PCR技術(shù)的原理與方法

1、.1 1PCRPCR技術(shù)的原理與方法技術(shù)的原理與方法 鐘召迪鐘召迪2 2.PCR定義l 聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction)簡(jiǎn)稱，是一項(xiàng)在短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增特定的片段的分子生物學(xué)技術(shù)。l 是指在DNA 聚合酶的催化下，以母鏈DNA 為模板，一特定引物為延伸起點(diǎn)，經(jīng)過(guò)變性、退火、延伸等步驟，體外復(fù)制出于母鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈DNA的過(guò)程。l 可用于基因分離克隆，序列分析，基因表達(dá)調(diào)控，基因多態(tài)性研究等。3 3.PCR反應(yīng)特點(diǎn)l特異性強(qiáng)l靈敏度高l簡(jiǎn)便、快速l對(duì)標(biāo)本的純度要求低4 4.PCR技術(shù)的基本原理lPCR的反應(yīng)成分lPCR的反應(yīng)基本步驟lPCR的反應(yīng)體系5 5

2、.PCR的反應(yīng)成分l模板DNA l引物l四種脫氧核糖核苷酸lDNA聚合酶l反應(yīng)緩沖液，Mg26 6.PCR的反應(yīng)基本步驟lPCR的反應(yīng)基本步驟l變性：高溫使雙鏈DNA解離成單鏈（94 ，30s）l退火：低溫下，引物與DNA模板互補(bǔ)區(qū)結(jié)合（55 ， 30s ）l延伸：中溫延伸，DNA聚合酶催化以引物為起點(diǎn)的DNA鏈延伸反應(yīng)（7072 ，3060s）.7 78 8.PCR的反應(yīng)體系 10擴(kuò)增緩沖液 1/10體積 4種dNTP混合物 各200umol/L 引物 (2個(gè)) 0.2umol/L 模板DNA 102 105 Taq DNA聚合酶 1 2.5單位/反應(yīng)體系 Mg2+ 1.52.5mmol/L

3、 加雙或三蒸水至 25 50ul9 9.PCR反應(yīng)五要素l引物（primer）l 酶 （Taq DNA polymerase） l dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTP） l模板 （template） lMg2+ （magnesium）1010.引物l引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵lPCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度l理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，用 PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增1111.引物設(shè)計(jì)的原則l引物最好在模板cDNA的保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)l引物長(zhǎng)度一般在1530堿基之間l引物GC含量在40%60%之間，Tm值

4、最好接近72l引物3端要避開(kāi)密碼子的第3位l引物3端不能選擇A，最好選擇Tl堿基要隨機(jī)分布l引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列1212.引物設(shè)計(jì)的原則l引物5 端和中間G值應(yīng)該相對(duì)較高，而3 端G值較低l引物的5端可以修飾，而3端不可修飾l擴(kuò)增產(chǎn)物的單鏈不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)l引物應(yīng)具有特異性1313.酶及其濃度l目前有兩種 Taq DNA 聚合酶供應(yīng) 天然酶：從棲熱水生桿菌中提純 基因工程酶：大腸菌合成l一個(gè)典型的 PCR反應(yīng)約需酶量 2.5U（指總反應(yīng)體積為100 ul時(shí)）l濃度過(guò)高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過(guò)低則合成產(chǎn)物量減少1414.DNTP 的質(zhì)量與濃度dNTP的質(zhì)量與濃度和 PCR擴(kuò)增效率

5、有密切關(guān)系dNTP呈顆粒狀， 保存不當(dāng)易變性失活dNTP溶液呈酸性，使用時(shí)應(yīng)配成高濃度后，以1M NaOH或1M Tris-HCl的緩沖液將其pH調(diào)節(jié)到7.07.5，小量分裝，-20冰凍保存。多次凍融會(huì)使dNTP降解在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等（等摩爾配制 ）， 如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí)（偏高或偏低），就會(huì)引起錯(cuò)配。濃度過(guò)低又會(huì)降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量dNTP 能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低1515.模板（靶基因，TARGET GENE）l模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一l傳統(tǒng)的DNA純化方法通常

6、采用SDS和蛋白酶K 來(lái)消化處理標(biāo)本SDS 的主要功能是：溶解細(xì)胞膜上的脂類與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜，并解離細(xì)胞中的核蛋白，SDS 還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀蛋白酶K 能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與DNA結(jié)合的組蛋白, 再用有機(jī)溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸1616.MG2+濃度lMg2+對(duì)PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響l在一般的 PCR反應(yīng)中，各種NTP濃度為200umol/L時(shí)，Mg2+濃度為1.52.0 mmol/L為宜lMg2+濃度過(guò)高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增， 濃度過(guò)低會(huì)降低 Taq DNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少1717.PCR

7、反應(yīng)條件的選擇 PCR反應(yīng)條件: : 溫度 時(shí)間 循環(huán)次數(shù)1818.溫度與時(shí)間的設(shè)置l設(shè)置變性-退火-延伸三個(gè)溫度點(diǎn)l標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法，雙鏈DNA在9095變性，再迅速冷卻至40 60，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至7075，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸l對(duì)于較短靶基因（長(zhǎng)度為100300bp時(shí)）可采用二溫度點(diǎn)法， 將退火與延伸溫度合二為一，一般采用94變性，65左右退火與延伸1919.變性溫度與時(shí)間l變性溫度低，解鏈不完全是導(dǎo)致PCR失敗的最主要原因l一般9394lmin足以使模板DNA變性 若低于93則需延長(zhǎng)時(shí)間 但溫度不能過(guò)高，因?yàn)楦邷丨h(huán)境對(duì)酶的

8、活性有影響。l此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物完全變性，就會(huì)導(dǎo)致PCR失敗2020.退火(復(fù)性)溫度與時(shí)間l退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素l變性后溫度快速冷卻至4060，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA 比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機(jī)會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞l退火溫度與時(shí)間，取決于引物的長(zhǎng)度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長(zhǎng)度l對(duì)于20個(gè)核苷酸，G+C含量約50%的引物，55為選擇最適退火溫度的起點(diǎn)較為理想2121.延伸溫度與時(shí)間l延伸溫度：一般選擇在7075之間 常用溫度為72 過(guò)高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。l延伸反應(yīng)時(shí)間：根據(jù)待擴(kuò)增片段長(zhǎng)度而定 1Kb以內(nèi)的DNA片段，延伸時(shí)間1min（足夠） 34kb的靶序列需34min 擴(kuò)增10Kb需延伸