酶工程-重點(diǎn)整理總結(jié)(共13頁(yè))

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上第1章 緒論1、 何為酶工程，試述其主要內(nèi)容和任務(wù)。 答：（1）酶工程：酶的生產(chǎn)、改性與應(yīng)用的技術(shù)過(guò)程稱為酶工程。（2）主要內(nèi)容：微生物細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶，動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶，酶的提取與分離純化，酶分子修飾，酶、細(xì)胞、原生質(zhì)體固定化，酶非水相催化，酶定向進(jìn)化，酶反應(yīng)器和酶的應(yīng)用等。（3）主要任務(wù)：經(jīng)過(guò)預(yù)先設(shè)計(jì)，通過(guò)人工操作獲得人們所需的酶，并通過(guò)各種方式使酶的催化特性得以改進(jìn)，充分發(fā)揮其催化功能。2、 酶有哪些顯著的催化特性？ 答：（1）酶催化作用的專一性強(qiáng)（絕對(duì)轉(zhuǎn)移性：一種酶只能催化一種第五進(jìn)行一種反應(yīng)；相對(duì)專一性：一種酶能夠催化一類結(jié)構(gòu)相似的底物進(jìn)行某種相同類型的反應(yīng)）

2、；（2）酶催化作用的效率高（1071013倍）；（3）酶催化作用條件溫和。3、 簡(jiǎn)述影響酶催化作用的主要因素。 答：（1）底物濃度的影響：決定酶催化作用的主要因素。酶催化反應(yīng)速度隨底物濃度增加現(xiàn)增加在逐步趨向平衡再反而下降。（2）酶濃度的影響：底物濃度足夠高的條件下，酶催化反應(yīng)速度與酶濃度成正比。（3）溫度的影響：適宜溫度范圍內(nèi)，酶能進(jìn)行催化反應(yīng)，最適溫度條件下，酶的催化反應(yīng)速度達(dá)到最大。一般60°C以上易失活，5°C以下活性極低，Taq聚合酶95°C下仍穩(wěn)定。（4）PH的影響：適宜PH范圍內(nèi)，酶才能顯示其催化活性，最適pH條件下，酶催化反應(yīng)速度達(dá)到最大。（5）抑

3、制劑的影響：在抑制劑的影響下，酶的催化活性降低甚至喪失，從而影響酶的催化功能，有競(jìng)爭(zhēng)性抑制、非競(jìng)爭(zhēng)性抑制、反競(jìng)爭(zhēng)性抑制。（6）激活劑的影響：在激活劑的作用下，酶的催化活性提高或者由無(wú)活性的酶生成有催化活性的酶。如Ca、Mg、Co、Zn、Mn、等金屬離子和Cl等無(wú)機(jī)負(fù)離子。5、 簡(jiǎn)述酶活力單位的概念和酶活力的測(cè)定方法。 答：概念：在特定條件下（溫度可采用25°C，pH等條件均采用最適條件），每1min催化1mol的底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的酶量定義為1個(gè)酶活力單位（IU）。或在特定條件下，每秒催化1mol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的酶量定義為1Kat. 測(cè)定方法：化學(xué)測(cè)定法，光學(xué)測(cè)定法，氣體測(cè)定法。 6、

4、*酶的發(fā)展歷史：我國(guó)在4000多年前的夏禹時(shí)代就已經(jīng)掌握了釀酒技術(shù)；在3000多年前的周朝，就會(huì)制造飴糖、食醬等食品，2500多年前的春秋戰(zhàn)國(guó)時(shí)期，就懂得用麥菊來(lái)治療消化不良等疾??；1833年。佩恩和帕索茲從麥芽的水抽提物中用乙醇沉淀得到一種可使淀粉水解生成可溶性糖的物質(zhì)稱之為淀粉酶；19世紀(jì)中葉，巴斯德對(duì)酵母的乙醇發(fā)酵進(jìn)行大量研究，認(rèn)為活酵母細(xì)胞內(nèi)有一種可以將糖發(fā)酵成乙醇的物質(zhì)。1878年昆尼首次將酵母中進(jìn)行乙醇發(fā)酵的物質(zhì)稱之為酶；1896年，巴克納兄弟發(fā)現(xiàn)酵母的無(wú)細(xì)胞抽提液也能將糖發(fā)酵成乙醇；1902年亨利根據(jù)蔗糖酶催化蔗糖水解的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提出了中間產(chǎn)物學(xué)說(shuō)；1913年，米徹利斯和曼吞根據(jù)

5、中間產(chǎn)物學(xué)說(shuō)，推導(dǎo)出酶催化反應(yīng)的基本動(dòng)力學(xué)方程米氏方程；1926年，薩姆納首次從刀豆提取液中分離純化得到脲酶結(jié)晶，并證明它有蛋白質(zhì)的性質(zhì)；1960年，雅各和莫諾德提出操縱子學(xué)說(shuō)；1982年切克發(fā)現(xiàn)SsRNNA前體具有自我剪接功能，認(rèn)為RNA也具有催化活性，將這種有催化活性的RNA成為核酸類酶；1983年，阿爾特曼等發(fā)現(xiàn)核酸酶。7、 *2種命名法：國(guó)際酶學(xué)委員會(huì)與1961年在“酶學(xué)委員會(huì)的報(bào)告”中提出了酶的分類與命名方案，獲得了“國(guó)際生物化學(xué)與分子生物學(xué)聯(lián)合會(huì)”的批準(zhǔn)。此后經(jīng)過(guò)多次修訂，不斷得到補(bǔ)充和完善。根據(jù)國(guó)際酶學(xué)委員會(huì)的建議，每一種具體的酶都有其推薦名和系統(tǒng)命名：推薦名是在慣用名稱基礎(chǔ)上，

6、加以選擇和修改，一般由兩部分組成：底物名稱+催化反應(yīng)的類型+酶，不管酶催化的反應(yīng)是正反應(yīng)還是逆反應(yīng)，都用一個(gè)名稱，對(duì)于水解酶類，可省去“水解”；系統(tǒng)命名法更詳細(xì)、更準(zhǔn)確的反映出該酶所催化的反應(yīng)，系統(tǒng)命名包括了酶的作用底物、酶作用的基團(tuán)及催化反應(yīng)的類型。8、 *（1）蛋白類酶分為六大類：氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂合酶、異構(gòu)酶、合成酶或連接酶。（2）核酸類酶：分子內(nèi)催化R酶：自我剪切酶、自我剪接酶；分子間催化R酶：RNA剪切酶、DNA剪切酶、多肽剪切酶、多糖剪接酶、氨基酸酯剪切酶、多功能酶。9、 *固定化酶的活力測(cè)定方法：振蕩測(cè)定法、酶柱測(cè)定法、連續(xù)測(cè)定法、固定化酶的比活力測(cè)定、酶結(jié)合效率與酶

7、活力回收率的測(cè)定。10、 *酶的生產(chǎn)方法：提取分離法、生物合成法、化學(xué)合成法。第2章 微生物發(fā)酵產(chǎn)酶1、 試述酶生物合成的基本過(guò)程。 答：（1）RNA的生物合成轉(zhuǎn)錄：轉(zhuǎn)錄的起始、RNA鏈的延伸、RNA鏈合成的終止、RNA前體的加工；（2）蛋白質(zhì)的生物合成翻譯：氨基酸活化生成氨酰-tRNA、肽鏈合成的起始、肽鏈的延伸、肽鏈合成的終止、蛋白質(zhì)前體的加工。2、 何謂酶生物合成的誘導(dǎo)作用？簡(jiǎn)述其原理。 答：加入某些物質(zhì)使酶的生物合成開(kāi)始或加速進(jìn)行的現(xiàn)象，稱為酶生物合成的誘導(dǎo)作用。能夠引起誘導(dǎo)作用的物質(zhì)稱為誘導(dǎo)物，誘導(dǎo)物一般是酶催化作用的底物或底物類似物。原理：一般來(lái)說(shuō)，不同的酶有各自不同的誘導(dǎo)物，但有

