標(biāo)記有絲分裂百分率法計(jì)算

1、細(xì)胞周期測(cè)定 -標(biāo)記有絲分裂百分率法標(biāo)記有絲分裂百分率法（percentage labeled mitoses，PLM）是一種常用的測(cè)定細(xì)胞周期時(shí)間的方法。其原理是對(duì)測(cè)定細(xì)胞進(jìn)行脈沖標(biāo)記、定時(shí)取材、利用放射自顯影技術(shù)顯示標(biāo)記細(xì)胞，通過統(tǒng)計(jì)標(biāo)記有絲分裂分裂期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)的辦法來(lái)測(cè)定細(xì)胞周期。細(xì)胞周期測(cè)定，首先待測(cè)定的細(xì)胞進(jìn)行同步化。在一般培養(yǎng)條件下，群體中的細(xì)胞處于不同的細(xì)胞周期時(shí)相之中，需采取一些方法使細(xì)胞處于細(xì)胞周期的同一時(shí)相，這就是細(xì)胞同步化技術(shù)。細(xì)胞人工同步化的方法有選擇同步化和誘導(dǎo)同步化，其中，選擇同步化常用的方法有有絲分裂選擇法和細(xì)胞沉降分離法；誘導(dǎo)同步化常用的方法有DNA合成阻斷法和

2、中期阻斷法。下面簡(jiǎn)單介紹有絲分裂選擇法與DNA合成阻斷法。選擇同步化主要是有絲分裂選擇法，該法利用M期細(xì)胞變圓易脫落的特點(diǎn)，將生長(zhǎng)旺盛的貼壁細(xì)胞按一定的時(shí)間間隔振蕩，使M期細(xì)胞脫落，逐步收集培養(yǎng)基，并補(bǔ)充新的培養(yǎng)基。收集的細(xì)胞放4冰箱中保存，離心沉淀后即獲得M期細(xì)胞。DNA合成阻斷法，選用DNA合成抑制劑可逆地抑制S期細(xì)胞DNA合成而不影響其他細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn)，最終可將細(xì)胞群體阻斷在G1/S期交界處；胸腺嘧啶核苷（TDR）雙阻斷法為最常用的方法：該法利用過量TDR能阻礙DNA合成的原理而設(shè)計(jì)，為了加強(qiáng)細(xì)胞同步化效果，常采用兩次TDR阻斷法，即雙阻斷法。第1次阻斷時(shí)間相當(dāng)于G2、M和G1期時(shí)間的總和

3、或稍長(zhǎng)，釋放時(shí)間不短于S期時(shí)間，而小于G2+M+G1期時(shí)間，這樣才能使所有位于G1/S期的細(xì)胞通過S期，而又不使沿周期前進(jìn)最快的細(xì)胞進(jìn)入下一個(gè)S期。第2次阻斷時(shí)間同第1次，再釋放。現(xiàn)以HeLa細(xì)胞為例加以說明（HeLa細(xì)胞周期時(shí)間為21 h，其中G1期為10 h，S期為7 h，G2期為3 h，M期為1 h）。首先將細(xì)胞培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期的早期，加入含2 mmol/L TDR的培養(yǎng)基（22.5 mmol/L用于腫瘤細(xì)胞的同步化培養(yǎng)），作用16 h。棄掉TDR培養(yǎng)基，用Hanks液洗23次，再換上新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)溫浴9 h。重新加入TDR培養(yǎng)基（濃度同上）進(jìn)行第2次阻斷，作用16 h。再棄掉TDR培養(yǎng)

4、基，Hanks液洗23次后換上普通培養(yǎng)基。第2次TDR釋放0 h時(shí)取樣則細(xì)胞處于G1/S期交界處；如27 h取樣則為不同階段的S期細(xì)胞。注意：具體TDR作用和釋放的時(shí)間應(yīng)參考每一種待同步化細(xì)胞的細(xì)胞周期各時(shí)相測(cè)定的參考值，也可根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定。標(biāo)記有絲分裂分裂期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)的辦法來(lái)測(cè)定細(xì)胞周期，首先取同步化了的不同階段的S期細(xì)胞，利用3H標(biāo)記的胸腺嘧啶脫氧核苷（TDR）短暫培養(yǎng)該種細(xì)胞一段時(shí)間后，處于S期的細(xì)胞都會(huì)被標(biāo)記。洗脫含放射性同位素的胸腺嘧啶脫氧核苷，再移至普通培養(yǎng)基中培養(yǎng)，換用無(wú)放射性的新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)，定期檢測(cè)。不同間隔時(shí)間取樣，找出正處于分裂期細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。TG1：G1期的持續(xù)時(shí)間TG2

