目的基因獲得

1、第三章 目的基因獲取教學(xué)目的教學(xué)目的l 了解獲得了解獲得目的基因目的基因的一般方法。掌握基于的一般方法。掌握基于基因文庫分離基因的方法，核基因庫以及基因文庫分離基因的方法，核基因庫以及cDNA庫的構(gòu)建及篩選方法。庫的構(gòu)建及篩選方法。重點與難點重點與難點l基因組文庫及基因組文庫及cDNA庫的構(gòu)建庫的構(gòu)建lPCR方法篩選獲得目的基因方法篩選獲得目的基因目的基因目的基因 是所要研究或應(yīng)用（分離、改造、擴(kuò)增或表是所要研究或應(yīng)用（分離、改造、擴(kuò)增或表達(dá)）的基因，也就是將要克隆或表達(dá)的基因或基因達(dá)）的基因，也就是將要克隆或表達(dá)的基因或基因的一個片段的一個片段, ,相對宿主細(xì)胞稱外源基因。獲取目的相對宿主細(xì)

2、胞稱外源基因。獲取目的基因是分子克隆中最重要的一步?；蚴欠肿涌寺≈凶钪匾囊徊健Ｄ康幕蛑苽涞哪康哪康幕蛑苽涞哪康?1. 1. 克隆克隆特定的基因或特定的基因或cDNAcDNA； 2. 2. 構(gòu)建構(gòu)建克隆或表達(dá)克隆或表達(dá)載體載體； 3. 3. 構(gòu)建基因文庫構(gòu)建基因文庫，含：基因組，含：基因組DNADNA文庫和文庫和cDNAcDNA文庫。常用方法常用方法建立基因組建立基因組DNA文庫篩選目的基因文庫篩選目的基因構(gòu)建構(gòu)建cDNA文庫篩選目的基因文庫篩選目的基因化學(xué)合成化學(xué)合成聚合酶鏈反應(yīng)（聚合酶鏈反應(yīng)（PCR） 方法擴(kuò)增目的基因方法擴(kuò)增目的基因其他方法其他方法基因文庫基因文庫(gene lib

3、rary)概念概念基因文庫基因文庫(library)又稱又稱DNA文庫，是文庫，是指某個生物的指某個生物的基因組基因組DNA或或cDNA片段片段與與適當(dāng)?shù)倪m當(dāng)?shù)妮d體載體在體外重組后，轉(zhuǎn)化在體外重組后，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞宿主細(xì)胞，并通過一定的選擇機(jī)制篩選后得到大量的并通過一定的選擇機(jī)制篩選后得到大量的陽性菌落陽性菌落(或噬菌體或噬菌體)，所有菌落或噬菌體所有菌落或噬菌體的集合即為該生物的基因文庫的集合即為該生物的基因文庫。 基因文庫由基因文庫由外源外源DNA片段片段、載體載體和和宿主宿主組成。組成。（一）（一）基于基因文庫的分離基因方法基于基因文庫的分離基因方法 基因組基因組DNA文庫的類型文庫的類型

4、l根據(jù)根據(jù)所選用的載體可所選用的載體可以分為：以分為：l 質(zhì)粒文庫、噬菌體文庫、粘粒文庫、質(zhì)粒文庫、噬菌體文庫、粘粒文庫、人工染色體文庫（細(xì)菌人工染色體文庫、人工染色體文庫（細(xì)菌人工染色體文庫、酵母人工染色體文庫）。酵母人工染色體文庫）?；蚪M基因組DNA文庫的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)文庫的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)一個理想的基因組一個理想的基因組DNA文庫應(yīng)具備下列條件：文庫應(yīng)具備下列條件：1重組克隆的總數(shù)不宜過大，以減輕篩選工作的壓力重組克隆的總數(shù)不宜過大，以減輕篩選工作的壓力2載體的裝載量最好大于基因的長度，避免基因被分隔克隆載體的裝載量最好大于基因的長度，避免基因被分隔克隆3克隆與克隆之間必須存在足夠長度的重疊區(qū)域，以

