甘草中甘草苷含量測定

1、長沙醫(yī)學院畢業(yè)設計(論文)課 題 名 稱 HPLC法測定參苓散中甘草苷的含量 學 生 姓 名 姜聲正 學 號 系、年級專業(yè) 07級本科藥學 指 導 教 師 肖海英 職 稱 講師 2011年 6 月 9 日誠信聲明本文鄭重聲明：所呈交的學位論文，是本人在指導老師的指導下，獨立進行研究所取得的成果，成果不存在知識產(chǎn)權(quán)爭議。除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不包含其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的科研成果。對本文的研究作出重要貢獻的個人和集體，均已在文中以明確方式標明。本人完全意識到本聲明的法律責任由本人承擔。作者簽名：日 期： 年 月 日高效液相色譜法測定參苓散中甘草苷含量姜聲正長沙醫(yī)學院藥學系07

2、級藥學本科摘要目的：用HPLC法測定參苓散中甘草苷的含量。 方法：分別采用Diamosil C18 (4.6mm×250mm×5m)和Agilent TC-C18( 250mm ×4.6 mm×5µm），乙腈0.5冰醋酸（1090）為流動相，流速為1.0 ml/min，檢測波長為276nm，柱溫為35，結(jié)果：平均回收率為101.6%，RSD為1.9%， R=0.9998。 結(jié)論：本方法可作為參苓散中甘草苷含量質(zhì)量控制的一種有效方法。關(guān)鍵詞：參苓散；甘草苷；高效液相色譜法；含量測定Determination of Liquiritin in Sh

3、enling Powder by HPLCJiang ShengzhengGrade 2007，Parmacy Department of Changsha Medical CollegeAbstract Objective: Determination of liquiritin in Shenling powder by High Performance Liquid Chromatography. Methods: Based on using respectively Diamosil C18 (4.6mm×250mm×5m)， Agilent TC-C18( 25

4、0mm ×4.6 mm×5m），acetonitrile0.5 and glacial acetic acid（10：90）for moving phase at the flow velocity of 1.0 ml/min， the method is to determine if the wavelength is 276 nm and that column temperature is 35. Results: Average recovery rate ：101.6% RSD: 1.9% R=0.9998。Conclusion: This method is

5、an effective way to qualitatively control the content of liquiritin in Shenling powderKey words: Shenling powder ；Liquiritin；HPLC；Assaying目 錄摘要IAbstract前言11 實驗材料21.1儀器21.2 試藥22 方法與結(jié)果32.1 色譜條件32.2 對照品溶液的制備32.3 測定波長的確定32.4流動相的選擇42.5 線性關(guān)系考察62.6 檢測限62.7 定量限72.8供試品溶液的制備72.9 陰性對照溶液測定102.10精密度試驗112.11穩(wěn)定性試驗

6、122.12重復性試驗122.13 回收率試驗132.14樣品含量測定133討論153.1 流動相的選擇153.2 提取方法的選擇153.3 測定波長的選擇15參考文獻16綜述17致謝28前言參苓散為湘潭飛鴿藥業(yè)有限公司獨家品種，收載于衛(wèi)生部藥品標準中藥成方制劑第八冊。參苓散的主要成分是：人參、茯苓、甘草、白術(shù)、黨參等。因文獻報道甘草苷1-4對大白鼠幽門結(jié)扎形成的潰瘍有抑制作用，顯示甘草苷成分與本品功能與主治“補氣健脾，和胃滲濕”密切關(guān)聯(lián)，故選擇以“甘草苷”作為測定指標?，F(xiàn)為提高的該藥品的質(zhì)量標準，加入了用高效液相色譜法測定藥物中甘草苷的含量。 張崇禧等5用HPLC分析甘草中甘草酸和甘草苷含量

7、，并提出甘草苷在0.40.6g范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，r=0.9998，平均回收率(n=3)為 100.50，RSD =0.22。高玉峰等6用RPHPLC法測定了沙參止咳湯散中甘草苷含量，并提出采用 Shimpack VPODS(46mm×150mm，5m) 色譜柱，流動相為乙腈一05冰醋酸溶液(20：80)為流動相；流速 1.0mlmin-1，檢測波長276nm，柱溫為30。結(jié)果：甘草苷進樣量在0.021.0 g范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，r=0.9999，平均加樣回收率為96.75，RSD=1.08(n =6)。伍尉萍等7用HPLC法測定甘草中甘草苷的含量。本實驗用HPLC法測

8、定參苓散中甘草苷的含量。1 實驗材料1.1儀器儀器 Agilent 1100 高效液相色譜儀。檢測器VWD色譜柱 Diamosil C18 (4.6mm×250mm×5m)柱溫 35色譜工作站 LC系統(tǒng)化學工作站1.2 試藥參苓散（批號：081125），甘草苷（中國藥品生物制品檢定所提供，供含量測定用，批號：11610-200604）。乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。2 方法與結(jié)果2.1 色譜條件色譜柱Diamosil C18 (4.6mm×250mm×5m)，流動相：乙腈0.5冰醋酸（10：90）；流速：10 mlmin，檢測波長：276 nm，柱溫