8、些誘導(dǎo)物可以誘導(dǎo)同一酶系的若干種酶，如半乳糖苷可以同時(shí)誘導(dǎo)半乳糖苷酶、透過(guò)酶和半乳糖乙?；?種酶，而一種酶往往有多種誘導(dǎo)物，可以根據(jù)需要進(jìn)行選擇。當(dāng)培養(yǎng)基中以乳糖為惟一碳源時(shí)，細(xì)胞吸收乳糖為別乳糖。別乳糖作為誘導(dǎo)物與阻遏蛋白結(jié)合，使阻遏蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而使它與操縱基因的結(jié)合力減弱，阻遏蛋白不能與操縱基因結(jié)合，就使RNA聚合酶可以與啟動(dòng)基因結(jié)合，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄而合成結(jié)構(gòu)基因所對(duì)應(yīng)的酶。3、 什么是酶生物合成的反饋?zhàn)瓒糇饔茫亢?jiǎn)述其原理。 答：又稱產(chǎn)物阻遏作用，指酶催化反應(yīng)的產(chǎn)物或代謝途徑的末端產(chǎn)物使該酶的生物合成受到阻遏的現(xiàn)象。引起反饋?zhàn)瓒糇饔玫奈镔|(zhì)稱為阻遏物，阻遏物一般是酶催化反應(yīng)的產(chǎn)物或是代

9、謝途徑的末端產(chǎn)物。原理：當(dāng)環(huán)境中色氨酸濃度增加，阻遏物達(dá)到一定程度時(shí)，阻遏蛋白與阻遏物結(jié)合，使其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而使阻遏蛋白與操縱基因的結(jié)合力增強(qiáng)。阻遏蛋白與操縱基因結(jié)合，就排擠RNA聚合物與啟動(dòng)基因的結(jié)合，使轉(zhuǎn)錄無(wú)法進(jìn)行，酶的生物合成因此受到阻遏。4、 簡(jiǎn)述分解代謝物阻遏作用的原理和解除方法。 答：指某些物質(zhì)經(jīng)過(guò)分解代謝產(chǎn)生的物質(zhì)阻遏某些酶（主要是誘導(dǎo)酶）生物合成的現(xiàn)象。原理：某些物質(zhì)經(jīng)過(guò)分解放出能量，有一部分能量?jī)?chǔ)存在ATP中。ATP是由AMP和ADP通過(guò)磷酸化作用產(chǎn)生的。細(xì)胞內(nèi)的ATP濃度增加，ADP濃度降低，存在于細(xì)胞內(nèi)的cAMP就通過(guò)磷酸二酯酶的作用水解生成AMP。同時(shí)腺苷酸環(huán)化酶的

10、活化受到抑制而使cAMP 的生成受阻，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)cAMP的濃度降低。這就必然使cAMP-CAP的復(fù)合物濃度降低，結(jié)果啟動(dòng)基因的相應(yīng)位點(diǎn)上沒(méi)有足夠的cAMP-CAP復(fù)合物結(jié)合，RNA聚合酶也就無(wú)法結(jié)合到其在啟動(dòng)基因的相應(yīng)位點(diǎn)上，轉(zhuǎn)錄無(wú)法進(jìn)行，酶的生物合成收到阻遏。解除方法：分解代謝物阻遏作用以及該阻遏作用的解除，實(shí)質(zhì)上是cAMP通過(guò)啟動(dòng)基因?qū)γ干锖铣蛇M(jìn)行調(diào)節(jié)控制。在培養(yǎng)環(huán)境中控制好某些降解物質(zhì)的量，或在必要時(shí)添加一定量的cAMP，均可減少或解除分解代謝物阻遏作用。5、 酶的生物合成有哪幾種模式？ 答：（1）同步合成型：酶的生物合成與細(xì)胞生長(zhǎng)同步進(jìn)行。（2）延續(xù)合成型：酶的生物合成在細(xì)胞的生

11、長(zhǎng)階段開(kāi)始，在細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期后酶還可以延續(xù)合成一段較長(zhǎng)時(shí)間。（3）中期合成型：酶在細(xì)胞生長(zhǎng)一段時(shí)間以后才開(kāi)始，而細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期以后，酶的生物合成也隨之停止。（4）滯后合成型：在細(xì)胞生長(zhǎng)一段時(shí)間或進(jìn)入平衡期以后才開(kāi)始其生物合成并大量積累，又稱為非生長(zhǎng)偶聯(lián)型。6、 如何控制微生物發(fā)酵產(chǎn)酶的工藝條件？ 答：（1）細(xì)胞活化與擴(kuò)大培養(yǎng)；（2）培養(yǎng)基的配制；（3）pH的調(diào)節(jié)控制；（4）溫度的調(diào)節(jié)控制；（5）溶解氧的調(diào)節(jié)控制：調(diào)節(jié)通氣量、調(diào)節(jié)氧分壓、調(diào)節(jié)氣液接觸時(shí)間、調(diào)節(jié)氣液接觸面積、改變培養(yǎng)液性質(zhì)。7、 提高酶產(chǎn)量的措施有哪些？ 答：（1）添加誘導(dǎo)物（2）控制阻遏物的濃度（3）添加表面活性劑（4）

12、添加產(chǎn)酶促進(jìn)劑。10、 簡(jiǎn)述固定化微生物細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶的特點(diǎn)。 答： 提高產(chǎn)酶率；可以反復(fù)使用或連續(xù)使用較長(zhǎng)的時(shí)間；基因工程菌的質(zhì)粒穩(wěn)定，不易丟失；發(fā)酵穩(wěn)定性好；縮短發(fā)酵周期，提高設(shè)備利用率；產(chǎn)品容易分離純化；適用于胞外酶等胞外產(chǎn)物的生產(chǎn)。（固定化細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶的工藝條件及其控制：固定化細(xì)胞的與培養(yǎng)；溶解氧的供給；溫度的控制；培養(yǎng)基組分的控制。）11、 固定化微生物原生質(zhì)體發(fā)酵產(chǎn)酶的特點(diǎn)。 答：變胞內(nèi)產(chǎn)物為胞外產(chǎn)物；提高產(chǎn)酶率；由于有載體的保護(hù)作用，穩(wěn)定性較好，可以連續(xù)或重復(fù)使用較長(zhǎng)時(shí)間；易于分離純化（固定化原生質(zhì)體發(fā)酵產(chǎn)酶的工藝條件極其控制：滲透壓的控制；防止細(xì)胞壁再生；保證原生質(zhì)體的濃度。）。

13、12、 *優(yōu)良的產(chǎn)酶微生物應(yīng)當(dāng)具備的條件：酶的產(chǎn)量高；產(chǎn)酶穩(wěn)定性好；容易培養(yǎng)和管理；利于酶的分離純化；安全可靠、無(wú)毒性。13、 *酶的發(fā)酵根據(jù)微生物培養(yǎng)方式不同：固體培養(yǎng)發(fā)酵、液體深層發(fā)酵、固定化微生物細(xì)胞發(fā)酵、固定化微生物原生質(zhì)體發(fā)酵。14、 *酶生物合成的調(diào)節(jié)：分解代謝物阻遏作用、酶生物合成的誘導(dǎo)作用、酶生物合成的反饋?zhàn)瓒糇饔谩?5、 *組成型酶：在細(xì)胞中的量比較恒定，環(huán)境因素對(duì)這些酶的合成速率影響不大。適應(yīng)型酶/調(diào)節(jié)型酶：在細(xì)胞中含量變化大，其合成速率明顯受到環(huán)境因素的影響。16、 *在DNA分子中，與酶的生物合成有密切關(guān)系的基因有4種：結(jié)構(gòu)基因：與多肽鏈有各自的對(duì)應(yīng)關(guān)系。操縱基因：可以

14、與調(diào)節(jié)基因產(chǎn)生的變構(gòu)蛋白（阻遏蛋白）中的一種結(jié)構(gòu)結(jié)合從而操縱酶生物合成的時(shí)機(jī)和合成速度。啟動(dòng)基因：決定酶的合成能否開(kāi)始，有兩個(gè)位點(diǎn)，RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)和cAMP-CAP結(jié)合位點(diǎn)。調(diào)節(jié)基因：可以產(chǎn)生一種阻遏蛋白。 結(jié)構(gòu)基因、操縱基因、啟動(dòng)基因一起組成操縱子。17、 *常用的產(chǎn)酶微生物：細(xì)菌：大腸桿菌；枯草芽孢桿菌：（最廣泛）淀粉酶、蛋白酶、葡聚糖酶、5-核苷酸酶和堿性磷酸酶。放線菌：鏈霉菌：葡萄糖異構(gòu)酶。霉菌：紅曲霉可用于生產(chǎn)淀粉酶、糖化酶、麥芽糖酶、蛋白酶；黑曲霉；米曲霉；青酶；木霉；根酶；毛酶。酵母：啤酒酵母；假絲酵母。18、 *常用的保藏方法：斜面保藏法、沙土管保藏法、真空冷凍干燥保藏法