5、利克隆克隆與克隆之間必須存在足夠長度的重疊區(qū)域，以利克隆排序排序4克隆片段易于從載體分子上完整卸下克隆片段易于從載體分子上完整卸下5重組克隆能穩(wěn)定保存、擴(kuò)增、篩選重組克隆能穩(wěn)定保存、擴(kuò)增、篩選 基因組文庫的發(fā)展基因組文庫的發(fā)展上世紀(jì)上世紀(jì)70-8070-80年代年代, ,研究一個基因到幾個基因研究一個基因到幾個基因質(zhì)粒載體、 噬菌體載體、黏粒載體等（小片段低容量的載體）9090年代后開始的一些生物的基因組測序研究構(gòu)建一年代后開始的一些生物的基因組測序研究構(gòu)建一些生物的染色體物理圖譜需要些生物的染色體物理圖譜需要現(xiàn)在發(fā)展起來的直接轉(zhuǎn)化植物的大片段文庫載體現(xiàn)在發(fā)展起來的直接轉(zhuǎn)化植物的大片段文庫載體

6、人工染色體文庫、亞基因組文庫（大片段低容量的載體）基因文庫構(gòu)建的基本程序基因文庫構(gòu)建的基本程序（）提取研究對象基因組（）提取研究對象基因組 DNA ，制備合適，制備合適大小的大小的 DNA 片段，或提取組織或器官的片段，或提取組織或器官的 mRNA 并反轉(zhuǎn)錄成并反轉(zhuǎn)錄成 cDNA ；（）（）DNA 片段或片段或 cDNA 與經(jīng)特殊處理的載與經(jīng)特殊處理的載體連接形成重組體連接形成重組 DNA ；（）重組（）重組 DNA 轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞或體外包裝后轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞或體外包裝后侵染受體菌；侵染受體菌；（）陽性重組菌落或噬菌斑的選擇。（）陽性重組菌落或噬菌斑的選擇?；蚪M基因組DNADNA文庫的構(gòu)建流程文庫

7、的構(gòu)建流程 載體的制備載體的制備高純度大分子量基因組高純度大分子量基因組DNADNA的提取的提取高純度大分子量基因組高純度大分子量基因組DNADNA部分酶切和電泳分級分離部分酶切和電泳分級分離外源外源DNADNA片段的連接轉(zhuǎn)化或包裝侵染片段的連接轉(zhuǎn)化或包裝侵染重組克隆的挑取和保存重組克隆的挑取和保存基因組DNA文庫限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶基因組DNA基因重組轉(zhuǎn)化細(xì)菌體外包裝3.1 3.1 載體的制備載體的制備 載體的好壞是影響連接成功與否的關(guān)鍵，載體的制備要載體的好壞是影響連接成功與否的關(guān)鍵，載體的制備要求兩點，一是純度高；二是去磷酸化好。求兩點，一是純度高；二是去磷酸化好。3.2 3.2 高

8、純度大分子量基因組高純度大分子量基因組DNADNA的提取和部分的提取和部分酶切酶切構(gòu)建構(gòu)建不同大小插入片段的基因組文庫對不同大小插入片段的基因組文庫對 DNA 質(zhì)量要求質(zhì)量要求不同，一般所提取的不同，一般所提取的 DNA 分子量至少應(yīng)該是文庫最終分子量至少應(yīng)該是文庫最終平均插入片段長度的平均插入片段長度的 35 倍。實踐表明，提取的基因倍。實踐表明，提取的基因組組 DNA 分子量越大，所得到的重組克隆的插入片段越大。分子量越大，所得到的重組克隆的插入片段越大。 3.33.3外源外源DNADNA片段的連接轉(zhuǎn)化或包裝侵片段的連接轉(zhuǎn)化或包裝侵染染 將一般在構(gòu)建大片段基因組將一般在構(gòu)建大片段基因組 D