9、：35 。2.2 對照品溶液的制備 精密稱取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥12小時的甘草苷對照品18.54mg，置20ml量瓶中，加入甲醇適量，振搖使溶解，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為儲備液。精密量取儲備液1ml，置25ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液（37.08µg/ml）。精密量取儲備液5ml，置100ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液（46.35µg/ml）。精密量取儲備液1ml，置50ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取1ml，置200ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液（0.0927µg/ml）。精密稱取經(jīng)五

10、氧化二磷減壓干燥12小時的甘草苷對照品8.19mg，置25ml量瓶中，加入甲醇適量，振搖使溶解，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取5ml，置100ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液（16.38µg/ml）。精密稱取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥12小時的甘草苷對照品11.62mg，置25ml量瓶中，加入甲醇適量，振搖使溶解，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取5ml， 10ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液（232.4µg/ml）。2.3 測定波長的確定 取上述對照品溶液，照紫外分光光度法，在200400nm范圍內(nèi)掃描（儀器：UV-2401PC Slit:1

11、.0；快速掃描），結(jié)果在275.8nm和218nm波長處有最大吸收，因考慮218nm為末端吸收，故選擇276nm作為檢測波長，見圖2.1。圖2.1甘草苷對照品溶液紫外光譜2.4流動相的選擇 甲醇0.1磷酸(30：70）。甲醇0.5冰醋酸（30：70）。乙腈0.5冰醋酸（10：90）。| 分別采用上述三種流動相，精密吸取對照品溶液10µl，注入液相色譜儀，測定。其色譜峰結(jié)果見表2.1，其圖見圖2.2、2.3、2.4。 觀察色譜峰峰形，以流動相的色譜峰對稱性較好，且理論踏板數(shù)明顯高于前兩種流動相，故選擇流動相。表2.1 流動相比較表流動相編號峰面積積分值理論板數(shù)拖尾因子907.44672

12、34420.62901.6517335590.63890.9583759910.96成分：甘草苷保留時間：32.1分鐘理論板數(shù)：3442拖尾因子：0.62圖2.2 流動相 對照品色譜圖成分：甘草苷保留時間：35.0分鐘理論板數(shù)：3559拖尾因子：0.63圖2.3 流動相 對照品色譜圖成分：甘草苷保留時間：24.5分鐘理論板數(shù)：5991拖尾因子：0.96圖2.4 流動相 對照品色譜圖2.5 線性關(guān)系考察 精密吸取對照品溶液（37.08µg/ml）1、2、4、6、8、10l， 注入液相色譜儀，測定，以峰面積積分值為縱坐標，進樣量（ng）為橫坐標，繪制標準曲線。其回歸方程為：Y=1.942

13、9X-1.7405 R=0.9998。結(jié)果表明：甘草苷對照品在37.08370.8ng范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，結(jié)果見圖2.5、表2.2。圖2.5 甘草苷標準曲線圖表2.2 線性關(guān)系試驗結(jié)果表進樣量（ng）峰面積積分值37.0868.0649074.16146.80750148.32280.99387222.48434.69821296.64574.72278370.8717.565612.6 檢測限 精密吸取對照品溶液（0.0927µg/ml）4l，注入液相色譜儀，測定，信噪比為2.3，故檢測限為0.3708ng（圖2.6）。圖2.6 檢測限2.7 定量限 精密吸取對照品溶液（0.092

14、7µg/ml）20l， 注入液相色譜儀，測定，信噪比約為10，故檢測限為1.854ng。2.8供試品溶液的制備取本品（批號：081125）10袋內(nèi)容物，混勻，備用。儀器與試藥儀器：Agilent 1200 高效液相色譜儀檢測器：VWD色譜柱：Agilent TC-C18( 250mm ×4.6 mm×5µm）流動相：乙腈0.5冰醋酸（1090）其余色譜條件同前。 提取溶劑的選擇取上述粉末五份，每份約5g，各精密稱定，分置具塞錐形瓶中，依次精密加入水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、無水乙醇25ml，稱定重量，密塞，超聲處理（300W，25kHz）30

15、分鐘（時時振搖），放冷，稱重，分別用各溶劑補足減失的重量，搖勻，離心（8000轉(zhuǎn)/分鐘，15分鐘），取上清液，即得。測定法 精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10µl，注入液相色譜儀，測定并計算，結(jié)果見表2.3。表2.3 提取溶劑選擇結(jié)果比較表編號取樣量（g）提取溶劑峰面積積分值峰面積積分值平均值含量（mg/g）4.9790水170.13638169.376250.0411168.616125.120830乙醇299.80957299.743780.0707299.677985.055750乙醇364.58862364.235960.0870363.88335.065670乙醇327.