15、、低溫保藏法、石蠟油保藏法。19、 *培養(yǎng)基：碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子。20、 *最適pH：細(xì)菌、放線菌6.58.0；酵母、霉菌46 偏酸；植物細(xì)胞56.21、 *誘導(dǎo)物一般分為三類：酶的作用底物、酶的催化反應(yīng)產(chǎn)物、作用底物的類似物。22、 *發(fā)酵動(dòng)力學(xué)包括：細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)、產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)/產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)、機(jī)制消耗動(dòng)力學(xué)。產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)主要研究發(fā)酵過(guò)程中細(xì)胞產(chǎn)酶速率以及各種因素對(duì)產(chǎn)酶速率的影響規(guī)律。產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)模型/產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)方程：RE=dE/dt=(+)·X 其中X為細(xì)胞濃度，為細(xì)胞比生長(zhǎng)速率，為生長(zhǎng)偶聯(lián)的比產(chǎn)酶系數(shù)，為非偶聯(lián)的產(chǎn)酶速率，E為酶濃度。第3章 動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶2、 何謂抗

16、體酶？試述獲得抗體酶的主要方法。答：抗體酶又稱催化性抗體，是一類具有生物催化功能的抗體分子。制備抗體酶的主要方法有修飾法：對(duì)抗體進(jìn)行分子修飾，在抗體與抗原的結(jié)合部位引進(jìn)催化基團(tuán)而成為抗體酶；誘導(dǎo)法：是利用特定的抗原誘導(dǎo)抗體酶合成的方法（主要），有半抗原誘導(dǎo)法和酶蛋白誘導(dǎo)法。3、 植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶有何特點(diǎn)？答：提高產(chǎn)率；縮短周期；易于管理、減輕勞動(dòng)強(qiáng)度；提高產(chǎn)品質(zhì)量；其他：對(duì)剪切力敏感、生長(zhǎng)周期長(zhǎng)（缺點(diǎn)）。5、 試述植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶的工藝條件及其控制。答：（1）植物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝流程：外植體的選擇與處理；植物細(xì)胞的獲取：直接分離法、愈傷組織誘導(dǎo)法、原生質(zhì)體再生法；細(xì)胞懸浮培養(yǎng)；分離純化。（2）植

17、物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基：特點(diǎn)：需要大量無(wú)機(jī)鹽、多種維生素和植物生長(zhǎng)激素、無(wú)機(jī)氮源、蔗糖為碳源；常用：MS培養(yǎng)基（無(wú)機(jī)鹽濃度較高，為較穩(wěn)定的離子平衡溶液，營(yíng)養(yǎng)成分的種類和比例較適宜，可以滿足植物細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)要求，其中硝酸鹽的濃度比其他培養(yǎng)基高，故廣泛應(yīng)用于植物細(xì)胞、組織和原生質(zhì)體培養(yǎng)）、B5培養(yǎng)基、White培養(yǎng)基、KM-8P培養(yǎng)基。（3）溫度的控制，通常不低于20度不高于35度。（4）pH的控制：培養(yǎng)基一般是5.55.8之間。（5）溶解氧的調(diào)節(jié)控制。（6）光照的控制。（7）前體的添加。（8）刺激劑的應(yīng)用。6、 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中要注意哪些工藝條件。答：（1）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的組成成分：氨基酸、維生素、

18、無(wú)機(jī)鹽、葡萄糖、激素、生長(zhǎng)因子等。（2）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的配制。（3）溫度的控制。（4）pH的控制。（5）滲透壓的控制。（6）溶解氧的控制。7、 舉例說(shuō)明動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶的工藝過(guò)程。答：以人黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生組織纖溶酶原活化劑（tPA）為例：（1）配制人黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)基；（2）人黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)： 將人黑色素瘤的種質(zhì)細(xì)胞用胰蛋白酶消化處理，細(xì)胞分散后，用pH7.4的磷酸緩沖液洗滌，技術(shù)，稀釋成細(xì)胞懸液；在消毒好的反應(yīng)器中裝入一定量的培養(yǎng)液，將上述細(xì)胞懸浮液接種至反應(yīng)器中，濃度為（13）*103個(gè)細(xì)胞/mL，于37度的CO2培養(yǎng)箱中，通入5%CO2的無(wú)菌空氣，培養(yǎng)至長(zhǎng)成單層致密細(xì)胞；傾去細(xì)胞液

19、，用pH7.4的磷酸緩沖液洗滌細(xì)胞23次；換入一定量的無(wú)血清Eagle培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)；每隔34天，取出培養(yǎng)液進(jìn)行tPA的分離純化；再向反應(yīng)器中加入新鮮的無(wú)血清Eagle培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，以獲得大量tPA。（3）組織纖溶酶原活化劑的分離純化。8、 *動(dòng)物細(xì)胞可以采用離心分離技術(shù)、雜交瘤技術(shù)、胰蛋白酶消化處理技術(shù)等獲得。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方式有懸浮培養(yǎng)、貼壁培養(yǎng)和微載體培養(yǎng)。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的主要目的是獲得疫苗、激素、多肽藥物、單克隆抗體、酶、皮膚等人體組織、器官等功能性蛋白質(zhì)。9、 *植物細(xì)胞可以通過(guò)機(jī)械搗碎或酶解的方法直接從外植體中分離得到。植物細(xì)胞培養(yǎng)方式有固體培養(yǎng)、液體懸浮培養(yǎng)等，在次級(jí)代謝物的生

20、產(chǎn)中常用液體懸浮培養(yǎng)。植物細(xì)胞培養(yǎng)主要用于生產(chǎn)色素、藥物、香精、酶等次級(jí)代謝產(chǎn)物。10、 *動(dòng)植物細(xì)胞中酶生物合成的調(diào)節(jié)：細(xì)胞分化改變酶的生物合成；基因擴(kuò)增加速酶的生物合成；增強(qiáng)子促進(jìn)酶的生物合成；抗原誘導(dǎo)抗體酶的生物合成。11、 *端粒是真核生物染色體的末端結(jié)構(gòu)，作用是保護(hù)真核生物的染色體免遭破壞，是通過(guò)端粒酶的催化作用而成的。端粒酶是催化端粒合成和延長(zhǎng)的酶。12、 *動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn)：主要用于各種功能蛋白質(zhì)和多肽的生產(chǎn)；動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)較慢，為防止微生物污染，在培養(yǎng)過(guò)程中要添加抗生素（青霉素、鏈霉素）；動(dòng)物細(xì)胞體積大，無(wú)細(xì)胞壁保護(hù)，對(duì)剪切力敏感，在培養(yǎng)過(guò)程中，必須嚴(yán)格控制溫度、pH、滲透壓、

21、通風(fēng)攪拌等條件以免破壞細(xì)胞；大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞具有錨地依賴性，適宜采用貼壁培養(yǎng)，部分細(xì)胞可采用懸浮培養(yǎng)。培養(yǎng)基成分復(fù)雜，一般要添加血清或其代用品，產(chǎn)品的分離純化過(guò)程較繁雜，成本較高、適用于高價(jià)值藥物生產(chǎn)；原代細(xì)胞繼代培養(yǎng)50代后，即會(huì)退化死亡，要重新分離細(xì)胞。第4章 酶的提取與分離純化1、 細(xì)胞破碎的方法主要有哪些？各有何特點(diǎn)？答：細(xì)胞破碎是通過(guò)各種方法使細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)破壞的技術(shù)過(guò)程。分類細(xì)胞破碎方法細(xì)胞破碎原理機(jī)械破碎法搗碎法通過(guò)機(jī)械運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的剪切力，使組織、細(xì)胞破碎研磨法勻漿法物理破碎法溫度差破碎法通過(guò)各種物體因素的作用，使組織、細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)破壞，而使細(xì)胞破碎壓力差破碎法超聲波破碎法化學(xué)破碎法