9、NA 文庫時，大文庫時，大量量連接連接前都要先使用前都要先使用小體系連接來尋找最適的比例小體系連接來尋找最適的比例。在在電轉(zhuǎn)化和包裝侵染電轉(zhuǎn)化和包裝侵染過程中，首先最好選擇轉(zhuǎn)化效過程中，首先最好選擇轉(zhuǎn)化效率高的進(jìn)口率高的進(jìn)口感受態(tài)細(xì)胞或效價高且質(zhì)量穩(wěn)定的包裝感受態(tài)細(xì)胞或效價高且質(zhì)量穩(wěn)定的包裝蛋白蛋白，同時，研究表明對連接產(chǎn)物進(jìn)行脫鹽處理也，同時，研究表明對連接產(chǎn)物進(jìn)行脫鹽處理也可以明顯地提高其效率。另外，對于電轉(zhuǎn)化而言，可以明顯地提高其效率。另外，對于電轉(zhuǎn)化而言，選擇合適的轉(zhuǎn)化電壓對不同插入片段的選擇合適的轉(zhuǎn)化電壓對不同插入片段的 DNA 的轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)化效率也有所不同?；室灿兴煌?.4 3

10、.4 文庫的質(zhì)量檢測文庫的質(zhì)量檢測 在文庫的質(zhì)量檢測中，除了克隆子數(shù)目是可以在文庫的質(zhì)量檢測中，除了克隆子數(shù)目是可以確定的，其它值都是估算的。確定的，其它值都是估算的。文庫的平均插入文庫的平均插入片段長度片段長度是通過電泳檢測一定數(shù)目的重組子的是通過電泳檢測一定數(shù)目的重組子的插入片段大小所得平均值。一般要求植物的在插入片段大小所得平均值。一般要求植物的在 130kb 左右，而動物的在左右，而動物的在 150kb 左右。左右。 插入效率插入效率也是通過此法檢測的，表示有插入片也是通過此法檢測的，表示有插入片段的克隆在所有檢測的克隆中所占的比例。段的克隆在所有檢測的克隆中所占的比例。 基因組覆蓋度

11、基因組覆蓋度是指文庫中的克隆覆蓋基因組的是指文庫中的克隆覆蓋基因組的范圍，檢測時是通過選擇一定數(shù)目的已知的單范圍，檢測時是通過選擇一定數(shù)目的已知的單拷貝的基因作探針來篩選文庫?？截惖幕蜃魈结榿砗Y選文庫。原核生物基因組原核生物基因組DNADNA文庫的構(gòu)建文庫的構(gòu)建（一）原核生物基因組（一）原核生物基因組DNA的提取的提取 染色體染色體DNA 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA 要求：制備的要求：制備的DNA的長度為的長度為100-200kb，防止在，防止在制備過程中的機(jī)械斷裂制備過程中的機(jī)械斷裂（二）基因組（二）基因組DNA的不完全酶切的不完全酶切1、根據(jù)實驗需要選擇合適的限制性內(nèi)切酶、根據(jù)實驗需要選擇合適的限制

12、性內(nèi)切酶 a) 四個識別位點的限制酶出現(xiàn)的幾率四個識別位點的限制酶出現(xiàn)的幾率: 1/256 b) 六個識別位點的限制酶出現(xiàn)的幾率六個識別位點的限制酶出現(xiàn)的幾率: 1/10242、分離目的酶切片段大小的確定、分離目的酶切片段大小的確定 a) 克隆單個基因：克隆單個基因： 10 kb b) 克隆基因簇：克隆基因簇： 20kb3、DNA不完全酶切條件的確定不完全酶切條件的確定 a) 確定限制酶用量，改變酶切時間確定限制酶用量，改變酶切時間 b) 固定酶切時間，改變限制酶的用量固定酶切時間，改變限制酶的用量DNA的不完全酶切的不完全酶切（三）酶切片段與克隆載體連接（三）酶切片段與克隆載體連接、酶切片段

13、的分離與純化、酶切片段的分離與純化）低熔點瓊脂糖回收目的片段）低熔點瓊脂糖回收目的片段）試劑盒回收目的片段）試劑盒回收目的片段2、酶切片段與克隆載體連接克隆載體的選擇、酶切片段與克隆載體連接克隆載體的選擇 a）質(zhì)粒載體可承載）質(zhì)粒載體可承載15kb DNA左右片段左右片段 (有效的范有效的范圍為圍為10kb) b） 載體可承載載體可承載25kb DNA左右片段左右片段(有效的范圍為有效的范圍為15 kb) c）Cosmid 載體可承載載體可承載45kb DNA左右片段左右片段(有效有效的范圍為的范圍為1平頭末端直接與載體連接，但插入的片平頭末端直接與載體連接，但插入的片段無法回收段無法回收l2