16、71307328.850690.0784329.988315.0145無水乙醇37.0644536.772210.008836.47997結(jié)果表明，用上述溶劑提取供試品，以50乙醇測得含量結(jié)果最高，因此選擇以50乙醇為提取溶劑。提取時間的考察 取上述粉末四份，每份約5g，各精密稱定，分置具塞錐形瓶中，精密加入50乙醇25ml，密塞，稱定重量，分別超聲處理（300W，25kHz）15分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘（時時振搖），放冷，用50乙醇補足減失的重量，搖勻，離心（8000轉(zhuǎn)/分鐘，15分鐘），取上清液，即得。測定法：密吸取對照品溶液與供試品溶液各10µl，注入液相色譜儀，測定

17、，并計算，結(jié)果見表2.4。表2.4 提取時間選擇結(jié)果比較表編號取樣量（g）提取時間峰面積積分值峰面積積分值平均值含量（mg/g）5.009915分鐘349.19781347.752140.0838346.306465.099230分鐘353.75717354.744650.0840355.732125.055745分鐘364.58862364.235960.0870363.88335.016860分鐘361.6655363.037770.0874364.41003結(jié)果表明，15分鐘和30分鐘所得的提取得率稍低，45分鐘和60分鐘所得的提取得率相近，因此提取時間選擇為45分鐘。2.8.4提取方法

18、選擇 取上述粉末5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50乙醇25ml，密塞，稱定重量，超聲處理（300W，25kHz）45分鐘（時時振搖），放冷，用50乙醇補足減失的重量，搖勻，離心（8000轉(zhuǎn)/分鐘，15分鐘），取上清液，即得。表2.5 提取方法選擇結(jié)果比較表編號取樣量（g）提取方法峰面積積分值峰面積積分值平均值含量（mg/g）5.0557超聲處理45分鐘364.58862364.235960.0870363.883305.0853回流提取45分鐘331.59070332.25620.0789332.92169取上述粉末5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50乙醇25ml，密塞，稱定

19、重量，回流提取45分鐘，放冷，用50乙醇補足減失的重量，搖勻，離心（8000轉(zhuǎn)/分鐘，15分鐘），取上清液，即得。測定法 精密吸取對照品溶液及各供試品溶液各10µl，注入液相色譜儀，測定并計算，結(jié)果見表2.5。結(jié)果表明，超聲提取方法測得含量結(jié)果較高，故選擇超聲處理為提取方法。綜合上述三個方面的考察結(jié)果，確定供試品溶液制備方法為：取本品裝量差異下的內(nèi)容物混勻，取約5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇25ml，密塞，稱定重量，超聲處理（300W，25kHz）45分鐘（時時振搖），放冷，用50乙醇補足減失的重量，搖勻，離心（8000轉(zhuǎn)/分鐘，15分鐘），取上清液，即得。2.9

20、 陰性對照溶液測定 按處方稱取除甘草外的其余各藥材，制成缺甘草的陰性對照樣品，同法制成缺甘草的陰性對照溶液，依法測定。圖2.7 陰性對照溶液色譜圖成分：甘草苷保留時間：26.0分鐘理論板數(shù)：5578拖尾因子：0.83圖2.8 樣品溶液色譜圖成分：甘草苷保留時間：25.8分鐘理論板數(shù)：5283拖尾因子：0.91成分：甘草苷保留時間：43.8分鐘理論板數(shù)：5983拖尾因子：0.83圖2.9 對照溶液色譜圖結(jié)果：陰性對照溶液的色譜圖中，在與甘草苷對照品色譜峰的相同保留時間處無色譜峰，說明陰性樣品無干擾（圖2.7、2.8、2.9）。2.10精密度試驗 精密吸取同一供試品溶液，進樣6次，每次10l，依法

21、測定，其甘草苷峰面積積分值的RSD為1.3，結(jié)果表明儀器精密度良好，見表2.7。表2.7精密度試驗結(jié)果表編號峰面積積分值平均RSD(%)1349.70570355.007431.32356.845583349.457064357.296055361.344856355.395362.11穩(wěn)定性試驗取同一供試品溶液，分別于配制后的0、1、2、4、6、8、10、12小時，精密吸取10l，注入液相色譜儀，測定，結(jié)果見表2.8。結(jié)果表明：供試品溶液在配制后12小時內(nèi)穩(wěn)定。表2.8 穩(wěn)定性試驗結(jié)果表時間（h）峰面積積分值平均峰面積RSD(%)0349.70570355.40667131.21356.84

22、5582349.457064357.296056361.344858355.3953610358.2765512354.932222.12重復性試驗 表2.9 重復性試驗結(jié)果編號取樣量（g）峰面積積分值峰面積積分值平均值測定結(jié)果（mg/g）平均值（mg/g）RSD(%)5.0140349.70157348.178740.08380.08551.5346.655915.0095351.94305350.850540.0846349.758035.0252352.46164353.784700.0850355.107765.0260360.98734359.202500.0863357.41766

23、5.0102361.72195361.363250.0871361.004555.0385360.21237361.022840.0865361.83331取同一批號（0704016）樣品6份，依法制備供試品溶液并測定，結(jié)果見表2.9。結(jié)果表明：本方法重復性較好。2.13 回收率試驗 取已測定含量的同一批號（081125）樣品粉末（含甘草苷0.086mg/g）約2.7g，精密稱定，分別置6個具塞錐形瓶中，各精密加入對照品溶液（232.4µg/ml）1ml，回收溶劑至干，放冷，依法制備供試品溶液，測定并計算。結(jié)果見表2.10。結(jié)果表明：本方法加樣回收率較好。表2.10 回收率試驗結(jié)果表