22、添加有機(jī)溶劑通過(guò)各種化學(xué)試劑對(duì)細(xì)胞膜的作用，從而使細(xì)胞破碎添加表面活性劑酶促破碎法自溶法通過(guò)細(xì)胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，是細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，從而達(dá)到細(xì)胞破碎外加酶制劑法特點(diǎn)：機(jī)械破碎法：處理量大，破碎效率高，速度快。物理破碎法：處理?xiàng)l件比較溫和，有利于目標(biāo)產(chǎn)物的高活力釋放回收，但破碎效率低，產(chǎn)物釋放速度快，處理時(shí)間長(zhǎng)，不適合大規(guī)模細(xì)胞破碎的需要。多局限于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的小批量使用。化學(xué)破碎法：優(yōu)點(diǎn)：比機(jī)械破碎法的選擇性高，胞內(nèi)產(chǎn)物總釋放率低，料液黏度小，有利于后處理。缺點(diǎn)：通透性差，時(shí)間長(zhǎng)，效率低，一般胞內(nèi)物質(zhì)釋放率不超過(guò)5%，有些化學(xué)試劑有毒。酶促破碎法：優(yōu)點(diǎn)：選擇性釋放產(chǎn)物，條件

23、溫和，核酸泄出量少，細(xì)胞外形完整。 2、 試述酶提取的主要方法。答：酶的提取是指在一定的條件下，用適當(dāng)?shù)娜軇┗蛉芤禾幚砗冈希姑赋浞秩芙獾饺軇┗蛉芤旱倪^(guò)程，也稱為酶的抽提。主要影響因素有：溫度、pH、提取液的體積。提取方法使用的溶劑或溶液提取對(duì)象鹽溶液提取0.020.5mol/L的鹽溶液用于提取在低濃度鹽溶液中溶解度較大的酶酸溶液提取pH26的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大且穩(wěn)定性較好的酶堿溶液提取pH812的水溶液用于提取在稀堿溶液中溶解度大且穩(wěn)定性較好的酶有機(jī)溶劑提取可與水混溶的有機(jī)溶劑用于提取與脂質(zhì)結(jié)合牢固或含有較多非極性基團(tuán)的酶3、 簡(jiǎn)述酶沉淀分離方法的原理與特點(diǎn)。答：沉淀分離

24、是通過(guò)改變某些條件或添加某種物質(zhì)，使酶的溶解度降低，而從溶液中沉淀析出，與其他溶質(zhì)分離的技術(shù)過(guò)程。（最多的是硫酸銨）沉淀分離方法分離原理鹽析沉淀法利用不同蛋白質(zhì)在不同的鹽濃度的條件下溶解度不同的特征，通過(guò)在酶液中添加一定濃度的中性鹽，使酶或雜質(zhì)從溶液中析出沉淀，從而使酶與雜質(zhì)分離。等電點(diǎn)沉淀法利用兩性電解質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低，以及不同的兩性電解質(zhì)有不同的等電點(diǎn)這一特性，通過(guò)調(diào)節(jié)溶液的pH，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離。有機(jī)溶劑沉淀法利用酶與其他雜質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度不同，通過(guò)添加一定量的某種有機(jī)溶劑，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離。復(fù)合沉淀法在酶液中加入某些物質(zhì)，使它與酶

25、形成復(fù)合物而沉淀下來(lái)，從而使酶與雜質(zhì)分離。選擇變性沉淀法選擇一定的條件使酶液中存在的某些雜質(zhì)變性沉淀而不影響所需的酶，從而使酶與雜質(zhì)分離。特點(diǎn)：鹽析沉淀法：不同濃度的蛋白質(zhì)濃度產(chǎn)生沉淀所要求的臨界濃度不同；蛋白質(zhì)濃度大時(shí)，中性鹽極限沉淀低，共沉作用強(qiáng)，分辨率低，但用鹽量減少，蛋白質(zhì)溶解損失小；蛋白質(zhì)濃度低時(shí)相反，中性鹽極限沉淀高，共沉作用弱，分辨率高，但用鹽量增大，蛋白質(zhì)回收率低。等電點(diǎn)沉淀法：在溶液的pH等于溶液中某兩性電解質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，該兩性電解質(zhì)分子的凈電荷為零，分子間的靜電斥力消除，使分子能聚集在一起而沉淀下來(lái)；由于在等電點(diǎn)時(shí)兩性電解質(zhì)分子表面的水化膜仍然存在，使酶等大分子物質(zhì)仍有一定

26、的溶解性，而使沉淀不完全；在實(shí)際使用時(shí)，等電點(diǎn)沉淀法往往與其他方法一起使用；有時(shí)單獨(dú)使用等電點(diǎn)沉淀法主要是用于粗酶液中除去某些等電點(diǎn)相距較大的雜蛋白。 有機(jī)溶劑沉淀法：一般比鹽析法析出的沉淀易于離心或過(guò)濾分離，不含無(wú)機(jī)鹽，分辨率也比較高；但是有機(jī)溶劑沉淀法容易引起酶的變性失活，所以必須在低溫條件下操作，而且沉淀析出后要盡快分離，盡量減少有機(jī)溶劑對(duì)酶活力的影響。 4、 何謂膜分離技術(shù)？在酶的生產(chǎn)中有何應(yīng)用？答：借助一定孔徑的高分子薄膜，將不同大小、不同形狀和不同特性的物質(zhì)顆?；蚍肿舆M(jìn)行分離的技術(shù)成為膜分離技術(shù)。薄膜的作用是選擇性的讓小于其孔徑的物質(zhì)顆?；蚍肿油ㄟ^(guò)，而把大于其孔徑的顆粒截留。根據(jù)物

27、質(zhì)顆?；蚍肿油ㄟ^(guò)薄膜的原理和推動(dòng)力的不同，膜分離可以分為三類：加壓膜分離（微濾、超濾、反滲透）、電場(chǎng)膜分離（電滲析、離子交換膜電滲析）、擴(kuò)散膜分離（透析）。應(yīng)用：（用于酶液或其他溶劑的脫鹽，用于酶的分離純化，酶的濃縮）超濾：酶的分離純化、酶液濃縮、液體酶制劑的生產(chǎn)；反滲透：無(wú)離子水的制備、海水淡化；電滲析：酶液或其他溶液的脫鹽、海水淡化、純水制備、其他帶電荷小分子的分離；離子交換膜電滲析：酶液脫鹽、海水淡化、從發(fā)酵液中分離檸檬酸、谷氨酸等帶有電荷的小分子發(fā)酵產(chǎn)物；透析：酶等生物大分子的分離純化、從中去除無(wú)機(jī)鹽等小分子物質(zhì)。5、 簡(jiǎn)述雙水相萃取和超臨界萃取的概念與特點(diǎn)。答：（1）雙水相萃?。弘p水

28、相萃取的兩相分別為互不相溶的兩個(gè)水相。利用溶質(zhì)在兩個(gè)互不相溶的水相中的溶解度不同達(dá)到分離。雙水相萃取中使用的雙水相一般由按一定百分比組成的互不相溶的鹽溶液和高分子溶液或者兩種互不相溶的高分子溶液組成（如硫酸銨和聚乙二醇）。在雙水相系統(tǒng)中，蛋白質(zhì)、RNA等。特點(diǎn)：含水量高，適宜提取水溶性的蛋白質(zhì)、酶等生物活性物質(zhì)，且不易引起蛋白質(zhì)的變性失活。不存在有機(jī)溶劑殘留問(wèn)題。易于放大，各種參數(shù)可按比例放大而產(chǎn)物收率并不降低。但分離后的酶濃度較低，需要經(jīng)過(guò)濃縮等提高濃度。（2）超臨界萃?。河址Q為超臨界流體萃取，是利用欲分離物質(zhì)與雜質(zhì)在超臨界流體中的溶解度不同而達(dá)到分離的一種萃取技術(shù)。在溫度和壓力超過(guò)某物質(zhì)的

