(xì)胞壁通透性障礙，導(dǎo)致藥物進(jìn)入高疏水性細(xì)胞壁間隙比較慢；而獲得性耐藥主要是基因突變，導(dǎo)致抗生素靶位變異或藥物在細(xì)胞內(nèi)處于無(wú)活性狀態(tài)。但僅憑天然細(xì)胞壁屏障作用和基因突變因素尚不足以解釋分枝桿菌耐藥機(jī)制。研究表明，分枝桿菌存在藥物主動(dòng)外排泵的表達(dá)，并被視為是可能的另一種重要耐藥機(jī)制1,2?，F(xiàn)就分枝桿菌外排泵的生物學(xué)功能及其基因調(diào)控機(jī)制研究進(jìn)展綜述如下。1 分枝桿菌外

2、排泵生物學(xué)功能研究發(fā)現(xiàn)，分枝桿菌外排泵能將菌細(xì)胞內(nèi)藥物泵出，使得胞內(nèi)藥物濃度不能有效抑制分枝桿菌生長(zhǎng)，從而產(chǎn)生抗生素耐受性3,4。 藥物外排系統(tǒng)根據(jù)其蛋白氨基酸同源性可分成很多種類(lèi)4，結(jié)核分枝桿菌H37Rv株基因組有20個(gè)編碼假想外排泵的開(kāi)放閱讀框（ORF）5。目前僅有幾種分枝桿菌外排泵得到一定研究，分別為屬于主要易化超家族（MFS）的Lfr A、Rv1634、EfpA 、Tet(V)、P55、Tap、Rv1258c；屬于耐受小節(jié)分裂區(qū)家族（RND）的MmpL；屬于ATP結(jié)合盒超家族（ABC）的DrrAB、Pst、Rv2686c-Rv2687c-Rv2688c；屬于小耐多藥性家族（SMR）的M

3、mr等。這些藥物外排泵蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)氟喹諾酮類(lèi)（FQs）、四環(huán)素、氨基糖苷類(lèi)藥物及其他化合物。11 MFS類(lèi)生物信息學(xué)分析結(jié)核分枝桿菌基因組有16個(gè)ORF編碼假想的藥物外排泵屬于MFS類(lèi)6。111 分枝桿菌MFS外排泵轉(zhuǎn)運(yùn)FQs（1）Lfr A：分枝桿菌中發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)功能外排泵，具有較廣的底物專(zhuān)一性，但其外排作用僅限于親水性較高的FQs。Takiff等7從一株耐環(huán)丙沙星恥垢分枝桿菌中克隆基因lfrA，將之轉(zhuǎn)染恥垢分枝桿菌敏感菌mc2155株后，賦予該菌對(duì)FQs低水平耐藥。對(duì)LfrA蛋白氨基酸序列預(yù)測(cè)性分析顯示其與屬于MFS的金黃色葡萄球菌QacA蛋白同源，推測(cè)LfrA蛋白是MFS類(lèi)外排泵蛋白。Liu

4、等8證實(shí)，LfrA蛋白涉及幾種喹諾酮抗生素的排出，肯定了Takiff的推測(cè)。Sander等9研究恥垢分枝桿菌lfrA基因插入失活突變株時(shí)，也發(fā)現(xiàn)溴乙錠和吖啶黃最小抑菌濃度（MIC）降低，認(rèn)為可能是LfrA外排機(jī)制的作用。（2）Rv1634：Rossi等10發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌H37Rv株Rv1634基因編碼另一種假想的MFS類(lèi)外排泵Rv1634。當(dāng)它在恥垢分枝桿菌過(guò)度表達(dá)時(shí)，賦予氟喹諾酮類(lèi)藥物敏感性降低。蓄積數(shù)據(jù)顯示，這個(gè)泵與氟哌酸和環(huán)丙沙星外排有關(guān)。（3）EfpA：Doran等11發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌H37Rv株efpA基因編碼假想外排泵蛋白EfpA，其在蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)上與LfrA同源。該蛋白也導(dǎo)