24、編號取樣量（g）樣品中甘草苷含量（mg）添加甘草苷量（mg）實測甘草苷量（mg）回收率（%）平均回收率(%)RSD(%)12.73990.23560.23240.465999.0101.61.922.79810.23780.4783103.432.75210.23390.4738103.242.75480.23690.4750102.452.77870.23890.4772102.562.75210.23660.467799.42.14樣品含量測定 對湘潭飛鴿藥業(yè)有限公司提供的樣品（081125、0704016、0704026、0704036）進行含量測定，結(jié)果見表2.11。該品種因市場原因，

25、生產(chǎn)單位很少生產(chǎn)，上述四批樣品為生產(chǎn)單位為提高行動計劃研究工作生產(chǎn)。以上四批樣品甘草苷平均結(jié)果為0.032mg/g，按平均結(jié)果約75計算，暫定本品每1g含甘草以甘草苷（C21H22O9）計，不得少于0.025mg。 按中國藥典2005年版一部“甘草”項下限度規(guī)定，計算理論轉(zhuǎn)移率為11.2。表2.11 參苓散中甘草苷含量測定結(jié)果批號取樣量（g）峰面積積分值峰面積積分值平均值測定結(jié)果（mg/g）測定結(jié)果平均值（mg/g）0811255.0140349.70157348.178740.0830.083346.655915.0095351.94305350.850540.084349.75803070

26、40165.016864.5158664.9920550.0150.01565.468250.0155.038166.1172666.425400.01566.733540.01507040264.975566.5174966.5064150.0160.01666.495340.0165.030366.3602967.1679250.01667.975560.01607040364.973167.4366168.056130.0160.01668.675650.0165.002269.0873468.952720.01668.818100.0163討論3.1 流動相的選擇流動相分別試驗了甲醇0

27、.1磷酸(3070），甲醇0.5冰醋酸（3070），乙腈0.5冰醋酸（1090）.經(jīng)試驗采用乙腈一0.5molL冰醋酸(10:90)系統(tǒng)時，甘草苷能夠與其他成分有效分離，且峰型較好。3.2 提取方法的選擇取上述粉末四份，每份約5g，各精密稱定，分置具塞錐形瓶中，精密加入50乙醇25ml，密塞，稱定重量，分別超聲處理（300W，25kHz）15分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘（時時振搖），放冷，用50乙醇補足減失的重量，搖勻，離心（8000轉(zhuǎn)/分鐘，15分鐘），取上清液。結(jié)果表明，15分鐘和30分鐘所得的提取得率稍低，45分鐘和60分鐘所得的提取得率相近，因此提取時間選擇為45分鐘。3.3 測

28、定波長的選擇 取甘草苷對照品溶液，照紫外分光光度法，在200400nm范圍內(nèi)掃描（儀器：UV-2401PC Slit:1.0；快速掃描），結(jié)果在275.8nm和218nm波長處有最大吸收，因考慮218nm為末端吸收，故選擇276nm作為檢測。該方法以乙腈0.5molL冰醋酸(10:90)為流動相，采用超聲提取的方法測定甘草中甘草苷的含量，實驗簡單、精密度高，結(jié)果準確可靠，可作為參苓散中甘草苷含量質(zhì)量控制的一種有效方法。參考文獻1 中國藥典一部M2005：592 彭勵，胡正海甘草生物學及化學成分的研究進展J中草藥，2009， 36(11)：174417473 Zhang J，Yao J，Yang

29、YL。Analysis and Mensurate Contents of Alkaloid in liquoriceJAeta Bot Boreal Oecidant Sin，2001，21(5)：12591262 4植物藥有效成分手冊M 人民衛(wèi)生出版社，1986年第一版：6735張崇禧，楊春花，蔡恩博.HPLC分析甘草中甘草酸和甘草苷含量，中國中藥雜志。2008，28(7)：5935976高玉峰，巴圖德力根，青玉. RPHPLC法測定沙參止咳湯散中甘草苷含量，中國中醫(yī)藥科技，2010，5（17）：232-2337 伍尉萍，閻宏濤，孫文基.HPLC法測定甘草中甘草苷的含量J.藥物分析雜志，2

30、004，24（4）：425綜述國內(nèi)甘草苷測定方法研究進展摘要綜述了近年來國內(nèi)甘草苷測定方法研究概況，系統(tǒng)介紹了目前國內(nèi)常用的甘草苷含量測定方法:高效液相色普法、反相高效液相色譜法、薄層掃描法等，并預測了甘草苷測定方法未來的發(fā)展趨勢。關(guān)鍵詞甘草苷；含量測定；方法；綜述甘草為豆科甘草屬植物，其根莖是常用的中草藥和經(jīng)濟植物1 ，素有“國老”之稱。甘草具有補脾益氣、清熱解毒、潤肺止咳、緩急止痛、調(diào)和諸藥的作用。現(xiàn)代藥理研究證明，甘草具有抗炎、抗變態(tài)反應、抗?jié)儭⒖笻IV、誘生干擾素、調(diào)節(jié)細胞免疫功能、抗癌等作用2 。甘草苷作為甘草中的主要有效成分，在醫(yī)藥、食品、化妝品、卷煙等行業(yè)有著極其廣泛的應用3