29、超臨界點(diǎn)時(shí)，該物質(zhì)成為超臨界流體，最常用CO2。特點(diǎn)：具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性，對(duì)設(shè)備沒(méi)有腐蝕性；臨界溫度在室溫附近或操作溫度附近；萃取劑選擇性好，易制得高純度的制品；溶解度高，減少溶劑的循環(huán)量。可分為：等壓分離、等溫分離、吸附分離6、試述凝膠層析、親和層析、離子交換層析的原理和操作要點(diǎn)。答：（1）凝膠層析：凝膠層析柱中裝有多孔凝膠，當(dāng)含有各組分的混合溶液流經(jīng)凝膠層析柱時(shí)，各組分在層析柱內(nèi)同時(shí)進(jìn)行兩種運(yùn)動(dòng)。隨著溶液流動(dòng)而進(jìn)行的垂直向下的移動(dòng)無(wú)定向的分子擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)（布朗運(yùn)動(dòng)）。大分子物質(zhì)由于直徑大，不能進(jìn)入凝膠的微孔，只能分布于凝膠顆粒的間隙中，以較快的速度流過(guò)凝膠柱。較小的分子能進(jìn)入凝膠微孔內(nèi)，使小

30、分子物質(zhì)向下移動(dòng)的速度比大分子的慢，從而使混合液中各組分按照相對(duì)分子質(zhì)量由大到小的順序先后流出層析柱，達(dá)到分離的目的。操作過(guò)程一般包括裝柱、上柱、洗脫等過(guò)程。 （2）親和層析：原理：親和層析是利用生物分子與配基之間所具有的的可逆的親和力，使生物分子分離純化的層析技術(shù)。當(dāng)酶液流經(jīng)親和層析試劑時(shí)，酶分子與其配基分子結(jié)合留在柱內(nèi)，而其他雜質(zhì)不與配基結(jié)合，可洗滌流出，然后用適當(dāng)?shù)南疵撘哼M(jìn)行洗脫，達(dá)到酶的分離純化。 方法：分子對(duì)親和層析、免疫親和層析、共價(jià)親和層析、疏水層析、金屬離子親和層析、染料親和層析、凝集素親和層析。（3）離子交換層析：原理：離子交換層析是用離子交換劑上的可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）對(duì)各

31、種離子的親和力不同而達(dá)到分離目的的一種層析方法。離子交換劑是含有若干活性基因的不溶性高分子物質(zhì)，通過(guò)在不溶性高分子物質(zhì)（母體）上引入若干可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）而制成。帶電量小，親和力小的先被洗脫下來(lái)，帶電量多，親和力大的后被洗脫下來(lái)。操作過(guò)程一般包括：裝柱、上柱、洗脫和收集、再生。7、 簡(jiǎn)述凝膠電泳的分類及其原理。答：凝膠電泳是以各種具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多孔凝膠作為支持體的電泳技術(shù)，凝膠電泳同時(shí)具有電泳和分子篩的雙重作用，具有很高的分辨率。主要有（瓊脂糖凝膠電泳和）聚丙烯酰胺凝膠電泳，分為（1）連續(xù)凝膠電泳：只用一層凝膠，采用相同的pH和相同的緩沖液。此法配制凝膠時(shí)較為簡(jiǎn)便，但是分離效果稍差，用于組

32、分較少的樣品的分離。（2）不連續(xù)凝膠電泳：采用2或3層性質(zhì)不同的凝膠重疊起來(lái)使用，采用2種不同的pH和不同的緩沖液，能使?jié)舛容^低的各組分在電泳過(guò)程中濃縮成層，從而提高分辨率。（樣品膠、濃縮膠pH6.76.8、分離膠ph8.88.9）（3）梯度凝膠電泳：采用由上而下濃度逐漸升高、孔徑逐漸減小的梯度凝膠進(jìn)行電泳。梯度凝膠用梯度混合裝置制成，主要用于測(cè)定球蛋白類組分的分子質(zhì)量。（4）SDS凝膠電泳：（負(fù)電荷）主要用于蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定。8、 酶結(jié)晶的主要方法有：鹽析結(jié)晶法、有機(jī)溶劑結(jié)晶法、透析平衡結(jié)晶法、等電點(diǎn)結(jié)晶法。9、*酶的提取分離純化技術(shù)細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎法搗碎法、研磨法、勻漿法物理破碎法

33、溫度差破碎法、壓力差破碎法、超聲波破碎法化學(xué)破碎法添加有機(jī)溶劑、添加表面活性劑酶促破碎法自溶法、外加酶制劑法提取鹽溶液提取、酸溶液提取、堿溶液提取、有機(jī)溶劑提取沉淀分離鹽析沉淀法、等電點(diǎn)沉淀法、有機(jī)溶劑沉淀法、復(fù)合沉淀法、選擇性變性沉淀法離心分離差速離心、密度梯度離心、等密梯度離心過(guò)濾與膜分離非膜過(guò)濾粗濾（常壓過(guò)濾、加壓過(guò)濾、減壓過(guò)濾）、微濾膜分離技術(shù)加壓膜分離（微濾、超濾、反滲透）、電場(chǎng)膜分離（電滲析、離子交換膜電滲析）、擴(kuò)散膜分離層析分離吸附層析（洗脫方法：溶劑洗脫法、置換洗脫法、前緣洗脫法）分配層析紙上層析、薄層層析離子交換層析凝膠層析親和層析分子對(duì)親和層析、免疫親和層析、共價(jià)親和層析、

34、疏水層析、金屬離子親和層析、染料親和層析、凝集素親和層析層析聚焦電泳分離紙電泳、薄層電泳、薄膜電泳、凝膠電泳、等電聚焦電泳萃取分離有機(jī)溶劑萃取、雙水相萃取、超臨界萃?。ǖ葔?、等溫和吸附分離）、反膠束萃取結(jié)晶鹽析結(jié)晶法、有機(jī)溶劑結(jié)晶法、透析平衡結(jié)晶法、等電點(diǎn)結(jié)晶法濃縮與干燥濃縮、干燥（真空干燥、冷凍干燥、噴霧干燥、氣流干燥、吸附干燥）10、 *要純的：電泳；要量多的：沉淀；要又純又多的：層析。11、 *常速/低速離心機(jī)最大轉(zhuǎn)速8000r/min；高速離心機(jī)(12.5)*104r/min；超速離心機(jī)(2.512)*104r/min。12、 *層析分離：是利用混合液中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)（分子的大小

35、和形狀、分子極性、吸附力、分子親和力、分配系數(shù)等）的不同，使各組分以不同比例分布在兩相中（固定相和流動(dòng)相）。當(dāng)流動(dòng)相流經(jīng)固定相是，各組分以不同的速度移動(dòng)，從而使不同的組分分離純化。13、 *電泳：帶電粒子在電場(chǎng)中向著與其本身所帶電荷相反的電極移動(dòng)的過(guò)程。其移動(dòng)速度主要決定于其本身所帶的靜電荷量。14、 *不同電泳的應(yīng)用范圍：（1）淀粉板薄層電泳：蛋白質(zhì)、核酸、酶。（2）薄膜電泳：酶。（3）凝膠電泳：蛋白質(zhì)。連續(xù)凝膠電泳：組分較少的樣品分離；不連續(xù)凝膠電泳：靜電荷相同的組分也可以分離；梯度凝膠電泳：測(cè)定球蛋白類組分的分子質(zhì)量；SDS-凝膠電泳：蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定。（4）等電聚焦電泳：酶的等

36、電點(diǎn)測(cè)定及酶和其他蛋白質(zhì)的分離。15、 *SDS-凝膠電泳：蛋白質(zhì)溶液中加入SDS和巰基乙醇后，巰基乙醇能使蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵還原，SDS能使蛋白質(zhì)分子的氫鍵、疏水鍵打開(kāi)，并與蛋白質(zhì)分子結(jié)合，形成蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物，由于SDS帶負(fù)電荷，使各種復(fù)合物帶上了相同密度的負(fù)電荷，而掩蓋了原來(lái)電荷的差別，此外，SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后，引起蛋白石構(gòu)象的變化，在水溶液中變成長(zhǎng)橢圓形，且長(zhǎng)軸的長(zhǎng)度與相對(duì)分子質(zhì)量成正比，因此，蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物在凝膠電泳轟額遷移率不再受原有電荷和分子形狀的影響，至于相對(duì)分子質(zhì)量有關(guān)。16、 *反膠束：又稱反膠團(tuán)，是表面活性劑分散于連續(xù)有機(jī)相中形成的納米尺度的一種聚集體，反膠