14、2平頭兩端分別接同聚物尾，最好是平頭兩端分別接同聚物尾，最好是ATAT同同聚物尾，這樣重組分子可通過加熱局部變聚物尾，這樣重組分子可通過加熱局部變性和性和S1S1核酸酶處理回收插入片段核酸酶處理回收插入片段l33加裝人工接頭引入酶切口，以便插入片加裝人工接頭引入酶切口，以便插入片段回收段回收2 全長cDNA文庫基因組基因組DNADNA文庫文庫cDNAcDNA文庫文庫3 基因組DNA文庫與cDNA文庫的比較基因組基因組DNA文庫文庫c cDNA文庫文庫3.1 基因組DNA文庫的優(yōu)點相對于相對于cDNAcDNA文庫，基因組文庫的優(yōu)點：文庫，基因組文庫的優(yōu)點：lcDNA克隆只能反映著克隆只能反映著m

15、RNA的分子結(jié)構(gòu)，沒有包括基因組的的分子結(jié)構(gòu)，沒有包括基因組的間隔序列，間隔序列，l cDNA文庫中，不同克隆的分布狀態(tài)總是反映著文庫中，不同克隆的分布狀態(tài)總是反映著mRNA的分的分布狀態(tài)，即：高豐度布狀態(tài)，即：高豐度mRNA的的cDNA克隆，所占比例較高，分克隆，所占比例較高，分離基因容易；低豐度離基因容易；低豐度mRNA的的cDNA克隆，所占比例較低，分克隆，所占比例較低，分離基因困難；離基因困難；l 從從cDNA克隆中，不能克隆到基因組克隆中，不能克隆到基因組DNA 中的非轉(zhuǎn)錄區(qū)段序中的非轉(zhuǎn)錄區(qū)段序列，不能用于研究基因編碼區(qū)外側(cè)調(diào)控序列的結(jié)構(gòu)與功能。列，不能用于研究基因編碼區(qū)外側(cè)調(diào)控序列

16、的結(jié)構(gòu)與功能。3.2 3.2 cDNAcDNA文庫的主要優(yōu)點文庫的主要優(yōu)點cDNAcDNA文庫以文庫以mRNAmRNA為材料，特別適用于某些為材料，特別適用于某些RNARNA病毒等的病毒等的基因組結(jié)構(gòu)研究及有關(guān)基因的克隆分離?；蚪M結(jié)構(gòu)研究及有關(guān)基因的克隆分離。cDNAcDNA文庫的篩選比較簡單易行。文庫的篩選比較簡單易行。每一個每一個cDNAcDNA文庫都含有一種文庫都含有一種mRNAmRNA序列，這樣在目的基序列，這樣在目的基因的選擇中出現(xiàn)假陽性的概率就會比較低，因此陽性因的選擇中出現(xiàn)假陽性的概率就會比較低，因此陽性雜交信號一般都是有意義的，由此選擇出來的陽性克雜交信號一般都是有意義的，由

17、此選擇出來的陽性克隆將會含有目的基因。隆將會含有目的基因。cDNAcDNA文庫可用于在細(xì)菌中能進(jìn)行表達(dá)的基因的克隆，文庫可用于在細(xì)菌中能進(jìn)行表達(dá)的基因的克隆，直接應(yīng)用于基因工程操作。直接應(yīng)用于基因工程操作。cDNAcDNA克隆還可用于真核細(xì)胞克隆還可用于真核細(xì)胞mRNAmRNA的結(jié)構(gòu)和功能研究。的結(jié)構(gòu)和功能研究。3.3 cDNA3.3 cDNA克隆的主要的缺點克隆的主要的缺點lcDNAcDNA文庫所包含的文庫所包含的遺傳信息遺傳信息要遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于基因組要遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于基因組DNADNA文庫，并且受細(xì)胞來源或發(fā)育時期的影響。文庫，并且受細(xì)胞來源或發(fā)育時期的影響。lcDNAcDNA文庫雖能反映文庫雖能反映m