31、。甘草及其產(chǎn)品中常以甘草苷作為定量指標，用于評價藥材、成藥的質(zhì)量，制劑穩(wěn)定性的優(yōu)劣，制訂藥品質(zhì)量標準等4 。甘草配方品種繁多，成分多樣，而且含量變化不一，即使同一配方的藥物，因產(chǎn)地、栽培方法、生長環(huán)境和采收季節(jié)的不同，其成分及含量相差很大。甘草有效成分的分析測定是一項復雜而艱巨的工作。因此，見諸于文獻的甘草苷含量定量分析方法有很多，主要有:原子吸收法、一次展開二維薄層色譜電泳法、小波變換二次微分示波計時電位法、薄層紫外分光光度法、雙波長薄層掃描法、薄層層析法、離子抑制色譜法、重量法、RP- HPLC 法、比色法、極譜催化波法、高效液相色譜氣相、色譜法等。近幾年來，高效毛細管電泳法、高效液相色譜

32、法和RP - HPLC 法應用比較廣泛，尤其是應用高效液相色譜法定量分析甘草苷含量發(fā)展迅速。1高效液相色譜法20 世紀60 年代， 在Horvath Lipsky ， Kirland 和Huber 等人研制出高效液相色譜(HPLC) 儀后，由于HPLC 和其它分離方法相比具有柱效高、靈敏度高、分離速度快、適用范圍廣、重復性好和操作方便等優(yōu)點，很快就在中草藥化學研究中得到了廣泛的應用，隨著HPLC 方法的發(fā)展和完善，現(xiàn)在已成為中草藥化學中不可缺少的主要分離方法之一5 。在甘草苷測定過程中，應用最廣泛的是分析型HPLC。藍煜6采用高效液相色譜法測定獨活寄生丸中甘草苷含量的結(jié)果表明，方法準確，快速，

33、可靠。儀器為島津LC - 6A 高效液相色譜儀;SPD - 6AV 紫外檢測器;色譜條件: Inertsil ODS - 2(5 mm，4. 6 ×250 mm) ;流動相:水乙腈(8515) ; 檢測波長230 nm; 流速0. 8 mL/min ;柱溫30 。范呂林7采用高效液相色譜法測定復方甘草合劑中甘草苷的含量，結(jié)果較為滿意。研究時應用美國Waters 公司高效液相色譜系統(tǒng)，色譜條件:色譜柱Nova - PakC18 (4m，3. 9 ×150 mm) ;流動相為水乙腈醋酸(63372) ;檢測波長254 nm;流速1. 0 mL/ min ;柱溫30 。梁月琴等8

34、用高效液相色譜法測定甘草及其制劑中甘草苷含量，發(fā)現(xiàn)此法提取簡單，測定迅速，精密度較好。使用設備為美國Perkin- Elmer 液相色譜儀，LC - 235C 紫外檢測器，1022 LC數(shù)據(jù)處理儀，Waters 不銹鋼色譜柱NOVA PAKTMC18 (5m) 3. 9 mm×150 mm，流動相為甲醇0. 066 mol/ L 乙醇溶液(65 :35) ，流速1 mL/ min ，檢測波長155 nm。張和平等9建立了一種簡便、快速測定血液中微量甘草苷含量的HPLC 法，該方法利用的是Beckman 高效液相色譜系統(tǒng)，色譜條件:流動相為甲醇水乙腈冰乙酸(6023161) ，流速1

35、mL/ min ，紫外檢測波長252 nm，量程0. 2 AUFS。色譜柱:ODSC18柱(250mm×4. 6 mm) 。張繼等10通過HPLC 法對刺果甘草進行的甘草苷定量分析，為甘草的質(zhì)量評價提供了依據(jù)(美國Varian 公司5000 型高效液相色譜儀，美國Varian 公司CDS401 型數(shù)據(jù)處理機，Pak SPMCH- 5 ，4.0 mm×150 mm 不銹鋼色譜柱，流動相為70 %甲醇:30 %水:0. 5 %冰乙酸。機溫30 ，流速1. 0 mL/ min ，紫外檢測器波長254 nm) 。宋洪杰等11采用高效液相色譜法測定胃脘舒沖劑中甘草苷的含量，以對羥基苯

36、甲酸丁酯為內(nèi)標物，甲醇水36 %醋酸(652 87) 為流動相，Shimpack CLC ODS 柱(60 mm×150 mm) ，流速10 mL/ min ，檢測波長254 nm。曹愛蘭等12建立了高效液相色譜測定方法，測定了54 份樣品。儀器為日立638 - 50 型高效液相色譜儀，635M多波段紫外檢測器，色譜柱PRC184. 6 mm×220 mm，10m，流動相為甲醇水36 %醋酸(71281) ，流速1 mL/ min ，檢測波長250 nm。王榮等13運用高效液相色譜法系統(tǒng)地對7 種不同劑型的甘草復方制劑中甘草苷的含量進行測定 以Zorbax - ODS (4