37、束溶液是透明的、熱力學(xué)穩(wěn)定的系統(tǒng)。表面活性劑是由極性基團(tuán)和非極性基團(tuán)組成的兩性分子。第5章 酶分子修飾1、 試述酶分子修飾的概念和作用。答：通過(guò)各種方法使酶分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些變化，從而改變酶的催化特性的技術(shù)過(guò)程稱為酶分子修飾。通過(guò)酶分子修飾，可以使酶分子結(jié)構(gòu)發(fā)生某些合理的改變，就有可能提高酶的催化效率、增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性、降低或消除酶的抗原性、改變酶的底物專一性等，同時(shí)通過(guò)酶分子修飾，研究和了解酶分子中主鏈、側(cè)鏈、組成單位、金屬離子和各種物理因素對(duì)酶分子空間構(gòu)象的影響，可以進(jìn)一步探討其結(jié)構(gòu)與催化特性之間的關(guān)系。2、 何謂金屬離子置換修飾？簡(jiǎn)述其主要修飾過(guò)程和作用。答：（1）把酶分子中的金屬離子換成

38、另一種金屬離子，使酶的催化特性發(fā)生改變的修飾方法成為金屬離子置換修飾。（2）方法：酶的分離純化、除去原有的金屬離子、加入置換離子。（3）作用：闡明金屬離子對(duì)酶催化作用的影響；提高酶的催化效率；增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性；改變酶的動(dòng)力學(xué)特性。3、 何謂大分子結(jié)合修飾？有何作用？答：（1）采用水溶性大分子與酶的側(cè)鏈基團(tuán)共價(jià)結(jié)合，使酶分子的空間構(gòu)象發(fā)生改變，從而改變酶的催化特性的方法稱為大分子結(jié)合修飾。（最廣泛）（修飾劑的選擇、修飾劑的活化、修飾、分離）（2）作用：通過(guò)修飾提高酶的催化效率；通過(guò)修飾可以增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性；通過(guò)修飾降低或消除酶蛋白的抗原性。6、簡(jiǎn)述定點(diǎn)突變技術(shù)的主要技術(shù)過(guò)程及其在酶分子修飾中的應(yīng)用。

39、答：定點(diǎn)突變是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來(lái)的一種基因操作技術(shù)，是指在DNA序列中的某一特定位點(diǎn)上進(jìn)行堿基的改變從而獲得突變基因的操作技術(shù)。定點(diǎn)突變技術(shù)是氨基酸置換修飾和核苷酸置換修飾的常用方法，也是蛋白質(zhì)工程的常用技術(shù)。（1）主要過(guò)程：新的酶分子結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)；突變基因堿基序列的確定；突變基因的獲得；新酶的獲得。（2）應(yīng)用：酪氨酰-tRNA合成酶的修飾是將第51位的蘇氨酸由脯氨酸置換，蘇氨酸的密碼子是ACU、ACC、ACA、ACG，脯氨酸的密碼子是CUU、CCC、CCA、CCG，在mRNA上只需將密碼子上的第一個(gè)A換成C，在對(duì)應(yīng)的基因上只需將T換成G即可達(dá)到置換的目的。T4溶菌酶的修飾是將第3位以異亮

40、氨酸（密碼子為AUU、AUC、AUA，對(duì)應(yīng)基因上的堿基次序?yàn)門AA、TAG、TAT）置換成半胱氨酸（密碼子為UGU、UGC，對(duì)應(yīng)基因上的堿基次序?yàn)锳CA、ACG），只需在對(duì)應(yīng)基因的位點(diǎn)上置換兩個(gè)堿基，由AC置換TA即可。7、 *酶分子的修飾：金屬離子置換修飾；大分子結(jié)合修飾；側(cè)臉集團(tuán)修飾：氨基修飾、羧基修飾（碳化二亞胺EDC最普遍，可以在較溫和的條件下與酶分子的羧基發(fā)生酯化反應(yīng)，可定量測(cè)定酶分子中羧基的數(shù)目）、巰基修飾、胍基修飾、咪唑基修飾、吲哚基修飾、分子內(nèi)交聯(lián)修飾；肽鏈有限水解修飾；核苷酸鏈剪切修飾；氨基酸置換修飾：化學(xué)修飾法、定點(diǎn)突變技術(shù)；核苷酸置換修飾；物理修飾。8、 *酶分子修飾的應(yīng)

41、用：（1）在酶學(xué)研究方面的應(yīng)用：酶的活性中心研究；酶的空間結(jié)構(gòu)研究；酶的作用機(jī)制研究（親和標(biāo)記法、差示標(biāo)記法、氨基酸置換法、核苷酸置換法）。（2）在醫(yī)藥方面的應(yīng)用：降低或消除酶抗原性；增強(qiáng)醫(yī)藥用酶的穩(wěn)定性。（3）在工業(yè)方面的應(yīng)用：提高工業(yè)用酶的催化效率；增強(qiáng)工業(yè)用酶的穩(wěn)定性；改變酶的動(dòng)力學(xué)特性。（4）在抗體酶研究開(kāi)發(fā)方面的應(yīng)用（抗體酶又稱催化性抗體，是一類具有催化功能的抗體）。（5）在核酸類酶人工改造方面的應(yīng)用。（6）在有機(jī)介質(zhì)酶催化反應(yīng)中的應(yīng)用。第6章 酶、細(xì)胞、原生質(zhì)體固定化1、 舉例說(shuō)明常用的固定化方法。答：（1）酶的固定化方法：吸附法（納米級(jí)顆粒，活性炭）；包埋法（瓊脂糖、海藻酸鈉）：

42、凝膠包埋法、半透膜包埋法；結(jié)合法（選擇適宜的載體，使之通過(guò)共價(jià)鍵或離子鍵與酶結(jié)合在一起的固定化方式。）離子鍵結(jié)合法、共價(jià)鍵結(jié)合法（重氮法、EDC是一個(gè)氨基和羧基在中性條件下有效結(jié)合形成肽鍵、疊氮法、溴化氰法、烷基化法）交聯(lián)法（與結(jié)合法區(qū)別：有兩個(gè)功能基團(tuán)）（戊二醛是很重要的交聯(lián)劑，也是很重要的細(xì)胞固定化劑，有兩個(gè)交聯(lián)基醛基，兩個(gè)醛基都可以與酶或者蛋白質(zhì)的游離氨基反應(yīng)，形成希夫堿，而使酶或菌體蛋白交聯(lián)，制成固定化酶或固定化菌體。）（由于交聯(lián)反應(yīng)條件較為激烈，酶分子的多個(gè)基團(tuán)被交聯(lián)，致使酶活力損失較大）熱處理法。（2）細(xì)胞固定化的方法：吸附法；包埋法（動(dòng)物細(xì)胞吸附：微載體是指顆粒細(xì)小的固定化載體，

43、中空纖維由聚丙烯、硅化聚碳酸酯等高分子聚合物制成）。（3）原生質(zhì)體固定化方法：吸附和包埋（常用凝膠包埋法：瓊脂-多孔醋酸纖維素固定化法、海藻酸鈣凝膠固定化法、角叉菜膠固定化法、光交聯(lián)樹(shù)脂固定化法）。（固定化原生質(zhì)體可用于氨基酸的生產(chǎn)和胞內(nèi)酶的生產(chǎn)）2、 何謂固定化酶？固定化酶的特性與游離酶比較有哪些改變？答：固定化酶是指固定在一定載體上并在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行催化反應(yīng)的酶。固定化酶既保持了酶的催化特性，又克服了游離酶的不足之處，具有提高酶的催化效率、增加穩(wěn)定性、可反復(fù)或連續(xù)使用以及易于和反應(yīng)產(chǎn)物分開(kāi)等顯著優(yōu)點(diǎn)。固定化酶的特性：穩(wěn)定性：熱穩(wěn)定性提高；保存穩(wěn)定性提高、保存時(shí)間較長(zhǎng)；對(duì)蛋白酶的抵抗性