18、RNAmRNA的分子結(jié)構(gòu)和功能信息，的分子結(jié)構(gòu)和功能信息，但不能直接獲得基因但不能直接獲得基因內(nèi)含子序列內(nèi)含子序列和基因編碼區(qū)和基因編碼區(qū)外大量外大量調(diào)控序列的結(jié)構(gòu)與功能方面調(diào)控序列的結(jié)構(gòu)與功能方面信息。信息。l在在cDNAcDNA文庫中，文庫中，相應(yīng)于高豐度相應(yīng)于高豐度mRNAmRNA的的cDNAcDNA克隆克隆所占的比例比較高所占的比例比較高，分離起來比較容易，而相，分離起來比較容易，而相應(yīng)于低豐度應(yīng)于低豐度mRNAmRNA的的cDNAcDNA克隆所占的比例則比較克隆所占的比例則比較低，因此分離也就比較困難。低，因此分離也就比較困難。1 表型篩選法表型篩選法(1)抗藥性篩選:這是利用載體D

19、NA分子上的抗藥性選擇標(biāo)記進(jìn)行的篩選方法。4. 基因文庫的篩選與鑒定4.1基因文庫的篩選 (2)(2)插入失活篩選法插入失活篩選法 經(jīng)過上述抗藥性篩選獲得的大量轉(zhuǎn)化子中既包括需要的重組子，也含有不需要的非重組子。為了進(jìn)一步篩選出重組子，可利用質(zhì)粒載體的雙抗藥性進(jìn)行再次篩選。 抗藥性標(biāo)記選擇抗藥性標(biāo)記選擇( (插入失活法插入失活法) ) (3)(3)顯色反應(yīng)選擇法顯色反應(yīng)選擇法(-(-互補(bǔ)法互補(bǔ)法) ) 將含有將含有-半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（LacZLacZ）的）的調(diào)控序列和氨基端（調(diào)控序列和氨基端（N N端）端）146146個氨基酸編碼個氨基酸編碼序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至可編碼序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至

20、可編碼-半乳糖苷酶羧半乳糖苷酶羧基端（基端（C C端）部分序列的宿主細(xì)胞中，可使端）部分序列的宿主細(xì)胞中，可使各自無活性的片段實現(xiàn)互補(bǔ)，融為一體，產(chǎn)各自無活性的片段實現(xiàn)互補(bǔ)，融為一體，產(chǎn)生具有酶學(xué)活性的蛋白，從而使轉(zhuǎn)化的宿主生具有酶學(xué)活性的蛋白，從而使轉(zhuǎn)化的宿主菌在含有菌在含有IPTG/X-gal(IPTG/X-gal(異丙基異丙基-D-D-硫代半硫代半乳糖苷乳糖苷/5-/5-溴溴-4-4-氯氯-3-3-吲哚吲哚-D-D-硫代半乳硫代半乳糖苷糖苷) )的培養(yǎng)基上產(chǎn)生藍(lán)色菌落，這種現(xiàn)象的培養(yǎng)基上產(chǎn)生藍(lán)色菌落，這種現(xiàn)象就稱為就稱為-互補(bǔ)。互補(bǔ)。 互互補(bǔ)補(bǔ)的的檢檢測測或或- -半半乳乳糖糖苷苷酶酶法

21、法 4.2 PCR4.2 PCR篩選法篩選法 利用合適的引物，以從初選出來利用合適的引物，以從初選出來的陽性克隆中提出的質(zhì)粒為模板進(jìn)的陽性克隆中提出的質(zhì)粒為模板進(jìn)行行PCRPCR，通過對，通過對PCRPCR產(chǎn)物的電泳分析，產(chǎn)物的電泳分析，確定目的基因是否插入到載體中。確定目的基因是否插入到載體中。4.3 4.3 菌落原位雜交法菌落原位雜交法 （colony in situ hybridizationcolony in situ hybridization）將重組噬菌體將重組噬菌體(來自基因庫來自基因庫)感感染的宿主細(xì)菌細(xì)胞與少量培養(yǎng)染的宿主細(xì)菌細(xì)胞與少量培養(yǎng)基混合培養(yǎng)，噬菌體在宿主細(xì)基混合培養(yǎng)