5、：G2期的持續(xù)時(shí)間TS：S期的持續(xù)時(shí)間TM：M期的持續(xù)時(shí)間TC：一個(gè)細(xì)胞周期的持續(xù)時(shí)間PLM：標(biāo)記的有絲分裂分裂期細(xì)胞所占的比例測(cè)定原理：細(xì)胞周期各階段的時(shí)間與PLM的關(guān)系待測(cè)細(xì)胞經(jīng)3H-TDR標(biāo)記后，所有S期細(xì)胞均被標(biāo)記。S期細(xì)胞經(jīng)G2期才進(jìn)入M期，所以一段時(shí)間內(nèi)PLM=0。開始出現(xiàn)標(biāo)記M期細(xì)胞時(shí)，表示最早處于S期最后階段的細(xì)胞（即領(lǐng)先細(xì)胞），已渡過G2期，所以從PLM=0到出現(xiàn)PLM的時(shí)間間隔為TG2。S期細(xì)胞逐漸進(jìn)入M期，PLM上升，到達(dá)到最高點(diǎn)的時(shí)候說明來(lái)自處于S最后階段的細(xì)胞，已完成M，進(jìn)入G1期。所以從放射性開始出現(xiàn)M到PLM達(dá)到最高點(diǎn)（100%）的時(shí)間間隔就是TM。當(dāng)PLM開始下

6、降時(shí)，表明最晚處于S期最初階段的細(xì)胞（即落后細(xì)胞）也已進(jìn)入M期，所以放射性出現(xiàn)PLM到PLM又開始下降的一段時(shí)間等于TS。從PLM出現(xiàn)到下一次PLM出現(xiàn)的時(shí)間間隔就等于TC，根據(jù)TC=TG1+TS+TG2+TM即可求出的TG1長(zhǎng)度。事實(shí)上由于一個(gè)細(xì)胞群體中TC和各時(shí)相不盡相同，第一個(gè)峰常達(dá)不到100%，以后的峰會(huì)發(fā)生衰減，PLM不一定會(huì)下降到零，所以實(shí)際測(cè)量時(shí)，常以（TG2+1/2TM）-TG2的方式求出TM。例1：為測(cè)定某種細(xì)胞分裂的細(xì)胞周期，利用3H標(biāo)記的胸腺嘧啶脫氧核苷短暫培養(yǎng)該種細(xì)胞一段時(shí)間后，處于S期的細(xì)胞都會(huì)被標(biāo)記。洗脫含放射性同位素的胸腺嘧啶脫氧核苷，再移至普通培養(yǎng)基中培養(yǎng)，換用

7、無(wú)放射性的新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)，定期檢測(cè)。不同間隔時(shí)間取樣，找出正處于分裂期細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。A：處于S期的細(xì)胞都被3H標(biāo)記；B：被標(biāo)記細(xì)胞最早進(jìn)入分裂期；C：50%分裂期細(xì)胞被標(biāo)記且在增加；D：50%分裂期細(xì)胞被標(biāo)記且在減少；E：出現(xiàn)被標(biāo)記細(xì)胞第二次進(jìn)入分裂期。下列推測(cè)中，說法正確的是A實(shí)驗(yàn)開始時(shí)細(xì)胞核中被標(biāo)記的物質(zhì)是DNA，標(biāo)記的時(shí)期是M期BD點(diǎn)時(shí)標(biāo)記細(xì)胞比例減少，表明最慢的標(biāo)記細(xì)胞開始進(jìn)入G2期C該細(xì)胞的細(xì)胞周期中S期占3小時(shí)D分裂期經(jīng)歷時(shí)間約為1h【解析】用tG1、tS、tG2、tM表示各時(shí)期的時(shí)間，Tc表示細(xì)胞周期。根據(jù)題意可知，在體外采用短暫3H-TdR（胸苷）脈沖標(biāo)記，然后洗脫標(biāo)記物，其中

8、3H-TdR（胸苷）只存在于胸腺嘧啶這種堿基中，而胸腺嘧啶是DNA分子中特有的堿基，將用于DNA復(fù)制。因此一開始處于S期的細(xì)胞均被放射性標(biāo)記，如有處于G2、M、G1期的細(xì)胞均未被標(biāo)記，可推知標(biāo)記的時(shí)期是S期，A錯(cuò)誤；由細(xì)胞周期看，經(jīng)過相當(dāng)于G2期的一段時(shí)間，被標(biāo)記的細(xì)胞最早離開S期開始進(jìn)入M期，該時(shí)間為3小時(shí)，即G2=3小時(shí)，C錯(cuò)誤；S期和M期間隔G2期，因此當(dāng)M期細(xì)胞的50%被標(biāo)記首次出現(xiàn)時(shí)，相當(dāng)于經(jīng)歷的時(shí)間為tG2+1/2tM=3.5小時(shí)。當(dāng)D點(diǎn)時(shí)標(biāo)記的M期細(xì)胞減少到50%時(shí)且比例減少，表明最慢的標(biāo)記細(xì)胞進(jìn)入M期一半時(shí)間，B錯(cuò)誤；D點(diǎn)時(shí)標(biāo)記細(xì)胞比例減少，表明最慢的標(biāo)記細(xì)胞進(jìn)入M期中點(diǎn)，即表

