質(zhì)粒提取原理和方法

1、質(zhì)粒DNA提取的原理及方法堿裂解法質(zhì)粒DNA提取原理質(zhì)粒DNA提取主要包括以下幾個(gè)方面：如何將細(xì)胞裂解釋放質(zhì)粒DNA，如何將質(zhì)粒DNA和基因組DNA分離開(kāi)來(lái)，如何去除RNA污染，如何去除蛋白質(zhì)和其它雜質(zhì)。質(zhì)粒提取方法中，最常用的方法是堿裂解法，它具有得率高，適用面廣，快速，純度高等特點(diǎn)。其原理是：強(qiáng)堿性條件下，質(zhì)粒DNA和基因組DNA同時(shí)從細(xì)胞中釋放出來(lái)，并發(fā)生變性。在pH中性，并有高鹽濃度存在的條件下，質(zhì)粒DNA會(huì)迅速發(fā)生復(fù)性，仍為可溶性狀態(tài)，染色體DNA之間交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，在去垢劑SDS作用下，染色體DNA與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉淀，通過(guò)離心去除沉淀后，再用酚氯仿抽提進(jìn)一步

2、純化質(zhì)粒DNA，用異丙醇或乙醇沉淀可將之純化出來(lái)。BIOMIGA公司質(zhì)粒DNA純化系列試劑盒，采用堿裂解法質(zhì)粒提取原理，在高鹽環(huán)境下，采用硅膠膜特異性的吸附質(zhì)粒DNA，而蛋白質(zhì)不被吸附，最后用低鹽洗脫液將DNA從膜上洗脫下來(lái)，方法簡(jiǎn)單，快速，質(zhì)量好，收獲量高。影響質(zhì)粒提取的因素影響質(zhì)粒提取的因素有很多種，如質(zhì)粒拷貝數(shù)，宿主菌株的種類(lèi)，細(xì)菌的培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基種類(lèi)、培養(yǎng)條件等等。質(zhì)?？截悢?shù)質(zhì)粒DNA最終收獲量取決于質(zhì)粒的拷貝數(shù)和質(zhì)粒的大小。BIOMIGA 公司質(zhì)粒DNA提取系列試劑盒，操作步驟適用于高拷貝數(shù)質(zhì)粒的純化，對(duì)于低拷貝質(zhì)粒純化提取，應(yīng)加大起始菌液量的體積，并且相應(yīng)地增加各種緩沖液的用量。

3、下表給出一些常用質(zhì)粒載體的拷貝數(shù)： 質(zhì)粒種類(lèi)復(fù)制起點(diǎn)拷貝數(shù)1 mL菌液質(zhì)粒DNA收獲量(µg) pSC101pSC10150.1-0.2 pACYCP15A10-120.4-0.6 pSuperCospMB110-200.4-1 pBR322pMB115-200.6-1 pGEMRMuted pMB1300-4006-7 pBluescriptRColE1300-5006-8 pUCMuted pMB1500-7008-12宿主菌株宿主菌株的種類(lèi)將會(huì)影響質(zhì)粒的收獲量。含內(nèi)源核酸酶的宿主菌株，如JM101,

4、 JM110, HB101, TG1以及它們的衍生菌株，通常因?yàn)閮?nèi)源核酸酶的存在，或者在提取過(guò)程中釋放出來(lái)的核酸酶的作用下，將會(huì)顯著影響最終收獲量，或者純化到的質(zhì)粒容易降解，推薦客戶(hù)將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至不含內(nèi)源核酸酶的宿主菌株中，如Top10, DH5a進(jìn)行質(zhì)粒純化。如果從含內(nèi)源核酸酶的宿主菌株中純化質(zhì)粒DNA，請(qǐng)用試劑盒附送的核酸酶去除溶液，去除核酸酶的污染?；蜻x用HP系列試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒的純化。下表給出一些常用的宿主菌株種類(lèi)：  EndA- Strains of E. Coli DH5DH1DH21JM106JM109SK2267SRBXLO TOP10DH1

5、0BJM103JM107SK1590MM294Stbl2XL1-Blue BJ5182DH20JM105JM108SK1592Select96Stbl4XL10-Gold EndA+ Strains of E. Coli C600JM110RR1ABLE® CCJ236KW251P2392BL21(DE3) HB101TG1TB1ABLE® KDH12SLE392PR700BL21(DE3) pLysS JM101JM83TKB1HMS174ES1301M1061Q358BMH 71-18 All NM strai

6、nsAll Y strains 菌液培養(yǎng)BIOMIGA 公司質(zhì)粒DNA提取系列試劑盒，標(biāo)準(zhǔn)操作適用于在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)1216小時(shí)，OD600在2.03.0的菌液質(zhì)粒DNA的提取。如果使用豐富培養(yǎng)基，如TB，2 x YT培養(yǎng)基，請(qǐng)保證OD600不超過(guò)3.0。菌液過(guò)量，將會(huì)影響最終的收獲量和純度。培養(yǎng)方式如果用于質(zhì)粒小提，請(qǐng)從固體培養(yǎng)基平板上挑取新鮮單菌落，接種到加入篩選抗生素的培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)1216小時(shí)。如果用于中提、大提或超大提，請(qǐng)按照以下方式制備菌液：挑取單克隆，接種到15mL培養(yǎng)基中，進(jìn)行初搖，然后按照1:1000的比例進(jìn)行放大培養(yǎng)，培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基的體積最好不要超過(guò)培養(yǎng)瓶的

7、1/4體積?？股貪舛鹊倪x擇對(duì)含有抗性的質(zhì)粒載體，在進(jìn)行篩選或培養(yǎng)時(shí)應(yīng)加入相應(yīng)的抗生素。各種抗生素的工作濃度請(qǐng)參照下表：  抗生素溶解性保存條件嚴(yán)緊型質(zhì)粒松弛型質(zhì)粒 氨芐青霉素50 mg/mL(溶于水)-2020 µg/mL60 µg/mL 羧芐青霉素50 mg/mL溶于水-2020 µg/mL60 µg/mL 氯霉素34 mg/mL溶于無(wú)水乙醇-2025 µg/mL170 µg/mL 卡那霉素10 mg/mL溶于水-2010 µg/mL50 µg/mL&

8、#160;鏈霉素10 mg/mL溶于水-2010 µg/mL50 µg/mL 四環(huán)素5 mg/mL溶于無(wú)水乙醇-2010 µg/mL50 µg/mL 質(zhì)粒質(zhì)量鑒定純化到的質(zhì)粒DNA一般可以通過(guò)以下三種方式進(jìn)行質(zhì)量鑒定。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)理想條件下，經(jīng)堿裂解法純化到的質(zhì)粒DNA，應(yīng)該只出現(xiàn)超螺旋一條帶。但在質(zhì)粒提取過(guò)程中機(jī)械力，強(qiáng)堿溶液的作用等原因，純化到的質(zhì)粒常常會(huì)出現(xiàn)三條帶，甚至有時(shí)候會(huì)出現(xiàn)四條帶(變性超螺旋)，不管是哪種形式的超螺旋，經(jīng)單酶切后，呈現(xiàn)一條帶，則說(shuō)明提取結(jié)果正常，沒(méi)有基因組污染。酶切鑒定純化到的質(zhì)粒，進(jìn)行進(jìn)一步的酶切操作，鑒定質(zhì)粒的大小。紫外分光光度計(jì)檢