1121抑菌效力檢查法

1、2020 年版第一次征求意見稿1121 抑菌效力檢查法抑菌劑是指抑制微生物生長的化學(xué)物質(zhì)， 有時也稱防腐劑。抑菌效力檢查法系用于測定無菌及非無菌制劑的抑菌活性， 用于指導(dǎo)生產(chǎn)企業(yè)在研發(fā)階段制劑中抑菌劑種類和濃度的確定。如果藥物本身不具有充分的抗菌效力，那么應(yīng)根據(jù)制劑特性 （如水溶性制劑）添加適宜的抑菌劑，以防止制劑在正常貯藏或使用過程中由于微生物污染和繁殖，使藥物變質(zhì)而對使用者造成危害，尤其是多劑量包裝的制劑。在藥品生產(chǎn)過程中，抑菌劑不能用于替代藥品生產(chǎn)的 GMP管理，不能作為非無菌制劑降低微生物污染的唯一途徑，也不能作為控制多劑量包裝制劑滅菌前的生物負載的手段。所有抑菌劑都具有一定的毒性，制

2、劑中抑菌劑的量應(yīng)為最低有效量。同時，為保證用藥安全，成品制劑中的抑菌劑有效濃度應(yīng)低于對人體有害的濃度。抑菌劑的抑菌效力在貯存過程中有可能因藥物的成分或包裝容器等因素影響而變化，因此，應(yīng)驗證成品制劑的抑菌效力在效期內(nèi)不因貯藏條件而降低。本試驗方法和抑菌劑抑菌效力判斷標準用于包裝未啟開的成品制劑。培養(yǎng)基培養(yǎng)基的制備胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基照無菌檢查法（通則1101）制備。培養(yǎng)基的適用性檢查抑菌效力測定用培養(yǎng)基包括成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按處方配制的培養(yǎng)基均應(yīng)進行培養(yǎng)基的適用性檢查檢查。菌種試驗所用的菌株傳代次數(shù)不得超過5 代（從菌種保

3、藏中心獲得的干燥菌種為第 0 代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)進行保存， 以保證試驗菌株的生物學(xué)特性。培養(yǎng)基適用性檢查的菌種及新鮮培養(yǎng)物的制備見表1。表 1 培養(yǎng)基適用性檢查、方法適用性檢查、抑菌效力測定用的2020 年版第一次征求意見稿試驗菌及新鮮培養(yǎng)物制備試驗菌株試驗培養(yǎng)基培養(yǎng)溫度培養(yǎng)時間金黃色葡萄球菌胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或(Staphylococcus aureus)30351824 小時胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基CMCC(B) 26003 銅綠假單胞菌胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或(Pseudomonas aeruginosa)30351824 小時胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基 CMCC(B) 10104大腸

4、埃希菌 *胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或30351824 小時(Escherichia coli)胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基 CMCC(B) 44102白色念珠菌沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基或(Candida albicans)20252448 小時沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基 CMCC(F) 98001黑曲霉沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基或202556107 天或直(Aspergillus niger)到獲得豐富的孢沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基 CMCC(F) 98003子* 大腸埃希菌僅用于口服制劑的抑菌效力測定。菌液制備取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物， 用 pH7.0 無菌氯化鈉 -蛋白胨緩沖液或

5、0.9%無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的菌懸液。取黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物加入 35ml 含 0.05%（ ml/ml ）聚山梨酯 80 的 pH7.0 無菌氯化鈉 -蛋白胨緩沖液或 0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，采用適宜方法吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含 0.05%（ml/ml ）聚山梨酯 80 的 pH7.0 無菌氯化鈉 -蛋白胨緩沖液或 0.9%無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的孢子懸液。菌液制備后若在室溫下放置，應(yīng)在 2 小時內(nèi)使用；若保存在 2 8，可在 24 小時內(nèi)使用。黑曲霉的孢子懸液可保存在 2 8，在驗證過的貯存期內(nèi)使用。適用性檢查 分別接種不大于 100cfu 的金黃色葡萄球菌

6、、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌的菌液至胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備 2 個平板，混勻，凝固，置 3035培養(yǎng)不超過 3 天，計數(shù)；分別接種不大于 100cfu 的白色念珠菌、黑曲霉的菌液至沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基， 每株試驗菌平行制備 2 個平板，混勻，凝固，置 2025培養(yǎng)不超過 5 天，計數(shù)；同時，用對應(yīng)的對照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進行上述試驗。2020 年版第一次征求意見稿結(jié)果判定若被檢培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)不小于對照培養(yǎng)基上菌落平均數(shù)的7050%，且菌落形態(tài)大小與對照培養(yǎng)基上的菌落一致， 判該培養(yǎng)基的適用性檢查符合規(guī)定。抑菌效力測定菌種 抑菌效力測定用菌種見表 1，若需要，制劑中常見的