37、. 6 mm ×25 cm) 為固定相，流動相為乙腈1 mL/ L 乙酸(3362) ，紫外檢測波長為238 nm ，實驗表明，運用HPLC 對甘草復方制劑中的甘草苷進行質(zhì)量控制的結(jié)果是可信的，令人滿意。米慕真等14以HPLC 外標工作曲線法，選擇ODS色譜柱，甲醇四氫呋喃1 %醋酸(37. 217. 944. 9)為流動相，對甘草的6 個品種的24 個樣品進行了含量測定，結(jié)果表明，不同品種、不同產(chǎn)地的甘草中甘草苷含量差異較大。崔鉉玖等15采用韓國盈仁科學儀器公司高效液相色譜儀色譜柱- Bondapack C18 ， 3.9 mm×300 mm，流動相為乙腈(1. 5 mo

38、l/ L) 冰醋酸水溶液(3565) ，紫外檢測波長254 nm測定了芎芷香蘇散流浸膏中甘草苷的含量，結(jié)果表明，本方法操作簡便，被測成分分離完全，測定結(jié)果準確。馬德明等16用美國SP8810 高效液相色譜儀 SP8450 檢測器，ODS(4. 6 mm×150 mm) 色譜柱，流動相CH3CN NaH2PO4緩沖液(4070) ，檢測波長254 nm測定精致銀翹解毒片中甘草苷的含量，發(fā)現(xiàn)該方法具有良好的穩(wěn)定性，方法可靠。邵國良等17 采用美國Waters高效液相色譜儀(色譜柱C18 (5) 150mm ×5mm ，流動相:甲醇水36 %醋酸(68320. 5) ，檢測波長2

39、54nm) 測定克爾邁口服液中甘草苷的含量，實驗結(jié)果表明，結(jié)果穩(wěn)定，操作簡便，測定迅速。杜海燕等18采用日本島津LC - 6A 高效液相色譜系統(tǒng)ODS 分析柱(4. 6 mm×150 mm) ，流動相為0. 05 mol/ L KH2PO4 (pH= 2. 5) MeCN(2110) ，檢測波長254 nm測定牛黃清心丸中甘草苷含量，結(jié)果表明，該方法簡便，準確。朱蘭等19采用美國Waters 高效液相色譜儀(色譜柱:Bondapak C18 ，3. 9 mm ×300 mm;流動相為甲醇1. 5mol/L 冰醋酸水溶液(6832) ;檢測波長254 nm) 測定胃脘舒沖劑中

40、甘草苷的含量，其方法簡便、準確、重現(xiàn)性好。劉榮華等20采用高效液相色譜儀(U. S. A)Waters - 510 雙泵，U6K進樣器，996 (PDA) 檢測器(U.S.A) ，Millenni - um2010 V2. 0 色譜管理系統(tǒng)，色譜柱:Nova - Pa KC183. 9 mm×150 mm，401m。流動相為甲醇水(7030) ，用冰醋酸調(diào)至pH = 56 ，檢測波長254 nm測定炙甘草湯中甘草苷含量，為中藥的復方制劑研究提供了實驗依據(jù)。雖然高效液相色譜法是最常用的分析手段，有很多優(yōu)點，但目前仍需對其中一些重要內(nèi)容加以研究，如長期自動化操作后其可信程度的保護、自動獲

41、取數(shù)據(jù)系統(tǒng)的建立、評價和識別偶然干擾以及測定專屬性藥物時進行的條件優(yōu)化等。2 反相高效液相色譜法反相高效液相色譜是HPLC 中應用最廣泛的一個分支，其操作方便，穩(wěn)定性和重復性好，價格便宜。用作流動相的水以及能與水互溶的有機溶劑在價格和獲取方便的程度上都比正相色譜中的烴類溶劑有利。特別是化學鍵合固定相上樣品的不可逆吸附和溶劑的記憶效應小，使得極性組分以及在甲醇或乙腈中可溶解的非極性和弱極性組分在反相HPLC 體系中都能有很好的溶解度和分離效率，更為突出的是分析對象多樣化，靈活性大21 。近年來，反相HPLC 在甘草制劑質(zhì)量控制中的應用得到了迅速發(fā)展。朱維華等22應用Waters 高效液相色譜儀6

42、000A型高壓泵U6K進樣器，PSD - 1 型可調(diào)波長UV/ vis 檢測器，CR - 1B 微處理機。色譜柱YWGC1810m，不銹鋼柱(3. 9 mm ×250 mm) ，流動相為乙腈甲醇水(含有1. 05 %HAc) (501585) ，檢測波長248 nm分析了甘草苷含量很少的太陽神口服液，結(jié)果表明這種方法簡單、快速。王蘭霞23利用Sp - 8800 型高效液相色譜儀美國Spectra Physics) ，色譜柱為RP - 18 (220mm×4. 6 mm，5m，美國Spectra Physics) ，流動相為水乙腈醋酸(36372 ) ，流速1. 5 mL/