44、增強(qiáng)、不易被蛋白酶水解；對(duì)變性劑的耐受性提高。最適溫度：有些與游離酶差不多，有些變化較大。最適pH變化（因?yàn)橛行┗鶊F(tuán)消失）。底物特異性（其變化與底物分子質(zhì)量大小有關(guān)）。3、 固定化酶在工業(yè)上有何應(yīng)用？舉例說(shuō)明之。答：固定化酶的應(yīng)用：（1）在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用：氨基?；福黄咸烟钱悩?gòu)酶；天冬氨酸酶；青霉素?；福ㄓ糜谥圃旄鞣N半合成青霉素和頭孢菌素）延胡索酸酶；-半乳糖苷酶；天冬氨酸-脫羧酶；脂肪酶；植酸酶。（2）在酶?jìng)鞲衅鞣矫娴膽?yīng)用：酶電極。4、 何謂固定化細(xì)胞？固定化細(xì)胞有何特點(diǎn)和應(yīng)用？答：固定在載體上并在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行生命活動(dòng)的細(xì)胞稱為固定化細(xì)胞。通常只能用于胞外酶等胞外產(chǎn)物的生產(chǎn)。（1

45、）固定化微生物細(xì)胞：特點(diǎn)：保持了細(xì)胞的完整性和天然狀態(tài)，可以進(jìn)行正常的生長(zhǎng)繁殖；保持了細(xì)胞內(nèi)原有的酶系、輔酶體系和代謝調(diào)控體系，可以按原來(lái)的代謝途徑進(jìn)行新陳代謝，并進(jìn)行有效的代謝調(diào)節(jié)控制；發(fā)酵穩(wěn)定性好，可以反復(fù)或連續(xù)使用較長(zhǎng)時(shí)間；其密度的提高可以提高產(chǎn)率；由于有載體的保護(hù)作用，可以提高基因工程菌的質(zhì)粒穩(wěn)定性。應(yīng)用：利用固定化微生物生產(chǎn)各種產(chǎn)物：酒精酒類、氨基酸、有機(jī)酸、酶和輔酶、抗生素、甾體轉(zhuǎn)化、廢水處理、有機(jī)溶劑、維生素、化工產(chǎn)品生產(chǎn)；固定化微生物細(xì)胞制造微生物傳感器。（2）固定化植物細(xì)胞：特點(diǎn)：由于有載體的保護(hù)，可減輕剪切力和其他外界因素對(duì)植物細(xì)胞的影響，提高植物細(xì)胞的存活率和穩(wěn)定性；細(xì)胞

46、經(jīng)固定化之后，被束縛在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行生命活動(dòng)，不容易聚集成團(tuán)；固定化植物細(xì)胞發(fā)酵可以在不同的培養(yǎng)階段簡(jiǎn)便的更換不同的培養(yǎng)液，即首先生長(zhǎng)培養(yǎng)基中增殖，在達(dá)到一定的細(xì)胞密度之后，改換成發(fā)酵培養(yǎng)基，以利于生產(chǎn)各種所需的次級(jí)代謝產(chǎn)物；可反復(fù)或連續(xù)使用較長(zhǎng)一段時(shí)間，大大縮短生產(chǎn)周期，提高產(chǎn)率；易于與培養(yǎng)液分離，利于產(chǎn)品的分離純化，提高產(chǎn)品質(zhì)量。應(yīng)用：制造人工種子，生產(chǎn)各種色素、香精、藥物、酶等次級(jí)代謝產(chǎn)物（胞外產(chǎn)物）。（3）固定化動(dòng)物細(xì)胞：特點(diǎn)：提高細(xì)胞存活率；提高產(chǎn)率；可反復(fù)或連續(xù)使用；易于與產(chǎn)物分開(kāi)，利于產(chǎn)物分離純化，提高產(chǎn)品質(zhì)量。應(yīng)用：主要用于生產(chǎn)各種疫苗、各種激素、酶類、多肽藥物及各種組織

47、器官。5、 *酶的一些不足之處（酶固定化的原因）：酶的催化效率不夠高；酶的穩(wěn)定性較差；酶的一次性使用；產(chǎn)品的分離純化較困難。6、 *酶固定化的歷史：1953年的貨的格魯布霍費(fèi)和施萊思采用聚氨基苯乙烯樹(shù)脂為載體，經(jīng)重氮化法活化后，制成固定化酶；1969年，日本的千畑一郎首次在工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模應(yīng)用固定化氨基?；笍腄L-氨基酸連續(xù)生產(chǎn)L-氨基酸，實(shí)現(xiàn)了酶應(yīng)用史上的一大變革（第一次工業(yè)固定化酶）。7、 *在固定化酶的研究制備過(guò)程中，起初都是采用提取和分離純化后的酶進(jìn)行固定化，隨著技術(shù)的發(fā)展，也可以采用含酶菌體或菌體碎片進(jìn)行固定化。第7章 酶非水相催化1、 簡(jiǎn)述酶非水相催化的概念與特點(diǎn)。答：酶在非水介質(zhì)中

48、的催化作用稱為酶的非水相催化。酶的非水相催化是通過(guò)改變反應(yīng)介質(zhì)，影響酶的表面結(jié)構(gòu)和活性中心，從而改進(jìn)酶的催化特性。主要內(nèi)容包括有機(jī)介質(zhì)中的酶催化、氣相介質(zhì)中的酶催化、超臨界流體介質(zhì)中的酶催化和離子液介質(zhì)中的酶催化。2、 酶在有機(jī)介質(zhì)中與在水溶液中的特性有何改變？答：酶在有機(jī)介質(zhì)中起催化作用時(shí)，由于有機(jī)溶劑的極性與水有很大差別，對(duì)酶的表面結(jié)構(gòu)、活性中心的結(jié)合部位和底物性質(zhì)都會(huì)產(chǎn)生一定的影響。在以下方面表現(xiàn)出與水相介質(zhì)中不同的催化特性：底物專一性；對(duì)映體選擇性；區(qū)域選擇性（基因選擇性）；鍵選擇性；熱穩(wěn)定性；pH特性（通常接近或相同）。3、什么是必需水和水活度？水對(duì)非水相中酶的特性有何影響？ 答：水

49、對(duì)有機(jī)介質(zhì)中酶催化的影響：（1）水對(duì)酶分子空間構(gòu)象的影響：維持酶分子完整的空間構(gòu)象所必需的最低水量稱為必需水。必需水與酶分子的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)有密切關(guān)系，是維持酶分子結(jié)構(gòu)中氫鍵、鹽鍵等副鍵所必需的。（2）水對(duì)酶催化反應(yīng)速度的影響：在催化反應(yīng)速度達(dá)到最大時(shí)的水含量稱為最適水含量。（3）水活度：在有機(jī)介質(zhì)體系中，酶的催化活性會(huì)隨著結(jié)合水量的增加而提高。水活度（Aw）是指體系中水的逸度與純水逸度之比。通常可以用體系中水的蒸汽壓與相同條件下純水的蒸汽壓之比表示。采用水活度作為參數(shù)來(lái)研究有機(jī)介質(zhì)中水對(duì)酶催化作用的影響。4、有機(jī)溶劑對(duì)酶催化有何影響？答：有機(jī)溶劑對(duì)酶催化的影響：（1）有機(jī)溶劑對(duì)酶結(jié)構(gòu)與功能的影響

50、：在水溶液中酶分子均一的溶解于水中，可以較好的保持器完整的空間結(jié)構(gòu)，在有機(jī)溶液中，酶分子（修飾后可溶于有機(jī)溶劑的除外）不能直接溶解，懸浮在你溶劑中進(jìn)行催化反應(yīng)，包括有機(jī)溶劑對(duì)酶分子表面結(jié)構(gòu)的影響；有機(jī)溶劑對(duì)酶活性中心結(jié)合位點(diǎn)的影響。（降低結(jié)合能力）（2）有機(jī)溶劑對(duì)酶活性的影響：有些極性較強(qiáng)的有機(jī)溶劑會(huì)奪取酶分子的結(jié)合水，影響酶分子微環(huán)境的水化層，從而降低酶的催化活性，甚至引起酶的變性失活。（3）有機(jī)溶劑對(duì)底物和產(chǎn)物的影響：有機(jī)溶劑與水的極性不同，在反應(yīng)過(guò)程中會(huì)影響底物和產(chǎn)物的分配，從而影響酶的催化反應(yīng)。5、 如何控制有機(jī)介質(zhì)中酶催化反應(yīng)的條件？（有機(jī)介質(zhì)中酶催化反應(yīng)的條件及其控制）答：有機(jī)介質(zhì)