7、污染微生物也可作為試驗菌株。菌液制備 試驗菌新鮮培養(yǎng)物制備見表 1，銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、白色念珠菌若為瓊脂培養(yǎng)物，加入適量的 0.9%無菌氯化鈉溶液將瓊脂表面的培養(yǎng)物洗脫， 并將菌懸液移至無菌試管內(nèi)， 用 0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋并制成每 1ml 含菌數(shù)約為 108cfu 的菌懸液；若為液體培養(yǎng)物，離心收集菌體，用 0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋并制成每 1ml 含菌數(shù)約為 108cfu 的菌懸液。取黑曲霉新鮮培養(yǎng)物加入 35ml 含 0.05（ ml/ml ）聚山梨酯 80 的 0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，然后，用適宜方法吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)， 加入適量的含0

8、.05（ ml/ml ）聚山梨酯80 的 0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml 含孢子數(shù)810 cfu 的孢子懸液。測定1ml 菌懸液中所含的菌數(shù)。菌液制備后若在室溫下放置，應(yīng)在 2 小時內(nèi)使用；若保存在 28，可在小時內(nèi)使用。黑曲霉的孢子懸液可保存在 28，在一周 7 天內(nèi)使用。 24供試品接種抑菌效力可能受試驗用容器特征的影響，如容器的材質(zhì)、形狀、體積及封口的方式等。因此， 只要供試品每個包裝容器的裝量足夠試驗用， 同時容器便于按無菌操作技術(shù)接入試驗菌液、 混合及取樣等， 一般應(yīng)將試驗菌直接接種于供試品原包裝容器中進行試驗。 若因供試品的性狀或每個容器裝量等因素需將供試品轉(zhuǎn)移至無菌容器時，

9、該容器的材質(zhì)不得影響供試品的特性 （如吸附作用），特別應(yīng)注意不得影響供試品的pH 值， pH 值對抑菌劑的活性影響很大。取包裝完整的供試品至少5 份，直接接種試驗菌，或取適量供試品分別轉(zhuǎn)移至 5 個適宜的無菌容器中（若試驗菌株數(shù)超過5 株，應(yīng)增加相應(yīng)的供試品份數(shù)），每一容器接種一種試驗菌，1g 或 1ml 供試品中接菌量為105 106cfu，接種菌液的體積不得超過供試品體積的1%,充分混合，使供試品中的試驗菌均勻分布，然后置2025避光貯存。2020 年版第一次征求意見稿存活菌數(shù)測定根據(jù)產(chǎn)品類型，按表2-1、表 2-2、表 2-3 規(guī)定的間隔時間，分別從上述每個容器中取供試品1ml(g) ，

10、測定每份供試品中所含的菌數(shù)，測定細菌用胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基， 測定真菌用沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。 存活菌數(shù)測定方法及方 法 適 用 性 試 驗 照“非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查： 微生物計數(shù)法 (通則 1105）”進行，方法適用性試驗用菌株見表 1，菌液制備同培養(yǎng)基適用性檢查， 方法適用性試驗菌的回收率不得低于 7050%。根據(jù)存活菌數(shù)測定結(jié)果，計算 1ml(g)供試品各試驗菌所加的菌數(shù)及各間隔時間的菌數(shù)，并換算成 lg 值。結(jié)果判斷供試品抑菌效力評價標準見表2-1、表 2-2、表 2-3，表中的 “減少的 1g 值”是指各間隔時間測定的菌數(shù) 1g 值與 1ml(g) 供試品中接種的菌數(shù) 1g 值的相差值。表中 “A”是指應(yīng)達到的抑菌效力標準，特殊情況下，如抑菌劑可能增加不良反應(yīng)的風險，則至少應(yīng)達到 “B”的抑菌效力標準。表 2-1 注射劑、眼用制劑、用于子宮和乳腺的制劑抑菌效力判斷標準減少的 lg值6h24h7d14d28dA23-NR細菌B-13-NIA-2-NI真菌B-1NI注： NR:試驗菌未恢復(fù)生長。NI ：未增加，是指對前一個測定時間，試驗菌增加的數(shù)量不超過0.5 lg。表 2-2耳用制劑、鼻用制劑、皮膚給藥制劑、吸入制劑抑菌效力判斷標準減少的 lg 值2d7d14d28dA23-N