43、min ，檢測波長254 nm測定了五味沙棘口服液中甘草苷的含量，結(jié)果表明這種測定方法操作簡便、分析快速、重現(xiàn)性良好，可作為原料、中間體及制劑的質(zhì)量控制手段。汪國華等24采用美國Waters 液相色譜儀510 型恒流泵，996(PDA) 檢測器，U6K進樣品，Millennium2010V. 2.0 色譜管理系統(tǒng)，色譜條件:YWG - C18柱，200 mm ×4mm，10m，G(4) - ODS 保護柱;流動相:甲醇水0.2 %冰醋酸 (7030) ，pH = 5 ，流速1. 0 mL/ min ，檢測波長249 mm測定了復方炙甘草顆粒中甘草苷的含量，結(jié)果表明這種方法可消除樣品中

44、阿膠等其他中藥成分及輔料的干擾，操作簡便，結(jié)果準確，重現(xiàn)性好。楊義芳等25 應用日本W(wǎng)aters 公司的201 型液相色譜儀色譜柱YGWC18 (300 mm ×4 mm ，粒徑10m) ，流動相為甲醇1 %醋酸(6832) ，柱溫35 ，檢測波長254 nm測定了胖大海口含片中甘草苷的含量，表明本法靈敏、快速、準確、專屬性強、重現(xiàn)性好。馬鵬等26 用反相高效液相色譜法測定了各中成藥中甘草苷的含量。儀器為日本島津LC - 9A 高效液相色譜儀，包括SPD - 6AV 紫外可見檢測器，C - R4A 數(shù)據(jù)處理機，SCL - 6B 自動進樣品，CQ - 250 超聲振蕩器，分析柱為Shi

45、mpack CLC ODS(6. 0 mm×150 mm) ，流動相為甲醇水(6337) (含0. 005 mol/ L TBAH， pH= 6.5) ，檢測波長為254 nm。在該色譜條件下，作為甘草的確認峰，該峰尖銳，對稱，可進行定量測定。馬鵬等27用反相高效液相色譜法測定葛根芩連湯的甘草苷含量，結(jié)果滿意。儀器為日本島津LC - 9A 高效液相色譜儀，SPD - 6AV 紫外可見進樣器;C - R4A 數(shù)據(jù)處理機;色譜柱:Shimpack CLC ODS(6. 0 ×150 mm) ;流動相:甲醇水(6535) ，含0. 005 mol TBAH，磷酸調(diào)pH= 6. 5

46、 ，檢測波長254 nm。榮志芬等28采用RP -HPLC- UV 方法測定了復方止咳沖劑中甘草苷的含量，結(jié)果良好。儀器為Varian HPLC 系統(tǒng)，9010 泵，9050 - UV 檢測器;色譜柱C18 (3. 9 mm ×25 cm) ，流動相為CH3OH(0. 5 %HAc) H2O(0. 5 %HAc) = 25 :7 ，檢測波長254 nm。官曙光等29采用LC - 6A 高效液相色譜儀(日本島津) ，用反相高效液相色譜法測定桂甘膠囊中甘草苷的含量(以Resolve ODS 柱為分析柱，流動相為甲醇水醋酸(69310. 5) ，檢測波長254nm) ，方法簡便可靠，精密度

47、高。劉寶玲30應用島津LC - 6A 型高效液相色譜儀， Inertsil ODS - 25 柱(5m、4. 6 mm×250 mm) ，日本島津SPD - 6AUV 檢測器采用反相高效液相色譜法測定雙料參茸中甘草苷的含量，流動相為含有0. 005 mol/ L TBAH(四丁基銨) 水甲醇(3862) ，以磷酸調(diào)pH= 6. 0 ，檢測波長254 nm，在這樣的條件下，甘草苷得到較好的分離，方法重現(xiàn)性好。倪坤儀等31用反相高效液相色譜法測定了銀翹解毒片中有效成分甘草苷的含量，該法準確、可靠，重現(xiàn)性好。儀器為Waters 高效液相色譜儀，510 高壓泵，490 紫外可見波長檢測器，7

48、40 數(shù)據(jù)處理機。色譜柱:YQGC18 柱(3. 9 mm ×200 mm，5m) ，流動相為乙腈水(4951 ) ，甘草苷檢測波長248 nm。楊吉田等32用反相高效液相色譜法對止痛膠囊中甘草苷含量測定方法進行了研究，儀器為日本島津LC - 6A 型高效液相色譜儀，SPD - 6AV 可調(diào)波長檢測器，色譜柱為島津Shim- pack clc - ODS6 ×150 mm，流動相:甲醇水36 %醋酸溶液(65287) ，檢測波長:254 nm。實驗結(jié)果證明，本法測定止痛膠囊中甘草苷的含量，方法簡單、快速、容易，結(jié)果準確。王靜竹等33以甘草苷單銨鹽標準品為對照，應用反相高效液