5、致對(duì)氟喹諾酮耐藥。恥垢分枝桿菌efpA基因缺失株與野生株比較，其對(duì)溴乙錠、慶大霉素、氟喹諾酮和吖啶黃敏感性增加28倍，但對(duì)利福霉素、氯霉素、異煙肼和紅霉素敏感性卻降低24倍4。EfpA在耐藥中的作用和它的底物專(zhuān)一性仍有待進(jìn)一步研究。112 分枝桿菌MFS外排泵轉(zhuǎn)運(yùn)四環(huán)素、氨基糖苷類(lèi) （1）Tet(V)：Tet(V)是分枝桿菌四環(huán)素外排泵12。四環(huán)素對(duì)臨床分離的幾種快速生長(zhǎng)的偶發(fā)分枝桿菌、恥垢分枝桿菌等都有抗菌活性。tet(V)基因序列分析顯示，其與編碼其他已知的革蘭陽(yáng)性菌四環(huán)素轉(zhuǎn)運(yùn)體基因相似。恥垢分枝桿菌Tet(V)外排泵的過(guò)度表達(dá)使得四環(huán)素MIC增加24倍，但對(duì)四環(huán)素衍生物強(qiáng)力霉素和美滿(mǎn)霉素

6、卻無(wú)影響。（2）P55：Sliva等13根據(jù)結(jié)核分枝桿菌基因組信息，克隆并表達(dá)了可能的外排泵蛋白R(shí)v1410c，命名為P55。研究表明，P55存在于結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、鳥(niǎo)分枝桿菌和麻風(fēng)分枝桿菌等多種分枝桿菌中。將攜帶P55編碼基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染恥垢分枝桿菌后，重組細(xì)菌表現(xiàn)出對(duì)氨基糖苷類(lèi)和四環(huán)素耐藥。在泵抑制劑碳酰氰基-對(duì)-氯苯腙（CCCP）和維拉帕米作用下，其耐藥性降低。表達(dá)P55的恥垢分枝桿菌胞內(nèi)四環(huán)素蓄積量明顯小于對(duì)照株。故推測(cè)P55蛋白是分枝桿菌中執(zhí)行氨基糖苷類(lèi)和四環(huán)素外排泵功能的蛋白。（3）Tap：Ainsa等14從偶發(fā)分枝桿菌基因組中克隆tap基因，將之轉(zhuǎn)染mc2155后，表現(xiàn)出低

7、水平耐氨基糖苷類(lèi)和四環(huán)素。蛋白結(jié)構(gòu)分析，Tap有2030氨基酸序列與MFS家族成員特別是四環(huán)素和大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)泵蛋白一致。其底物包括四環(huán)素和某些氨基糖苷類(lèi)藥物。Martin等15也發(fā)現(xiàn)，Tap蛋白利用跨膜電化學(xué)梯度將四環(huán)素從胞內(nèi)擠出。這種外排活性被CCCP和利血平抑制，這一結(jié)果與在有這些抑制劑存在時(shí)的MIC下降一致。（4）Rv1258c：結(jié)核分枝桿菌Rv1258c基因與偶發(fā)分枝桿菌tap基因同源。Siddiqi等16 研究臨床分離耐多藥結(jié)核分枝桿菌株ICC154時(shí)發(fā)現(xiàn)，Rv1258c轉(zhuǎn)錄水平明顯上升，與結(jié)核分枝桿菌對(duì)四環(huán)素內(nèi)在性耐藥有關(guān)。根據(jù)其以往的研究17，排除了ICC154基因突變所致，認(rèn)為可

8、能是Rv1258c基因過(guò)度表達(dá)所致。12 RND類(lèi)結(jié)核分枝桿菌基因組序列包含編碼可能的預(yù)測(cè)屬于RND家族轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白的跨膜蛋白的15個(gè)基因，這些編碼于分枝桿菌的蛋白命名為MmpL(mycobacterial membrane proteins,large)。Pasca發(fā)現(xiàn)18，mmpL7基因在恥垢分枝桿菌表達(dá)時(shí)對(duì)異煙肼高度耐藥，該耐藥在利血平和CCCP存在時(shí)有所減弱。另外在恥垢分枝桿菌在能量依賴(lài)型外排異煙肼也能檢測(cè)到有mmpL基因表達(dá)。13 ABC超家族編碼ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體的基因占結(jié)核分枝桿菌基因組約2.5。至少有37個(gè)完整或不完整ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體已經(jīng)在結(jié)核分枝桿菌中發(fā)現(xiàn)19，其作用底物非常廣泛，包括F