22、，噬菌體在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制擴(kuò)增后形成噬菌斑。胞內(nèi)復(fù)制擴(kuò)增后形成噬菌斑。將培養(yǎng)皿中的噬菌斑轉(zhuǎn)到硝將培養(yǎng)皿中的噬菌斑轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜或尼龍膜上，變性，酸纖維素膜或尼龍膜上，變性，用標(biāo)記的探針與膜上的噬菌體用標(biāo)記的探針與膜上的噬菌體DNA雜交，雜交膜用雜交，雜交膜用X-光片放光片放射自顯影，檢測雜交信號。射自顯影，檢測雜交信號。與探針雜交的噬菌斑即為陽與探針雜交的噬菌斑即為陽性克隆。根據(jù)雜交信號的位置，性克隆。根據(jù)雜交信號的位置，找出培養(yǎng)皿中所對應(yīng)的噬菌斑，找出培養(yǎng)皿中所對應(yīng)的噬菌斑，培養(yǎng)，制備培養(yǎng)，制備DNA。 菌斑雜交法篩選菌斑雜交法篩選噬菌體核基因庫噬菌體核基因庫菌落雜交技術(shù)尋找目標(biāo)菌落雜交技術(shù)

23、尋找目標(biāo)DNA克隆克隆4.4 4.4 免疫篩選法免疫篩選法放射性抗體檢測法放射性抗體檢測法濾膜（固定抗體）濾膜（固定抗體）+免疫沉淀檢測法免疫沉淀檢測法菌落菌落沉淀素沉淀素（三）基于（三）基于PCR的基因克隆的基因克隆基于基于PCR的的DNA克隆與基于載體的克隆技克隆與基于載體的克隆技術(shù)相比具有一定優(yōu)越性。術(shù)相比具有一定優(yōu)越性。PCR反應(yīng)速度很快，可以在幾個小時內(nèi)反應(yīng)速度很快，可以在幾個小時內(nèi)完成，而載體克隆需要幾周時間。完成，而載體克隆需要幾周時間。PCR反應(yīng)非常靈敏，可以用來擴(kuò)增痕量反應(yīng)非常靈敏，可以用來擴(kuò)增痕量樣品的樣品的DNA。對于部分降解、甚至污染，用載體克隆對于部分降解、甚至污染，

24、用載體克隆無法進(jìn)行的無法進(jìn)行的DNA樣品，樣品，PCR擴(kuò)增仍可獲得擴(kuò)增仍可獲得目的基因克隆目的基因克隆同源克隆同源克隆原理：原理：l 以以DNA變性復(fù)制的某些特性為原理，以目變性復(fù)制的某些特性為原理，以目的的DNA片段為模板片段為模板, 利用酶促反應(yīng)（利用酶促反應(yīng)（Taq酶），在特定引物的引導(dǎo)下，將加入的酶），在特定引物的引導(dǎo)下，將加入的4種種dNTP由引物沿模板從由引物沿模板從53按堿基配對按堿基配對原則原則, 形成與模板形成與模板DNA互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈, 新合成的鏈又可作為下一輪循環(huán)的模板。新合成的鏈又可作為下一輪循環(huán)的模板。經(jīng)經(jīng)25-30個循環(huán)產(chǎn)物呈個循環(huán)產(chǎn)物呈 2n

25、指數(shù)擴(kuò)增，由指數(shù)擴(kuò)增，由pgg（紫外可見），可獲得基因片段（紫外可見），可獲得基因片段（1 1） 獲取已知基因獲取已知基因 據(jù)已發(fā)表的基因序列（或基因兩側(cè)序列已知）據(jù)已發(fā)表的基因序列（或基因兩側(cè)序列已知） 設(shè)計設(shè)計/ /合成一對引物合成一對引物 PCR PCR（基因組（基因組DNADNA為模為模板）板）/RT-PCR(mRNA/RT-PCR(mRNA為模板為模板) ) 從組織或細(xì)胞制從組織或細(xì)胞制備目的基因備目的基因（2 2） 構(gòu)建構(gòu)建RT/PCRRT/PCR文庫法獲取未知基因文庫法獲取未知基因 據(jù)據(jù)mRNAmRNA末端如末端如polyApolyA尾設(shè)計共同引物尾設(shè)計共同引物 將所用將所用mR