49、相色譜法測定了甘草及其炮制品中甘草苷的含量，所用儀器為Waters 高效液相色譜儀，510 型泵，490E 型紫外檢測器，色譜柱為- Bondapak C18柱(3. 9 mm ×15cm) ，流動相為甲醇水醋酸(67267) ，檢測波長為256 nm。結(jié)果表明該方法準確度高，重現(xiàn)性好，操作快速、簡便。盡管反相高效液相色譜法有其優(yōu)點，但也存在著弊病，即分析時間長、試劑成本太高。此外，該技術(shù)的應用受到限制的最大原因是需要標準樣品才能定性。在實際使用中還需要考慮延長色譜柱的使用壽命問題。3 薄層掃描法薄層掃描法(TLC - Scanning method) ，是薄層色譜技術(shù)與光密度計和微

50、型電子計算機結(jié)合起來的一種新型儀器分析方法。應用薄層掃描儀可同時對各種復雜的樣品進行分離和測定，簡便快速、靈敏準確、專屬性好34 。袁珂等36 應用CS - 9301 薄層掃描儀(日本島津) ，采用薄層掃描法測定復方冬凌草含片中甘草苷的含量，操作簡便，不用顯色劑即可在紫外燈(254 nm) 下定位，色斑清晰，顯紫紅色斑點，實驗方法靈敏可靠。何桂霞等37 采用薄層掃描法測定開胃健脾膠囊中甘草苷的含量。展開劑正丁醇冰醋酸水(613) 上層液，測定波長為252 nm ，參比波長500 nm ，方法簡便、快速，可作為該制劑質(zhì)量控制標準。吳容軍等38 采用薄層掃描法測定術(shù)苓口服液中甘草苷的含量(日本島津

51、CS930 型薄層掃描儀，掃描條件測定波長252 nm ，散射參數(shù)SX =3 ，反射法鋸齒掃描) 。這種方法可靠，重現(xiàn)性好，被認為可作為該制劑內(nèi)在質(zhì)量的控制標準。王立新等39 ，采用薄層掃描法對十全大補丸中的活性成分甘草苷進行了測定，結(jié)果表明方法簡便，準確可靠。雖然薄層掃描法也是一種較好的分離方法，但影響薄層掃描結(jié)果的因素較多，而且分辨率不高，限制了它的應用。因此使用時要求應在保證供試品的斑點在一定濃度范圍內(nèi)呈線性的情況下，將供試品與對照品在同一塊薄層上展開后掃描，進行比較并計算定量，以減少誤差。各種供試品，只有得到分離度和重現(xiàn)性好的薄層色譜，才能獲得滿意的結(jié)果。此外，甘草苷的定量測定還可以采

52、用薄層比色法35 、雙波長薄層掃描法測定40 、小波變換二次微分示波計時電位法41 、離子抑制色譜法42，43 、極譜催化波法44，45 、氣相色譜法53 等。通過對以上幾種方法的比較，可以看出HPLC作為一種廣泛、有效的分離手段，在甘草有效成分分析中有很好的應用前景。它的微量，解決了甘草有效成分提取的困難。它的高效，使甘草復方中多種成分的同時分離成為可能，它的快捷提高了分析效率?？梢韵嘈牛琀PLC 作為一種強有力的分析技術(shù)，勢必在甘草有效成分分析中發(fā)揮更大的作用。甘草有效成分分析分離方法的著眼點應放在實用、易推廣和快速，而且操作要簡單，適用于常規(guī)分析和自動化操作上。因此，在分析方法的選擇上應

53、具有明顯的時代性，應盡快地采用新技術(shù)新方法。近年發(fā)展起來的熱分析法、X - 射線衍射法等得到了人們的廣泛關(guān)注，有待去努力開拓。為了適應和推動甘草有效成分測定的需要和發(fā)展，甘草有效成分的測定儀器還必須是具有高靈敏度(達原子級、分子級水平) 、快速、自動、簡便、經(jīng)濟的特性，并可以通過提高信噪比來提高甘草有效成分測定儀器的靈敏度。隨著現(xiàn)代分析化學的發(fā)展，甘草有效成分的測定儀器也需要向痕量與超痕量分析( ng/ g 至pg/ g 以及fg/ g 和ag/ g 甚至zg/ g) 的方向發(fā)展，這將推動甘草有效成分測定儀器的技術(shù)進步。21 世紀甘草有效成分測定技術(shù)發(fā)展的主流是應用先進的科學技術(shù)研究建立有效而實用的原位(in situ) 、在體( in vivo) 、實時( real line) 、在線(online) 和高靈敏度、高選擇性的新型動態(tài)分析測定方法，實現(xiàn)甘草有效成分測定分析儀器的微分析系統(tǒng)(- TAS) 化，并向微型化、智能化方向加速發(fā)展。希望隨著科學技術(shù)的發(fā)展，測定手段的完善，人們還能尋找出最簡便，靈敏度高，最可行的甘草苷定量測定方法。參考文獻1 傅克治. 中國甘草野生變家植. 哈爾濱:東北