9、示在S期最后一個(gè)完成復(fù)制的細(xì)胞到達(dá)M期的一半，該時(shí)間相當(dāng)于經(jīng)歷tS+tG2+1/2tM=10.5小時(shí)，當(dāng)標(biāo)記的細(xì)胞第二次出現(xiàn)在M期時(shí)，相當(dāng)于經(jīng)歷的時(shí)間為Tc+tG2=25小時(shí)，因此該細(xì)胞的一個(gè)細(xì)胞周期共耗時(shí)22小時(shí)，S期7小時(shí)，分裂期經(jīng)歷時(shí)間約為1h，D正確。例2：（浙江省第11屆高中生物學(xué)競(jìng)賽題）在某生物細(xì)胞培養(yǎng)液中加入用3H標(biāo)記的胸腺嘧啶脫氧核苷酸，短暫培養(yǎng)一段時(shí)間后，洗去3H標(biāo)記的胸腺嘧啶脫氧核苷酸。使在該段時(shí)間內(nèi)已處于DNA復(fù)制期不同階段的全部細(xì)胞中DNA被3H標(biāo)記，而當(dāng)時(shí)處于其他時(shí)期的細(xì)胞則不帶標(biāo)記。不同時(shí)間取樣做細(xì)胞放射性自顯影，找出正處于有絲分裂的分裂期（M期）細(xì)胞，計(jì)算其中帶3

10、H標(biāo)記的細(xì)胞占有絲分裂細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。得到下圖（圖1圖4中橫軸為時(shí)間，縱軸為帶標(biāo)記細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分?jǐn)?shù)）：（1）圖1中a點(diǎn)開始檢測(cè)到帶3H標(biāo)記分裂期細(xì)胞，則oa為期，理由是：。（2）圖2中b點(diǎn)帶3H標(biāo)記分裂期細(xì)胞數(shù)開始達(dá)到最大值，則ab段表示期，理由是：。（3）圖3中c點(diǎn)時(shí)，帶標(biāo)記的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)開始下降，則ac段所經(jīng)歷的時(shí)間相當(dāng)于期的時(shí)間。（4）此后，帶標(biāo)記的分裂期細(xì)胞數(shù)逐漸減少，直到消失，到第二次出現(xiàn)帶有標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)時(shí)為圖中e點(diǎn)，則de段所經(jīng)歷的時(shí)間相當(dāng)于時(shí)期的時(shí)間，因此一個(gè)完整的細(xì)胞周期的時(shí)間相當(dāng)于段經(jīng)歷的時(shí)間。答案：(1)G2原處于DNA復(fù)制期最后階段的細(xì)胞，最先進(jìn)入分裂期最先出現(xiàn)放射性標(biāo)

11、記，因此，從實(shí)驗(yàn)開始到分裂期細(xì)胞開始出現(xiàn)放射性物質(zhì)之間的時(shí)間段恰好是G2期的長(zhǎng)短。(2)分裂期a點(diǎn)后，原處于DNA復(fù)制期最后階段的細(xì)胞完成有絲分裂（a點(diǎn)后，原處于DNA復(fù)制期其它階段的細(xì)胞陸續(xù)進(jìn)入分裂期，標(biāo)記細(xì)胞數(shù)逐漸上升，達(dá)到最高點(diǎn)時(shí)，說明原處于DNA復(fù)制期最后階段的細(xì)胞已完成有絲分裂，開始進(jìn)入下一細(xì)胞周期的G1期）（3）S（或DNA復(fù)制）（4）G1期和G2期ae【解析】一個(gè)完整的細(xì)胞周期包括間期和分裂期（M期），間期又可劃分為G1期（主要進(jìn)行RNA和有關(guān)蛋白質(zhì)的合成）、S期（進(jìn)行DNA分子復(fù)制）和G2期（繼續(xù)合成少量的蛋白質(zhì)和RNA）。使處于DNA復(fù)制期不同階段的全部細(xì)胞的DNA被3H標(biāo)記