26、NAmRNA并逆轉(zhuǎn)錄成并逆轉(zhuǎn)錄成cDNAcDNA利用工具酶在利用工具酶在cDNAcDNA末端加尾末端加尾 采用一對共用引物擴(kuò)增所有采用一對共用引物擴(kuò)增所有cDNAcDNA，插入適當(dāng)，插入適當(dāng)載體載體 構(gòu)成構(gòu)成PCRcDNA文庫篩選文庫篩選（四）（四） 人工合成基因人工合成基因 根據(jù)已知的基因或氨基酸序列，將化學(xué)合成寡核根據(jù)已知的基因或氨基酸序列，將化學(xué)合成寡核苷酸的方法與酶促合成苷酸的方法與酶促合成DNA的方法結(jié)合起來，可以的方法結(jié)合起來，可以很快地人工合成基因。很快地人工合成基因。例如，首先化學(xué)合成多個含有例如，首先化學(xué)合成多個含有80-100個核苷酸的寡個核苷酸的寡核苷酸核苷酸，每個寡核苷

27、酸之間具有，每個寡核苷酸之間具有19-24個核苷酸的重個核苷酸的重疊序列疊序列，再將各個寡核苷酸等量混合，在，再將各個寡核苷酸等量混合，在DNA聚合聚合酶酶(或或Taq酶酶)作用下，各寡核苷酸又作為引物合成新作用下，各寡核苷酸又作為引物合成新鏈，使單鏈部分補(bǔ)齊成為雙鏈，再用兩個鏈，使單鏈部分補(bǔ)齊成為雙鏈，再用兩個PCR引物引物，經(jīng)，經(jīng)PCR擴(kuò)增出擴(kuò)增出DNA片段。若將兩個片段。若將兩個DNA片段放在片段放在一起，一起，經(jīng)經(jīng)SOE-PCR(sequence overlapped extension，SOE)擴(kuò)增出完整的基因片段。擴(kuò)增出完整的基因片段。計算機(jī)克隆計算機(jī)克隆 計算機(jī)克隆即利用計算機(jī)克

28、隆即利用GenBank信息，利信息，利用不同種屬同源性設(shè)計引物，嘗試獲取未用不同種屬同源性設(shè)計引物，嘗試獲取未知基因片段，這有賴于各種計算機(jī)軟件的知基因片段，這有賴于各種計算機(jī)軟件的應(yīng)用。應(yīng)用。(五五)限制酶切除限制酶切除 （1）從原核基因組）從原核基因組DNA制備視原核基因組物理圖譜已知或未知，制備視原核基因組物理圖譜已知或未知，克隆方法不同?？寺》椒ú煌?已知物理圖譜已知物理圖譜 得到相關(guān)基因圖譜得到相關(guān)基因圖譜 限制酶直接切除限制酶直接切除 未知物理圖譜未知物理圖譜 大小不同大小不同DNADNA片段混合物片段混合物插入載插入載 限制酶部分消化限制酶部分消化體體篩選陽性克隆篩選陽性克隆

29、注注部分消化控制酶量以及反應(yīng)時間，只能切斷部分消化控制酶量以及反應(yīng)時間，只能切斷DNADNA中部分位點（即部中部分位點（即部分消化）目的是為了得到大大小小的分消化）目的是為了得到大大小小的DNADNA片段，以免所需基因被切斷失片段，以免所需基因被切斷失活?；?。 不同的酶在不同的酶在DNADNA上識別切割順序不同，用同一種酶可能將所需上識別切割順序不同，用同一種酶可能將所需DNADNA片片段切斷失活，換上另一種酶就可能得到所需的完整基因片段。段切斷失活，換上另一種酶就可能得到所需的完整基因片段。（ 2 2 ） 從 真 核 基 因 組從 真 核 基 因 組 D N AD N A 制 備 染 色 體 步 移 法制 備 染 色 體 步 移 法（chromosome walkingchromosome walking）：）： 真核基