9、Qs、利福平、四環(huán)素、紅霉素等。131 DrrAB結(jié)核分枝桿菌基因組中有阿霉素耐藥操縱子drrAB。麻風(fēng)分枝桿菌和鳥(niǎo)分枝桿菌中也存在同源基因。個(gè)轉(zhuǎn)錄成對(duì)的開(kāi)放閱讀框drrA、drrB可編碼ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體。drrA編碼核苷酸結(jié)合區(qū)域，drrB編碼細(xì)胞膜上蛋白亞基。其具有泵功能的結(jié)構(gòu)是drrA2B2。drrA結(jié)合于細(xì)胞膜依賴(lài)于drrB的同時(shí)表達(dá)。在缺失drrA時(shí)，drrB很容易被蛋白水解酶水解，兩者同時(shí)表達(dá)，才能形成具有功能的藥物外排泵。Choudhuri20研究發(fā)現(xiàn)，drrAB在恥垢分枝桿菌中表達(dá)時(shí)，表現(xiàn)出對(duì)利福平、四環(huán)素、紅霉素等一系列臨床常用抗生素耐藥。用泵抑制劑處理后，耐藥明顯受到抑制，說(shuō)明

10、DrrAB在結(jié)核分枝桿菌耐藥中存在作用。132 Pst磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體Pst(phosphate specific transporter)存在于多種微生物，主要涉及磷酸鹽運(yùn)輸，現(xiàn)發(fā)現(xiàn)其可能還與胞內(nèi)氟喹諾酮外排有關(guān)。Banerjee21認(rèn)為，Pst能將胞內(nèi)的氟喹諾酮排出胞外，恥垢分枝桿菌耐環(huán)丙沙星突變株受氟喹諾酮類(lèi)抗生素作用48h后，Pst系統(tǒng)中編碼PstB(ATP酶亞基)的mRNA水平明顯升高。而PstB的失活將導(dǎo)致菌株對(duì)氟喹諾酮非常敏感。Poole22也證實(shí)，恥垢分枝桿菌Pst高表達(dá)導(dǎo)致環(huán)丙沙星耐藥，而用外排泵抑制劑維拉帕米可逆轉(zhuǎn)此耐藥。133 Rv2686cRv2687cRv2688cPas

11、ca等23研究表明，結(jié)核分枝桿菌H37Rv株基因組中存在一個(gè)編碼屬于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子家族的氟喹諾酮排出泵蛋白的操縱子，Rv2686c-Rv2687c-Rv2688c，這3個(gè)基因是共同表達(dá)的。研究該蛋白功能發(fā)現(xiàn)，其過(guò)度表達(dá)的恥垢分枝桿菌，環(huán)丙沙星高度耐藥。而僅Rv2686c過(guò)度表達(dá)時(shí)，環(huán)丙沙星中度耐藥。對(duì)諾氟沙星則不管是表達(dá)完整的操縱子還是僅為Rv2686c，突變株低水平耐藥。對(duì)這一現(xiàn)象，Pasca分析可能是由于Rv2686c蛋白與宿主細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白相互作用，形成一個(gè)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體的緣故。用利血平和維拉帕米處理，則可以誘導(dǎo)環(huán)丙沙星MIC降至與野生株一致的水平，表明該轉(zhuǎn)運(yùn)體發(fā)揮有主動(dòng)外排藥物的作用。14

12、SMR家族在分枝桿菌的SMR家族中，目前僅找到mmr基因24。它存在于結(jié)核分枝桿菌、牛結(jié)核分枝桿菌、海洋分枝桿菌等分枝桿菌染色體基因組中。蛋白序列對(duì)比程序BLASTP分析顯示，Mmr蛋白同SMR外排家族中的QacE、EmrE等蛋白同源程度很高，也有4個(gè)跨膜片段。將結(jié)核分枝桿菌的mmr基因轉(zhuǎn)染至mc2155，顯示出對(duì)紅霉素和溴乙錠等耐藥，而對(duì)利福平和鏈霉素等則無(wú)影響。2 分枝桿菌外排泵相關(guān)基因調(diào)控機(jī)制外排泵基因通常是一個(gè)操縱子的一部分，其表達(dá)受一個(gè)調(diào)節(jié)基因控制，過(guò)度表達(dá)可能有害是因?yàn)槠浔磉_(dá)后直接地、自然地破壞了膜融合或是不必要地輸出了必需代謝產(chǎn)物。對(duì)于分枝桿菌外排泵的有關(guān)調(diào)控機(jī)制，目前僅在恥垢分