51、中酶催化反應(yīng)的類型：合成反應(yīng)、轉(zhuǎn)移反應(yīng)、醇解反應(yīng)、氨解反應(yīng)、異構(gòu)反應(yīng)、氧化還原反應(yīng)、裂合反應(yīng)酶的選擇：注意酶濃度、催化反應(yīng)速度大小、酶的穩(wěn)定性、底物專一性、對(duì)映體選擇性、區(qū)域選擇性、鍵選擇性底物的選擇和濃度控制有機(jī)溶劑的選擇水含量的控制溫度控制pH控制。6、 舉例說(shuō)明酶非水相催化的應(yīng)用。答：（1）手性藥物的拆分：環(huán)氧丙醇衍生物的拆分、芳基丙酸衍生物的拆分、苯甘氨酸甲酯的拆分。（2）手性高分子聚合物的制備：可生物降解的聚酯的合成、糖酯的合成。（3）酚樹(shù)脂的合成。（4）導(dǎo)電有機(jī)聚合物的合成。（5）發(fā)光有機(jī)聚合物的合成。（6）食品添加劑的生產(chǎn)：利用脂肪酶或酯酶的催化作用生產(chǎn)所需的酯類、利用芳香醛脫氫

52、酶生產(chǎn)香蘭素。（7）生物柴油的生產(chǎn)：生物柴油是由動(dòng)植物或微生物油脂與小分子醇類經(jīng)過(guò)酯交換反應(yīng)而得到的脂肪酸酯類物質(zhì)。可以采用酸、堿催化油脂與甲醇之間的轉(zhuǎn)脂反應(yīng)，而生成脂肪酸甲酯。（8）多肽的合成：胰蛋白酶催化的合成在水溶液中合成率為0.1%以下，在乙酸乙酯和微量水的系統(tǒng)中合成率可達(dá)100%。（9）甾體轉(zhuǎn)化。7、 *有機(jī)介質(zhì)反應(yīng)體系：微水介質(zhì)體系、與水溶性有機(jī)溶劑組成的均一體系、與水不溶性有機(jī)溶劑組成的兩相或多相體系、正膠束體系、反膠束體系。第8章 酶定向進(jìn)化1、 何謂酶定向進(jìn)化？有何特點(diǎn)？基本過(guò)程是什么？答：（1）酶分子定向進(jìn)化，是模擬自然進(jìn)化過(guò)程（隨機(jī)突變和自然選擇），在體外進(jìn)行酶基因的人工

53、隨機(jī)突變，建立突變基因文庫(kù)，在人工控制條件的特殊環(huán)境下，定向選擇得到具有優(yōu)良催化特性的酶的突變體的技術(shù)過(guò)程。（2）特點(diǎn)：適應(yīng)面廣、目的性強(qiáng)、效果顯著。（3）基本過(guò)程： 酶基因 隨機(jī)突變 構(gòu)建突變基因文庫(kù) 篩選 正突變基因 進(jìn)化酶負(fù)突變基因反復(fù)進(jìn)行2、 簡(jiǎn)述易錯(cuò)PCR技術(shù)進(jìn)行體外基因突變的主要過(guò)程。答：易錯(cuò)PCR是從酶的單一基因出發(fā)，在改變反應(yīng)條件的情況下進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，使擴(kuò)增得到的基因出現(xiàn)堿基配對(duì)錯(cuò)誤，從而引起基因突變的技術(shù)過(guò)程。PCR：雙鏈DNA的變性（解鏈）、引物與單鏈DNA退火結(jié)合、引物延伸。易錯(cuò)PCR在原有基礎(chǔ)上提高鎂離子的濃度、添加一定濃度的錳離子、改變4種底物的濃度比等反應(yīng)條件

54、，使DNA聚合酶在催化基因擴(kuò)增時(shí)，增加堿基配對(duì)錯(cuò)誤的出現(xiàn)頻率，而引起基因突變。易錯(cuò)PCR技術(shù)所引起的基因突變和遺傳進(jìn)化僅在單一分子內(nèi)發(fā)生，所以屬于無(wú)性進(jìn)化。3、 什么叫做DNA重排技術(shù)？其主要過(guò)程包括哪些步驟？答：DNA重排技術(shù)又稱為DNA改組技術(shù)，是從正突變基因文庫(kù)中分離得到的同源DNA，用酶切割成隨機(jī)片段，經(jīng)過(guò)不加引物的多次PCR循環(huán)，使DNA的堿基序列重新排布而引起基因突變的技術(shù)過(guò)程。DNA重排技術(shù)將存在于兩種或多種不同基因中的正突變結(jié)合到一起，通過(guò)DNA堿基序列的重新排布，形成新的突變基因，屬于有性進(jìn)化。包括交錯(cuò)延伸PCR技術(shù)、隨機(jī)引物體外重組技術(shù)。 兩條以上 DNA 突變 構(gòu)建突變

55、篩選 正突變基因 進(jìn)化酶正突變基因 酶切 隨機(jī)片段 無(wú)引物 基因 基因 基因文庫(kù) PCR 重組 負(fù)突變基因 酶切 反復(fù)進(jìn)行4、 什么是基因家族重排技術(shù)？它與DNA重排技術(shù)有何異同？答：基因家族重排技術(shù)又稱基因家族改組技術(shù)，是從基因家族的若干同源基因出發(fā)，用酶切割成隨機(jī)片段，經(jīng)過(guò)不加引物的多次PCR循環(huán)，使DNA的堿基序列發(fā)生重新排布而引起基因突變的技術(shù)過(guò)程。與DNA重排技術(shù)主要不同點(diǎn)在于前者從基因家族的若干同源基因出發(fā)進(jìn)行DNA序列的重新排布，后者則采用易錯(cuò)PCR等技術(shù)獲得兩個(gè)以上正突變基因出發(fā)進(jìn)行DNA序列的重新排布。5、 簡(jiǎn)述突變基因定向選擇的基本過(guò)程。目的基因篩選突變基因文庫(kù)基因載體基因

56、重組突變基因答：6、 突變基因的高通量篩選技術(shù)主要有哪些？各有什么特點(diǎn)？篩選方法特點(diǎn)平板篩選法通量大、效率高、簡(jiǎn)便快速直觀、容易控制和調(diào)整環(huán)境條件（依據(jù)透明圈情況進(jìn)行篩選）熒光篩選法通量大、效率高、直觀明確、容易判斷、需要克隆報(bào)告基因（可以將綠色熒光蛋白的基因作為報(bào)告基因）噬菌體表面展示法通量大、效率高、有效基因通過(guò)展示進(jìn)行富集、需要構(gòu)建外源基因與噬菌體外膜蛋白基因的融合基因酵母細(xì)胞表面展示法通量大、效率高、有效基因通過(guò)細(xì)胞表面展示進(jìn)行富集、需要構(gòu)建靶蛋白基因與外援蛋白基因的融合基因7、 舉例說(shuō)明酶定向進(jìn)化技術(shù)的應(yīng)用。答：（1）提高酶的催化效率；（2）增加酶的穩(wěn)定性；（3）改變酶的底物特異性。

57、（枯草桿菌蛋白酶E）8、 *酶定向進(jìn)化的基本過(guò)程包括隨機(jī)突變、構(gòu)建突變基因文庫(kù)、定向選擇（高通量篩選）等。9、 *酶基因的隨機(jī)突變：易錯(cuò)PCR技術(shù)、DNA重排技術(shù)、基因家族重排技術(shù)。10、 *突變基因文庫(kù)的構(gòu)建是將各種不同的突變基因與載體（質(zhì)粒）重組，再轉(zhuǎn)入適宜的細(xì)胞（大腸桿菌）或包裝成重組噬菌體的技術(shù)過(guò)程。（某一基因的所有突變型分別與相應(yīng)的載體結(jié)合，進(jìn)入到相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)或組裝成具有感染性的噬菌體，所有的細(xì)胞或噬菌體就是突變基因文庫(kù)。）（文庫(kù)的包容性和完整性）主要過(guò)程包括：載體的選擇、基因重組、形成基因文庫(kù)。第9章 酶反應(yīng)器1、試述酶反應(yīng)器的主要類型和特點(diǎn)。反應(yīng)器類型適用的操作方式適用的酶特點(diǎn)攪拌罐式反