12、，而處于其他時(shí)期的細(xì)胞則不帶標(biāo)記。然后找出正處于有絲分裂的分裂期細(xì)胞并計(jì)時(shí)。a點(diǎn)，首次出現(xiàn)放射性標(biāo)記，之前這段時(shí)間為G2期。理由：處于DNA復(fù)制最早完成最后階段的細(xì)胞最先進(jìn)入分裂期，從而出現(xiàn)帶標(biāo)記的M期細(xì)胞，此細(xì)胞經(jīng)過的時(shí)間為G2（oa）。a點(diǎn)后，至b點(diǎn)，從最先開始出現(xiàn)放射性標(biāo)記（0%）到放射性標(biāo)記達(dá)到最高峰（100%），這段時(shí)間為M期。理由：后續(xù)的部分細(xì)胞相繼進(jìn)入了分裂期，到原處于DNA復(fù)制期最晚完成最后階段的細(xì)胞完成有絲分裂時(shí)，分裂期各時(shí)刻都有了細(xì)胞，故放射性標(biāo)記開始達(dá)到最高峰（100%）。此細(xì)胞經(jīng)過的時(shí)間為G2+M（ob）,故ab=ob-oa=G2+M-G2=M。b到c，放射性標(biāo)記持續(xù)為

13、最高峰（100%），ac段時(shí)間為S期。理由：放射性標(biāo)記開始達(dá)到最高峰（100%）時(shí)，還有部分后續(xù)的細(xì)胞沒有進(jìn)入分裂期，故100%的最高峰可以持續(xù)一段時(shí)間。當(dāng)原處于DNA復(fù)制最晚的最先時(shí)期的細(xì)胞開始進(jìn)入分裂期時(shí)，最高峰結(jié)束，此細(xì)胞經(jīng)過的時(shí)間為S+G2（oc），故ac=oc-oa=S+G2-G2=S。c到d,即放射性標(biāo)記由最高峰（100%）逐漸減少，直至為0。此時(shí)，原處于DNA復(fù)制最先時(shí)期的細(xì)胞完成有絲分裂，不再有本周期的細(xì)胞帶標(biāo)記。此細(xì)胞經(jīng)過的時(shí)間為S+G2+M（od），cd=od-oc=（SG2M）（SG2）M。到e點(diǎn)時(shí)，第二周期的細(xì)胞開始出現(xiàn)標(biāo)記，即原處于DNA復(fù)制期最早完成最后階段的細(xì)胞再

14、次進(jìn)入分裂期，經(jīng)歷的時(shí)間為一個(gè)細(xì)胞周期（一個(gè)周期的分裂開始到下一周期的分裂開始，即分裂開始到分裂開始，總時(shí)間與一個(gè)完整周期(即一次分裂結(jié)束到下一次分裂結(jié)束）相同），即ae。也可運(yùn)算：oe=G2+M+G1+S+G2，而oa=G2，故ae=oe-oa=（G2+M+G1+S+G2）-G2=G1+G2+S+Mde=ae-ad=G1+G2+S+M-(S+M)=G1+G2例3：不同細(xì)胞的細(xì)胞周期長(zhǎng)短不一。利用3H標(biāo)記的胸腺嘧啶脫氧核苷酸培養(yǎng)某種細(xì)胞一段時(shí)間后再移至普通培養(yǎng)基中培養(yǎng)，不同間隔時(shí)間取樣，進(jìn)行放射顯影，在顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)標(biāo)記細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。A：細(xì)胞核開始被標(biāo)記；B：一個(gè)被標(biāo)記細(xì)胞X開始進(jìn)入分裂期；C：細(xì)胞X著絲粒開始分裂；D：細(xì)胞X分裂成兩個(gè)子細(xì)胞，被標(biāo)記細(xì)胞數(shù)目在增加；E：標(biāo)記細(xì)胞第二次進(jìn)入分裂期；F：被標(biāo)記細(xì)胞的比例在減少；G：被標(biāo)記細(xì)胞的數(shù)目在減少。試回答：（1）該細(xì)胞分裂一次平均經(jīng)歷的時(shí)間為h。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)細(xì)胞核中被標(biāo)記的物質(zhì)是，圖中期、期（用圖中字母表示）DNA分子穩(wěn)定性最低，適于進(jìn)行誘發(fā)突變。（2）被標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)目減少的原因是。（3）圖乙分裂狀態(tài)位于圖甲的（用圖中字母表示）期的前段，細(xì)胞內(nèi)含有個(gè)染色體組。（4）皮膚癌細(xì)胞的細(xì)胞周期（填“大于”、“小于”