13、枝桿菌LfrA和結(jié)核分枝桿菌P55有初步研究。21 LfrA/LfrR操縱子 Li Xian4發(fā)現(xiàn)，編碼LfrA外排泵的基因lfrA的表達(dá)受抑制基因lfrR調(diào)控。lfrA基因上游區(qū)域的序列分析顯示存在一個(gè)編碼推測(cè)為含195個(gè)氨基酸的多肽的ORF，LfrR。lfrR和lfrA被認(rèn)為組成一個(gè)操縱子。最近Buroni25也證實(shí)，LfrR是調(diào)控恥垢分枝桿菌外排泵LfrA表達(dá)的抑制子。lfrR基因編碼可能的四環(huán)素外排泵TetR家族轉(zhuǎn)錄抑制子4，lfrR基因缺失顯示lfrA表達(dá)增強(qiáng)，增加了突變菌株對(duì)環(huán)丙沙星、氟哌酸、溴乙錠和吖啶黃的耐藥性。LfrA的這種表達(dá)增強(qiáng)對(duì)高耐藥株的形成具有重要作用，推測(cè)可能是lf

14、rA高表達(dá)增加了高水平耐藥突變的頻率7,8，因其容許在低耐藥濃度中存活而選擇繼發(fā)的高耐藥突變，比同步選擇雙突變的頻率高，而其他無(wú)關(guān)的突變更加頻繁，這可能是細(xì)菌如何進(jìn)行性成為高耐藥、多耐藥的機(jī)制提供一種模式。22 P27/P55操縱子 牛分枝桿菌基因組中，P55基因位于編碼免疫原性脂蛋白P27基因下游區(qū)13。Bigi F26等在研究P55外排泵蛋白時(shí)，采用Northern blotting和RTPCR證實(shí)P27和P55組成一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位，P27/P55操縱子。近期研究發(fā)現(xiàn)27，編碼P27/P55操縱子的基因lprGRv1410的敲除可導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌減毒作用的發(fā)生。Silva13等檢測(cè)了質(zhì)粒pPA

15、Z24（有一個(gè)鏈霉素耐藥盒子序列插入P27基因序列，從而阻礙了操縱子啟動(dòng)子作用下P55的轉(zhuǎn)錄）。結(jié)果顯示，P55在盒子和P55起始密碼子之間約390個(gè)核苷酸處有一個(gè)啟動(dòng)子。某些細(xì)菌有藥物傳感器蛋白，可誘導(dǎo)與之相連的外排泵蛋白基因的表達(dá)。在這些情況中，編碼藥物傳感器蛋白的基因和外排泵蛋白基因彼此相鄰。因?yàn)橹鞍妆徽J(rèn)為參與信息轉(zhuǎn)導(dǎo)，他們推測(cè)P27也是特殊信號(hào)傳感器的一種，直接或間接激活P55的表達(dá)。當(dāng)然這還需要進(jìn)一步研究。3 結(jié) 語(yǔ)綜上所述，外排泵賦予一種或幾種藥物耐受性的研究已經(jīng)在分枝桿菌中得以證實(shí)。但是，這些研究多限于野生株及其實(shí)驗(yàn)突變株，有關(guān)泵的底物與耐藥表型的關(guān)系還未完全明確。已發(fā)現(xiàn)的分枝

16、桿菌外排泵對(duì)耐多藥表型的作用及其表達(dá)調(diào)控等一系列問(wèn)題需進(jìn)一步闡明。從目前的研究來(lái)看，如果編碼這些外排泵蛋白的基因或相關(guān)調(diào)控基因發(fā)生突變，可能導(dǎo)致外排泵高表達(dá)，從而導(dǎo)致耐藥性的增加。因此，加強(qiáng)分枝桿菌外排泵的基礎(chǔ)研究，尤其是對(duì)結(jié)核分枝桿菌全基因組中假想的藥物外排蛋白功能進(jìn)行鑒定，必將為闡明結(jié)核分枝桿菌耐多藥性發(fā)生機(jī)制和新型藥物的開(kāi)發(fā)產(chǎn)生影響。由此也將對(duì)改進(jìn)藥物設(shè)計(jì)、避免藥物成為外排泵的底物、增加藥物的持續(xù)內(nèi)流、找到更有效的外排泵特異抑制劑均有重要意義，為臨床更好地選擇抗生素和有效地進(jìn)行疾病治療提供理論基礎(chǔ)。 【參考文獻(xiàn)】 1De Rossi E,Ainsa JA,and Riccardi G.R

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